& 一种基于ODYSSEY红外荧光染料的凝胶迁移滞后实验方法
一种基于ODYSSEY红外荧光染料的凝胶迁移滞后实验方法
摘 要：目的寻求一种新的凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）方法。方法利用先进的ODDSEY红外荧光成像系统，把探针进行了红外荧光的标记，
【题　名】一种基于ODYSSEY红外荧光染料的凝胶迁移滞后实验方法
【作　者】郝玉通 王虚步 杨学森 张伟 余争平
【机　构】第三军医大学军事预防医学院劳动卫生学教研室,重庆400038
【刊　名】《第三军医大学学报》 2009年第31卷第4期,368-369页
【关键词】EMSA 优化 红外
【文　摘】目的寻求一种新的凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）方法。方法利用先进的ODDSEY红外荧光成像系统，把探针进行了红外荧光的标记，优化了EMSA实验的程序以及时间过程。结果寻找到了一种更加精确安全有效的EMSA方法。结论基于红外荧光染料的凝胶迁移滞后实验安全，方便，效率高，是一种值得推广的新的实验方法。
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EMSA,优化,红外
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来源/作者：中国标准物质网　　日期：
凝胶阻滞实验早先用于研究原核基因表达调控蛋白的多平衡动力学，Strauss将实验方法加以修改，在结合反应中加人大肠杆菌的DNA片段，从而检测到粗提物中与DNA结合的蛋白质。Singh等在实验中改用化学合成的寡核昔酸替代DNA，用于蛋白结合位点的分析。现在，凝胶阻滞实验所使用DNA探针为人工合成的寡核昔酸，片段长度在20-200bp。如果寡核昔酸片段长度过大，将增加非特异结合，因此，若结合位点较明确，可将片段长度控制在20-30bp。另外，由于DNA结合蛋白位点一般需要6-8个碱基，所以，寡核苷酸探针也不宜过短。
DNA与蛋白质形成的复合物结合半衰期较短，而实验中需要较高电压（225 - 250V）电泳较长的时间（2h)。在实验中，由于各种因素的共同作用，可以使复合物保持稳定。其中选用缓冲液为0.5×TBE，为低离子强度，可以增加复合物的稳定性。聚丙烯酞胺凝胶可以提供一种限制性的特定环境，使复合物分解后不能扩散从而再度结合。
为了减少蛋白质与寡核昔酸探针的非特异结合，实验中一般加入1μ1 poly ( dI-dC) (20μl反应体系）可以明显减少非特异性结合反应。但如果使用过量，它又可以抑制寡核昔酸探针与蛋白质的特异性结合。poly ( dI-dC）作用是作为非特异竞争性抑制剂。非特异竞争性抑制剂应与探针的特异结合位点有较大差异，否则将影响特异结合。例如特异结合位点为GCGCGC序列，应避免实验中使用poly ( dG-dC)，而应改用其他竞争性抑制剂。若结合位点不能确定，则在预实验中选用多种竞争性抑制剂来进行。q精DNA也可以作为非特异竞争性抑制剂，降低探针-DNA的特异结合。
凝胶阻滞实验可通过与探针完全相同的非标记DNA片段来评价蛋白与DNA结合的特异性。非标记DNA片段与标记探针竞争与蛋白质的结合，随着非标记DNA片段浓度的增加，探针与蛋白结合减少，实验中通常添加的非标记DNA的浓度远远大于探针浓度（50-100倍），会使探针与蛋白质的特异结合带完全消失。实验中一般会设计一个阴性对照，即非标记DNA片段序列中不含有蛋白质特异结合位点，其浓度变化不影响探针与蛋白质带的变化，提示为特异结合反应。凝胶阻滞实验与免疫学相结合用于鉴定DNA结合蛋白质特异性的Super Gel Shift实验也使用较广，其基本原理为：蛋白质与其抗体结合后，再与探针结合，形成抗体-蛋白质- 探针复合物，由于三联复合物分子量大于蛋白质- 探针二联复合物，在聚丙烯凝胶中的区带更滞后，从而证明蛋白质结合带特异性。实验中由于抗体的加入，有时会影响蛋白质与探针的结合，一旦影响其与探针结合，在Super Gel Shift实验中不会出现区带更滞后，而是出现区带信号变弱，同样可以证明蛋白质结合带的特异性。
凝胶阻滞实验除可观察DNA与蛋白质形成的复合物，还可以检测与RNA特异结合的蛋白质，即RNA凝胶阻滞实验，但由于RNA易于降解，实验难度较大。凝胶阻滞实验中探针一般用32 P标记，现在随着技术进步，用荧光标记探针可使实验简化的同时，并缩短了实验周期。【关键词】凝胶电泳
