海蜇微卫星标记的开发及应用--《上海海洋大学》2014年硕士论文
海蜇微卫星标记的开发及应用
【摘要】：海蜇（Rhopilema esculenta Kishinouye1891）隶属于腔肠动物门、钵水母纲、海蜇属，是目前国际公认的品质最好、经济价值最高的可食用大型水母。海蜇营养结构独特，药用功效显著，深受国内外广大消费者亲睐。近年来作为大宗出口海产品，海蜇在我国出口创汇中也占有重要地位。作为传统捕捞对象，我国海蜇渔业历史悠久，20世纪七十年代，全国海蜇鲜品年捕捞量最高超过70万吨。然而，由于长期的过度捕捞和海洋环境恶化，近二十年来，海蜇自然资源急剧减少，面临枯竭的危险。据统计，到八十年代后期，全国海蜇渔业捕捞量已急剧降至10万吨左右，到2011年，全国海蜇总产量甚至不足1万吨，海蜇渔业的行业价值正逐渐丧失。引起海蜇资源枯竭的原因是多方面的，从DNA分子水平上了解海蜇种群的遗传变异水平，明确目前海蜇种质资源的状况，将为海蜇的种质资源保护、标记辅助育种、人工增养殖方案的制定以及遗传选育提供科学依据。
本论文包括以下研究内容：
（1）海蜇基因组微卫星分子标记的开发与群体分析：采用磁珠富集法，从海蜇基因组内筛选、设计并合成了52对引物，经海蜇群体（N=48）验证，筛选出15个具有遗传多态性的微卫星标记。15个位点共获得93个等位基因，范围在2-12之间，平均每个位点有6.2个等位基因。期望杂合度范围在0.5之间，平均值为0.3137；表观杂合度范围在0.0之间，平均值为0.3459；15个位点中有1对偏离了哈迪温伯格平衡定律（p0.0033）。此外，连锁不平衡测试未发现位点间存在连锁不平衡。
（2）海蜇转录组微卫星分子标记的开发与群体分析：从海蜇转录组文库中共挑选出83对引物，经海蜇群体（N=48）验证，最终开发出17个具有遗传多态性的微卫星标记。获得69个等位基因，范围在2-11之间，其中有15个位点等位基因数在2-6之间。期望杂合度范围在0.3之间，平均值为0.3568；表观杂合度范围在0.3之间，平均值为0.3346。通过计算平衡时P值，Bonferroni校正后发现其中有1个位点偏离了哈迪温伯格平衡定律（p0.0029）。经过连锁不平衡检测实验结果，发现有3对位点间有连锁不平衡。
（3）海蜇转录组微卫星分子标记的应用：
a）海蜇转录组微卫星分子标记跨属的可转移性应用：从海蜇转录组文库里挑选出127对序列引物，合成后在沙海蜇群体（N=48）中进行扩增。结果共开发出14个多态性位点，获得42个等位基因，范围在2-4之间，期望杂合度范围是0.5，平均值为0.3574；表观杂合度范围是0.2，平均值为0.5919；有2个偏离了哈迪温伯格平衡定律（P＜0.0036），有2对（RE5-RE11和RE5-RE49）位点间存在连锁不平衡。
b）海蜇转录组微卫星分子标记跨目的可转移性应用：从海蜇转录组文库里挑选出127对序列引物，合成后在海月水母群体（N=48）中进行扩增。结果共开发出35个多态性位点。包括4种重复类型，其中二核苷酸有10个，以(AT)n居多；三核苷酸有23个，以(CTT)n和(GTT)n最多；四核苷酸重复、复合核苷酸重复各为一个。扩增产物大小在139-279bp之间，退火温度在48-62之间。
C）海蜇转录组微卫星分子标记在沙海蜇不同地理群中的应用：将a）中自主开发的14个多态性位点，应用到山东半岛和长江口海域的两个沙海蜇野生群体中，结果表明位点均具有较好的多态性。平均观测等位基因数是4.21，平均有效等位基因数是2.03。观测杂合度范围平均值为0.2415；无偏期望杂合度平均值为0.8404。近交系数Fis平均值为0.2276。基因分化系数（Fst）值表明，两个位点属于高度遗传分化；两个位点属于中度分化；其余10个位点属于轻度遗传分化。基因分化系数平均值为0.1060，表明种群间遗传变异占总遗传变异的比例有10.60％。群体间遗传相似性系数（I）为0.8308，遗传距离（D）为0.1147。表明两个沙海蜇地理群间遗传差异程度很低，遗传相似度极高。
d）采用转录组454GS FLX测序和PCR技术，以海蜇和沙蜇的基因组DNA为模板，分别克隆了包含EST-SSR和EST-SNP标记的β-连环蛋白基因目的片段。生物信息学分析显示，β-连环蛋白基因目的片段长度分别为166/169bp和157/160bp，均没有内含子。海蜇β-连环蛋白基因目的片段除了微卫星重复差异外，只有一个碱基的差异；沙海蜇除了微卫星重复差异外，其余完全一致。在海蜇和沙海蜇β-连环蛋白基因目的片段的相同位置均包含微卫星重复，但其重复单元截然不同：海蜇为：(TGC)4-6(TGT)1-2(TGC)4-5，而海蜇为(TGT)5-6。同时两物种间还存在14个单核苷酸多态位点：(T/C)1,(T/C)2,(C/T)3,(C/T)4，(C/T)5，(T/G)6，(G/C)7，(T/G)8，(A/G)9，(C/T)10，(G/A)11，(A/G)12，(C/T)13，(A/T)14。
