请教的近：5‘UTR和3’UTR的获得与因物设计

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-11 20:52 标签： 锐爪怎么获得
在5‘UTR及3’UTR设计上下游引物 扩增基因的全长(基因,上下游引物,引物) - PCR实验 - 生物秀
标题: 在5‘UTR及3’UTR设计上下游引物 扩增基因的全长(基因,上下游引物,引物)
摘要: [在5‘UTR及3’UTR设计上下游引物 扩增基因的全长(基因,上下游引物,引物)] 想在5‘UTR及3’UTR设计上下游引物
扩增基因的全长？
用PRIMER5 0怎么找不到引物，请哪位大侠帮助一下啊
我的基因是SIGMAR1
急呀！ 关键词:[基因 上下游引物 引物]……
想在5‘UTR及3’UTR设计上下游引物
扩增基因的全长？
用PRIMER5.0怎么找不到引物，请哪位大侠帮助一下啊
我的基因是SIGMAR1
回复Primer5这些一般只能通过计算进行寻找引物，而你现在是在确定的位点设计引物，一般不适合。假设你是获得了total RNA（其中包含这个基因的mRNA存在），想从这里面获得你需要的某个基因的全长基因，也就是CDS序列，你就需要包含ATG的5‘引物和TGA的3’引物，也就是位点是固定的。那么现在大多数的方法是直接以ATG开始和以TGA结尾，20-30个序列为引物即可，建议是21个开始，然后利用MAN或者Ologo7的分析功能分析出引物的参数，如果觉得不好的话，在用22等更多的，在20-30之间找到比较好的即可。设计好了之后如果需要加保护碱基和酶切位点，可以就近添加即可。以上也说明了对于全长序列的设计不需要按照像平常的进行基因检测时的随机设计引物的方案进行。其实这种直接在两端设计primer的方法也是大家经常用的，效果是蛮好的。用MAN试试，我们一般用这个设计出来的引物效果还不错，把引物序列输进去，然后它会给你分析有没有自连现象，也会出来退火温度和GC含量等，一般GC含量选用40%-60%，两条引物之间的退火温度不要相差太大，最好不要超过15度吧，长度的话，我一般都是先输入21个碱基，然后再根据分析的结果进行调整。回复给你一个秘方：我们有的时候设计引物是受到局限的，比如构建载体，只能从ATG开始，TGA结束；开发dCAPs标记时，一侧引物的位置是固定的，无法选择。遇到这种情况有两种非常有效的策略：1设计巢式。意思是在你想要扩增区域的外侧先设计一对引物，然后用其扩增的产物做模板，用你需要扩增区域的引物做二次PCR，搞定！！！ 2采用降落PCR。通过提高PCR扩增的特异性，增加产物的量的方法实现引物的高效扩增，同时可以减少摸索引物退火温度的过程。PRIMER5.0软件适合找到特别好的引物，当你有特殊需要的时候，它是搞不定的，所以需要你自己多“倒腾”，希望对你有用，顺利解决所遇到的问题！具体细节可以再沟通！回复给你一个秘方：我们有的时候设计引物是受到局限的，比如构建载体，只能从ATG开始，TGA结束；开发dCAPs标记时，一侧引物的位置是固定的，无法选择。遇到这种情况有两种非常有效的策略：1设计巢式。意思是在你想要扩增区域的外侧先设计一对引物，然后用其扩增的产物做模板，用你需要扩增区域的引物做二次PCR，搞定！！！ 2采用降落PCR。通过提高PCR扩增的特异性，增加产物的量的方法实现引物的高效扩增，同时可以减少摸索引物退火温度的过程。PRIMER5.0软件适合找到特别好的引物，当你有特殊需要的时候，它是搞不定的，所以需要你自己多“倒腾”，希望对你有用，顺利解决所遇到的问题！具体细节可以再沟通！我按照ATG开始，TGA结束设计的引物，上下游引物的GC%差别很大 我看了下 就算更改碱基个数也不能很好的减少差异 您说的第一种方法这样做有什么好处呢 我直接在5‘UTR（1-74bp）及3’UTR(747-1655)设计上下游引物 扩增出来的条带与您说的二次pcr的产物差别也不大 就是这样扩的话包括全部的CDS及部分的5‘UTR及3’UTRPrimer pair 1 Sequence (5"->3")Template strandLengthStartStopTmGC%Self complementaritySelf 3" complementarityForward primerCCGAGGCCGTGAGCGCAAAGPlus2032260.9970.004.002.00Reverse primerCCGCTCCTGTCCATCCGCAGMinus2078876959.5670.003.002.00Internal oligo Plus