迁移率变动生化实验教案-8
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&& 生化实验教案-8
生化实验教案-8
11:26:40 来源：长沙医学院 浏览：469次
长 沙 医 学 院 教 案
授课题目（章节或主题）
凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾
所属系（部）
基础医学院
所属教研室
生物化学与分子生物学
&年 月 日第 周 星期
&&&&&&& &&&&&&专业（本科□&&& 专科□）& &&&&&&级&&& &&班
理论课□&& 实验课 eq \o\ac(□,√)√&& 见习课□&& 习题课□&& 讨论课□&& 其它□
教材名称、作者、出版社及出版时间
生物化学与分子生物学实验教程 黄春霞、龙昱 北京大学医学出版社 2014
教学目的要求：
1.掌握凝胶层析的原理及应用
&&& 2.通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术
重点与难点：
重点：凝胶层析技术的原理以及操作、透析技术的原理；
难点：凝胶层析技术操作中装柱、加样
教学方法（请打√选择）：
讲授法 eq \o\ac(□,√)√ 讨论法□ 启发式□ 自学辅导法□ &练习法(习题或操作) eq \o\ac(□,√)√& 读书指导法□ &&&&&ＰＢＬ教学法 □ &C B L教学法□ 其他□
教学手段（请打√选择）：
板书 eq \o\ac(□,√)√ 实物 eq \o\ac(□,√)√ 标本□ &挂图□ &模型□ &投影□ &幻灯 eq \o\ac(□,√)√ 录像□ CAI（计算机辅助教学） eq \o\ac(□,√)√
教学过程设计和教学内容：
引入：回顾理论课学习的内容，什么是电泳？
一、实验目的
1.掌握凝胶层析的原理及应用
2.通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术
二、实验原理
本实验中，样品为血红蛋白与过量的高铁氰化钾（K3Fe(CN)6，Mw=327.25，黄色）反应生成高铁血红蛋白（MetHb，Mw=64500，红褐色）。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，因凝胶颗粒带有小孔，在混合样品随洗脱液往下渗的过程中，K3Fe(CN)6因颗粒直径小于凝胶颗粒网孔直径，会进入凝胶颗粒组成的静止相中，在柱内停留的时间长因而流速慢以至最后流出柱外；而MetHb颗粒直径大，不能进入凝胶颗粒，只能留在凝胶颗粒之间的流动相中，路程较短因而先流出层析柱，因此可将MetHb完全分离出来。
&&& 将凝胶过滤后收集的MetHb溶液装入透析袋。MetHb溶液中含有磷酸盐，经过透析使前者脱盐，而MetHb保留在透析袋内。用钼酸铵和氨基萘酚磺酸试剂进行磷的定性，用15%三氯醋酸的沉淀反应鉴定蛋白质。
三、实验仪器与试剂
层析柱、分液漏斗、铁架台、蝴蝶夹、止水夹、胶头滴管、透析袋（长10cm）、透析袋夹、磁力搅拌器
&&& 0.4% K3Fe(CN)6、氨基萘酚磺酸试剂、钼酸铵试剂、15%三氯醋酸 、0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）
四、实验操作
1．凝胶准备&
称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜。
取层析柱一支，加入缓冲液，快速挤压下方的橡胶管，使柱底砂芯玻璃下方的气泡全部排出，充满溶液。排尽气泡后，放出多余的缓冲液至砂芯玻璃上方留有1～2cm溶液时，立即用止水夹关闭出口。
将排好气泡的层析柱垂直固定于蝴蝶夹上，然后将平衡好的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内（用玻璃棒引流），再打开出口，使液体流出，凝胶颗粒缓慢沉积。继续不断地加入G-25悬浮液（每次补灌凝胶前应先用玻璃棒将已沉积的界面搅匀），至凝胶柱床沉积高度达到20cm左右时为止。凝胶沉积完成后，床面上应留下约2cm高的缓冲液，再关闭出口。
在分液漏斗中加入一定量的缓冲液，再将分液漏斗与层析柱相连，打开分液漏斗开关及层析柱出口，用磷酸缓冲液洗脱平衡约5～10min（注意流速不可过快，以免冲破胶面），最后关闭出口（胶面上方仍应保留约2cm高的缓冲液），加盖一层滤纸片。
5．样品的准备
取一支小试管，加入3滴血红蛋白液和8滴K3Fe(CN)6，混匀，制成MetHb的混合样品。
6．上样、洗脱
打开层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出胶面时即关闭出口。用胶头滴管吸取全部的混合样品，在距离胶面1mm处沿管内壁轻轻转动，缓慢加入样品，切勿冲破胶面。然后打开出口，使样品进入凝胶内，至胶面重新露出时立即关闭出口。用同样的方法再加入1-2倍样品量体积的缓冲液，打开出口让少量缓冲液流入胶面（此时样品应完全进入凝胶中）后立即关闭出口。再加入约3～4cm高的缓冲液（注意切勿扰动床面凝胶）后连接分液漏斗进行洗脱，流速约1滴/5s。
7．观察与收集
观察柱上的色带，待红褐色区带迁移至层析柱最下方时，将其收集至一小试管中。红褐色的MetHb色带收集完成后，继续用缓冲液将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱（不需用试管收集），然后关闭出口。
8．凝胶回收
回收凝胶时，将层析柱倒置，用洗耳球对准管口将凝胶吹出至原烧杯中，再用少量的缓冲液润洗管内残留的凝胶颗粒，同样回收至原烧杯内备用。
扎紧透析袋的一端，并放入盛有蒸馏水的烧杯内浸湿备用。透析前，用滴管吸取收集在小试管中的MetHb洗脱液约30滴装入袋内（注意勿使洗脱液流到袋的外表面），排空袋内空气，用透析袋夹夹紧袋的另一端。然后将装好样品的透析袋放入盛有蒸馏水的大烧杯中，放置于磁力搅拌器上，调至适当的速度，透析30min。注意在放入透析袋前，先按下列两表中的要求分别取出适量的杯内蒸馏水，各自加入干净试管中留作对照。
（1）磷酸盐的鉴定：按下表分别加入相应的试剂，混匀后观察和记录结果，并对实验现象作出解释。
透析前杯内蒸馏水
透析后杯内蒸馏水
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸试剂
（2）蛋白质的鉴定：分别加入相应的试剂，混匀后观察和记录结果，并对实验现象作出解释。
透析前杯内蒸馏水
透析后杯内蒸馏水
透析袋内溶液
15%三氯醋酸
五、学生操作
学生操作时注意观察和提示。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
六、实验总结
1. 装柱后要检查柱床是否均匀。若有气泡或界面分层时，需用玻璃棒伸入层析柱搅匀，使凝胶重新沉积，必要时需重新装柱。
2. 上样时一定要靠近凝胶表面，沿柱内壁缓缓加入，不能冲破凝胶柱表面，保持胶面平整。
3. 控制流速，不能太快或太慢，并且在洗脱过程中要防止凝胶柱中的缓冲液流干。
4. 洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃，回收的凝胶必须用缓冲液浸泡，不能干燥。
5. 透析时透析袋内液体不可装满，且要排尽气泡，否则透析时会将透析袋胀破。
教学方法和注意事项
（包括重点、难点、教学方法、教学手段、更新教学内容、教书育人等）
应用讲述法简介层析技术
应用多媒体、录像、板书讲解
重点：层析技术和透析技术的原理
配合多媒体、录像、板书简单讲述操作步骤
重点：装柱及其要求、加样、洗脱收集、透析
难点：装柱、加样
复习思考及作业题布置：
1.请解释凝胶过滤的分子筛作用是如何分离大小分子的？
2.在向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整，上样体积为什么不能太大？
3.请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或者太慢？
授课的创新点：
配备实验多媒体录像，直观表现。
参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等）：
1.长沙医学院生物化学与分子生物学实验指导
2.生物化学与分子生物学第八版教材
教研室意见：
&&& 教学重点突出，符合教学大纲要求。
教研室主任签章：&&&&&&&&&&&& 年　　月　　日
课后记（即通过收集教学督导专家、同行和学生的反馈信息，认真整理分析成功的经验和不足之处，在课程结束后填写）
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求助:凝胶滞后实验的原理和实验步骤
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各位大哥大姐,你们好!能给我讲解一下凝胶滞后实验的原理和实验步骤吗?越详细越好!谢谢!