Product length786Product Tm Product Tm - min(OLIGO Tm) Exon junction Total intron size 回复Primer5这些一般只能通过计算进行寻找引物，而你现在是在确定的位点设计引物，一般不适合。假设你是获得了total RNA（其中包含这个基因的mRNA存在），想从这里面获得你需要的某个基因的全长基因，也就是CDS序列，你就需要包含ATG的5‘引物和TGA的3’引物，也就是位点是固定的。那么现在大多数的方法是直接以ATG开始和以TGA结尾，20-30个序列为引物即可，建议是21个开始，然后利用DNAMAN或者Ologo7的分析功能分析出引物的参数，如果觉得不好的话，在用22等更多的，在20-30之间找到比较好的即可。设计好了之后如果需要加保护碱基和酶切位点，可以就近添加即可。以上也说明了对于全长序列的设计不需要按照像平常的进行基因检测时的随机设计引物的方案进行。其实这种直接在两端设计primer的方法也是大家经常用的，效果是蛮好的。用DNAMAN试试，我们一般用这个设计出来的引物效果还不错，把引物序列输进去，然后它会给你分析有没有自连现象，也会出来退火温度和GC含量等，一般GC含量选用40%-60%，两条引物之间的退火温度不要相差太大，最好不要超过15度吧，长度的话，我一般都是先输入21个碱基，然后再根据分析的结果进行调整。可不可以这样 不用一定要从以ATG开始和以TGA结尾吧 我是这样做的 在NCBI的设计引物部分 选择5’UTR及3’UTR两部分序列 设计好的引物扩增产物比全长cds区长120bp左右 但是特异性很好 我用你这种方法 找不到很合适的引物 GC%差别太大 真有15度了 3‘端互补现象也很多回复我按照ATG开始，TGA结束设计的引物，上下游引物的GC%差别很大 我看了下 就算更改碱基个数也不能很好的减少差异 您说的第一种方法这样做有什么好处呢 我直接在5‘UTR（1-74bp）及3’UTR(747-1655)设计上下游引物 扩增出来的条带与您说的二次pcr的产物差别也不大 就是这样扩的话包括全部的CDS及部分的5‘UTR及3’UTRPrimer pair 1 Sequence (5"->3")Template strandLengthStartStopTmGC%Self complementaritySelf 3" complementarityForward primerCCGAGGCCGTGAGCGCAAAGPlus2032260.9970.004.002.00Reverse primerCCGCTCCTGTCCATCCGCAGMinus2078876959.5670.003.002.00Internal oligo Plus
Product length786Product Tm Product Tm - min(OLIGO Tm) Exon junction Total intron size 既然你都拿到全长了还有啥问题？回复既然你都拿到全长了还有啥问题？这个全长不止包含cds区 这样也可以的哦？ 那就木问题了回复你们太看重软件给出的结果了，错配的几率没那么高的，问题只是循环数而已，一般35个循环，现在是比较随意的设计了两端的引物，分析一下觉得到处都是问题，实际上与非目的mRNA的结合能力更加低，而引物之间的结合基本不用考虑，跑胶的时候会远远跑在最前面（结合了，能扩增的片段也很短），很容易与目的的序列分离开来。但是你的担心还是有必要，逼近结合的几率低了，得到证物的产物比较难，但是可不是向上面几位大侠说了那样，这个仅仅是循环次数的问题，随着循环次数的增加，引物数量不变，但是扩增出来的目的序列会越来越多，在竞争机制下，随着循环次数越来越多，产物必然也越来越多。最好了解清楚PCR的原理。大家都说的可不一定是对的。
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SNP Analysis of 5′-UTR of Androgen Receptor Gene and Its Relationship with Semen Quality in Bulls牛AR基因5′UTR SNP分析及与精液品质关系
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采用PCR-SSCP方法对种公牛群体雄激素受体(AR)基因5′非翻译区(5′UTR)多态性进行检测.结果表明:AR基因5′UTR含有多态性位点;测序结果显示5′UTR的-1 575处存在T→G碱基突变;用最小二乘方法对该基因型与生产性状相关分析显示遗传多态性与精子密度性状呈显著相关,AA型显著高于AB型(P=0.025),对其他性状的影响差异不显著.试验为研究种公牛体内AR基因的生物学作用奠定了基础, 为肉用种公牛的早期选种选育提供了候选基因和分子标记.
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