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一般实验指导上都有呀！
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xjcao 各位大哥大姐,你们好!能给我讲解一下凝胶滞后实验的原理和实验步骤吗?越详细越好!谢谢!凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后（如下图所示）。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。
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电泳迁移率变更分析（EMSA） 1．细胞核蛋白提取：取约8.8×106个HSC-T6细胞，5ml PBS/Phosphatase Inhobitors冲洗，收集细胞。加入0.25 ml 1×Hypotonic buffer重悬，冰浴15min；加入25μl NP-40，震荡10s；14000×g离心，30s，4℃；收集上清即胞浆蛋白，于‐70℃保存。将沉淀重悬于50μl Lysis buffer（含DTT和Protease Inhibitor Cocktail）中，震荡10s；置于摇床中冰浴30min，150次/min；再次震荡30s，14000×g离心，10min，4℃；取上清即为核蛋白，于‐70℃保存，测定蛋白质浓度。2．寡核苷酸探针的标记和纯化: rat ：NF-κB：5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3′取寡核苷酸探针双链各5μl，稀释为100μl （终浓度10PM）；97℃加热15min，室温冷却，37℃孵育45min。配制如下反应体系：10×buffer 2μl2.5 mM dNTP(无d ATP) 3μl寡核苷酸DNA 1μl[α-32P]dATP 4μlddH2O 8.5μlKlenow Fragment 1.5μl (6U)37℃孵育60min。将标记的探针加入用STE预湿润的Sephodex-25 DNA纯化柱，加入TE 70μl，加压收集液体于EP管中。取1μl测放射性比活度。3．聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影：（1）配制8％聚丙烯酰胺凝胶10×TBE 5ml30 % 丙烯酰胺 10 ml10 % 过硫酸胺 0.6 mlTEMED 0μl ddH2O 35 ml电泳液为1×TBE（2） 配制反应混合液：0.2 M Tris?Cl 1μl1M NaCl 1μl10 mM EDTA 1μl10 mM DTT 1μl20 mM MgCl2 1μl2 ng/μl Poly dIdC 1μl25 % 甘油 3μl[α-32P]dATP 1μl (不低于5万μCi)取5μg核蛋白，加入反应混合液，ddH2O补足20μl总体积。冷探针：加入1μl 20 PM未标记探针。Supershift：加入NF-κB p65 抗体1μg，室温下孵育45min。8％聚丙烯酰胺凝胶预先电泳30min后上样，100V电泳约3h。小心取下胶，吸附在滤纸上，表面用保鲜膜覆盖。干胶仪干胶40min，暗盒中压3-4张胶片，‐70℃冰箱中放射自显影2-3天，冲洗胶片。
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--------------------------------------------------------------------------------1)什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。2)作这样的实验需要什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。Promega公司的Riboprobe?/sup系统（a,b）（目录号P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素标记的RNA的体外合成，DNA5`末端标记系统（目录号U2010）用于制备DNA探针，结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影，或用PhosphorImage?/sup分析。3)凝胶迁移实验系统提供了什么试剂？Promega公司提供一种凝胶迁移实验系统检测DNA结合蛋白，系统可作为这类实验的 一种正对照。系统包括目的寡核苷酸，对照DNA结合蛋白，结合缓冲液，用于寡核苷酸探针末端标记所需的试剂。Core 系统（目录号E3050）包括含重组AP2蛋白（AP2抽提液）的大肠杆菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。另外，Core系统还含SP1同源寡核苷酸，凝胶迁移结合缓冲液（5′），和能作20次对照实验的HeLa核抽提液。Complete系统（目录号E3300）含另外5个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1、CREB,、NF-kB、 TFIID结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针，或在竞争实验中用作非特异性探针。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。4)成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）。总之，反应总体积应最小（20ul）。为满足一般要求，结合缓冲液含4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油，0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作为优化实验的起始。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。5)提供了哪些同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？有各类dsDNA探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针，和这些引物序列的出处。转录调控因子探针---------------------------------------探针名 目录号 序列（上链） 序列的出处Sp1 E 5`-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3` SV40启动子（1）AP1 E 5`-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3` 胶原酶基因TRE（2）AP2 E 5`-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3`人金属硫堇II a(3)基因NF-kB E3291, E3292, 5`-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3`鼠Igk轻链基因（4）Oct1 E 5`-TGT CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3` Ig重链基因（5）CREB E 5`-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3`大鼠生长激素抑制基因（6）TFIID E 5`-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3`belta-1球蛋白启动子只列出了上链的序列，探针是双链，下链序列和上链序列配对。黑体字表明序列来源于指定的基因序列，转录调控因子结合的序列用下线表明。一般而言，周围的核苷酸是任意。6)在DNA探针的选择上，要考虑哪些重要因素？目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25bp）,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。7)用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时，每1个转录调节因子和它相关的DNA同源序列结合形成特征型的结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子，包括识别的同源序列，因子的大小，特定的结合条件，以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数目。1．AP1：AP1（激活蛋白1）是一个转录调节因子，它结合的同源序列为5`-TGAGTCA-3`。当基因的启动子区域存在AP1的结合位点时，这些基因可以被诱导，比如用佛波酯可诱导蛋白激酶C（2，7）。在细胞中，AP1形成c-Jun或Jun相关蛋白的同聚双体，或者形成c-Jun或Jun相关蛋白和c-Fos或Fos相关抗原（Fras）的异源双体。Fos蛋白自身不能形成同聚双体，并不能单独和AP1结合位点结合。c-Jun蛋白是一个40kDa的单体蛋白并通过亮氨酸拉链形成同聚双体。在HeLa细胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚双体。在凝胶迁移实验中，形成一个特异的复合物。当作凝胶迁移实验测定AP1的活力时，除了基本的溶液组分外，应将0.01mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT加入到结合缓冲液中。如用纯化的蛋白，则用1-2ug的蛋白来检测迁移复合物。2．AP2：AP2是一个转录调节因子，可分别作为TPA-和cAMP诱导因子（10）。它是一个52 kDa的蛋白，识别的同源序列为5`-CCCCAGGC-3`或5`-GC***GGC-3`（3）。这个因子对视黄酸特别敏感，可能在形态发生中起着重要作用。HeLa细胞核抽提物和AP2同源DNA探针形成一个特定的复合物。用纯化的蛋白作凝胶迁移实验时，应用20-50ng的蛋白。3．CREB：CREB是一个37 kDa的转录调节因子，对cAMP应答，识别5`-T（G/T）ACGTCA-3`DNA同源序列（6，11）。它含亮氨酸拉链结构而形成同聚双体，相关的基本结构域和c-JunDNA结合结构域同源。当用HeLa细胞核抽提物时，能和CREB同源序列形成一个复合物。4．NF-kB：NF-kB最初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，形成NF-kB和IkB的复合物。最初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65(RelA)和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49（也可称为p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75单体起反式激活作用。p50，p49（p52）单体具有DNA结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体，类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。IkB和p65单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体，能和DNA微弱地结合。Poly(dI:dC)能抑制这一反应（14）。p49和p50也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常，在作NF-kB的凝胶迁移实验时，在20ul的反应体积中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物，而需用10ug的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。在表达p49，p50，p65的细胞中，可检测到4个序列特异的凝胶迁移复合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65。下列试剂可加强NF-kB在体外的结合：mM的GTP，ATP，精胺，亚精胺，钡或钙离子，ng的Co+3(NH3)6（12）。5．OCT1：OCT1是OCT转录调节因子家簇中的一员，显然在哺乳细胞中存在比较广泛（5）。POU结构域包括POU-box和Homeo结构域。当用HeLa细胞核抽提物时，可检测到一个与OCT1同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。6．SP1：SP1是一个O-糖基化的转录调节因子，它识别10个核苷酸长度的同源序列5`-GGGGCGGGGC-3`（1）。核心识别序列是5`-GGGGCGGG-3`。同核心序列相似的序列常存在于启动子中。SV40的早期启动子就是一个例子，它是第一个可以结合SP1的启动子。根据糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA结合结构域中的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa细胞核抽提物与SP1同源探针形成特异的凝胶迁移复合物。7．TFIID/TFIIB：TFIID和TFIIB是基本的转录调节因子，参与RNA聚合酶II启动子的基本的转录（16）。TFIID与真核启动子的TATA区域形成特异的DNA结合。TFIID由几个蛋白组成，而其中的TATA区域结合蛋白（TBP），参与TATA序列的结合。TFIID的其他的蛋白组分被称为TBP-相关因子（TAFs）。用TFIID探针寡核苷酸和HeLa细胞核抽提物，可得到一个微弱的凝胶迁移带，但很难确定为是TFIID序列特异凝胶迁移复合物。纯化的重组的TBP很难作凝胶迁移实验，这部分是由于TBP存在很强的正电荷，导致TBP/DNA复合物很难进入凝胶。纯化的TBP形成二聚体后不能结合DNA（17）。因此形成的二聚体可参与DNA结合。TFIIB不单独与DNA结合，但与TFIID结合后增强它与DNA的结合。TFIIB与预启动复合物结合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF结合到转录启始区。故TFIIB在预启动复合物的形成中有重要作用。当用纯化的TFIID作凝胶迁移实验时，poly(dI-dC)不用加入结合反应中。结合缓冲液含10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。对TFIID的凝胶结合实验中，可加入poly（dG:dC）?dG:dC。形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，凝胶组分是：0.5′TBE, 6%聚丙烯酰胺凝胶(19:1丙烯酰胺:双叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 电泳缓冲液组分是：0.5′TBE，4mMMgCl2, 0.02%NP-40。当研究含TFIID和TFIIB的复合物时，应从结合缓冲液，凝胶，和电泳缓冲液中去除MgCl2。这些是一般的要求，用不同的细胞抽提物和TFIID、TFIIB形成复合物作凝胶迁移实验时，应对多种因素进行优化以达到理想的条件。8)在一次凝胶迁移实验中，用多少量的蛋白质或抽提物，和标记的DNA探针？对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化，一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白：DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白形成特异的复合物。所加入反应的探针的量是50，000-200，000cpm32P-标记的探针（高特异活性），反应体积为1-5ul。这相当于10-50fmoles的DNA探针。探针应保存在-20oC以防止降解，在合成或标记后1-2个星期内必需使用。无论探针或是结合蛋白应避免多次冻融。9)能用体外翻译法制备目的蛋白质吗？Promega没对所有的转录调节因子作这类测试。一般，用麦胚抽提物作哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白的体外翻译，兔网织红细胞溶裂解液可能含有内源哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白。但TNT？/sup&兔网织细胞溶解液系统（a,b,c,d）与TranscendTM 生物素标记的tRNA(目录号E3201)一同使用，翻译了转录调节因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸（目录号E3201）产生的迁移效果和重组的AP1相同（18）。TNT？/sup&T7偶联的麦胚抽提物（b,c,d,e）在体外翻译了c-Rel。这一蛋白特异地使免疫球蛋白k轻链增强子探针产生迁移。在c-Rel结合反应中加入体外翻译的MAD-3（IkB家簇中一员）可干扰其相互作用。10)poly(dI:dC)?dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)?dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针，非特异的竞争DNA ，长度组成和DNA探针相同，序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉，而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)?dI:dC)的量需作优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍（w/w）。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝胶迁移反应，它们会带有目的蛋白的结合位点。11)用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%（30：1丙烯酰胺：双叉），在特定条件下可用高或低的浓度。PH, 聚丙烯酰胺的浓度, 丙烯酰胺：双叉丙烯酰胺的比会影响复合物在凝胶中的迁移。大多数蛋白用10-15伏的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压（30-35伏的电压），电泳时所用的TBE和TAE必需是新配制的，无沉淀。低的离子强度和丙烯酰胺基质的`箱子效果`有助于复合物的稳定。也可将TGE缓冲液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。可在4oC进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。目前可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物（Metaphor?/sup/agarose）。12)如何在一个特定的复合物中确定一个蛋白质的存在？部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。多个复合物的存在表明蛋白降解，应在制备抽提液的溶液中和结合反应中加入蛋白酶抑制剂。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，但有一些方法作这方面的研究。如有目的蛋白的抗体，可进行超迁移实验，抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。增量的抗体加入到结合反应中。抗体可加入到蛋白和探针反应后，也可将抽提物与抗体结合后，再加入探针。取决于抗体的特定的抗原决定簇，前者有利于超迁移复合物地形成，后者阻止复合物的形成导致原复合物的强度的减少。在大多数实验中，应对抗体作滴定，先使抗体：蛋白的摩尔比为1：1，然后应需要增加抗体的量。当有纯化的蛋白时，可用它们和实验的带型迁移复合物比较。除超迁移实验外，复合物中蛋白的特征也可用UV交联和标记转移来分析。在均质标记的探针和细胞核抽提物保温后，用UV照射使复合物交联，随后用DNA酶降解未保护的探针。需用均质标记的探针，因DNA酶会从末端标记的探针中除去标记。和保护的几个核苷酸交联的蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离，干燥，放射自显影。结合蛋白的分子量可和标准分子参照物比较。也可用目的蛋白的抗体对复合物作Western印迹分析（20）。如一个蛋白和DNA探针的特定序列结合，可用含保守结合序列的竞争寡核苷酸，以及突变体来确定它的特征。也可用定点突变将保守序列结合位点改变来研究复合物的形成。
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