【关键词】：
【学位授予单位】：上海海洋大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：S917.4【目录】：
摘要5-7ABSTRACT7-13引言13-14第一章 绪论14-27 1.1 研究背景14-22
1.1.1 分子标记的发展与应用14-15
1.1.2 微卫星概述15-20
1.1.3 刺胞动物门研究进展20-22 1.2 钵水母纲三个物种的生物学特征及研究现状22-25
1.2.1 海蜇22-23
1.2.2 沙海蜇23-24
1.2.3 海月水母24-25 1.3 本研究的目的意义25-27第二章 海蜇微卫星标记的开发27-54 2.1 海蜇基因组微卫星标记的开发27-49
2.1.1 实验材料27-31
2.1.2 实验方法31-43
2.1.3 实验结果43-49
2.1.4 讨论49 2.2 海蜇转录组微卫星标记的开发49-54
2.2.1 实验材料49-50
2.2.2 实验方法50-51
2.2.3 实验结果51-53
2.2.4 讨论53-54第三章 海蜇转录组微卫星标记的应用54-77 3.1 微卫星标记的跨属可转移性研究54-58
3.1.1 实验材料54
3.1.2 实验方法54-55
3.1.3 实验结果55-58
3.1.4 讨论58 3.2 微卫星标记的跨目可转移性研究58-63
3.2.1 实验材料58
3.2.2 实验方法58-59
3.2.3 实验结果59-62
3.2.4 讨论62-63 3.3 沙海蜇不同地理群遗传分析63-69
3.3.1 实验材料63-64
3.3.2 实验方法64
3.3.3 实验结果64-68
3.3.4 讨论68-69
3.3.5 对研究水母灾害暴发的启示69 3.4 基于β-连环蛋白基因甄别海蜇和沙海蜇69-77
3.4.1 实验材料70
3.4.2 实验方法70-72
3.4.3 实验结果72-75
3.4.4 讨论75-77结论77-78参考文献78-90硕士期间参加课题及发表论文情况90-91致谢91
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京公网安备75号第一节　近交和近交系一、近交
实验动物的近交（Inbreeding）即近亲繁殖，是指血缘关系极为相近的个体之间或遗传组成极相似的个体之间进行的交配繁殖。是培育近交系动物的必须手段，通过近交使一个种群达到接近完全纯合程度，即所有同源染色体的相对位置都具有相同基因的状态。因此，通过同胞兄妹或亲子交配可以较快获得近交品系动物。
从同一祖先获得遗传物质，一条得自父，一条得自母，来源于共同祖先的小动物自交，它们得自父母同基因比非近交者多。近交和非近交繁殖时亲缘关系可见图3-1。
图3-1　近交和非近交时亲缘关系示意图
近交可以降低杂合性，可以将群体分离为不同的品系，然而近交的结果也必将出现近交衰退。
二、近交后引起的变化
（一）近交可以增多纯合性，也就是降低杂合性（Reduction　of　the　terozygosity）
自然界的动植物在遗传上一般都是杂合子体，故最初培育近交系动物都是取源于杂种，换句话说也就是取源于异型接合体动物。动物的遗传纯度取决于交配动物之间遗传关系的远近。因此近交系动物通过长期近亲交配而建立的。通过纯育后，动物的杂合性逐渐降低，因而纯度逐渐增高，使基因位点变为纯合子，使它们的表现型趋向一致性，如A与a基因频率相同，但基因型分配变化，经过一定代数的兄妹交配，则不再有杂合子，而获得遗传稳定的AA与aa近交品系，见表3-1。同胞兄妹或亲子交配连续20代以上就培育成近交系，为了保持该系的遗传特点，必须继续近交，并不得因突变或遗传漂移而丢失。
表3－1　近交引起的基因纯合情况
P（A）=0.5　p(a)=0.5
代数各　种　基　因　的　比　例纯合子（野鼠色）AA杂合子（野鼠色）Aa纯合子（黑色）aa原　始　种　群1/42/41/4兄妹交配下一代5/166/165/16兄妹交配下二代11/3210/3211/32兄妹交配下三代24/6416/6424/64兄妹交配20代以后50/100050/100
实验动物交配繁殖中的一些概念和符号。
1．纯合子：同源染色体的相对位点上具有两个相同的基因称为纯合子（Homozygote），如AA（显性纯合子），aa（隐性纯合子）。
2．杂合子：两个基因不相同时，即由一个显性基因和一隐性基因结合而成的杂合子交（Heterozygote），如Aa。
3．杂合子的a位点：即指a位点上两个位点为A/a。
4．纯合子的等位点：用A/A或a/a表示。
5．显性突变位点用D表示，隐性突变位点用r表示。
6．D和r位点在繁殖制度中被称作重要位点（Loci　of　interest），因为它们是控制位点分离的。
7．D位点上的等位基因为A/D，r位点上的等位基因为A/r。
8．以在一个位点上的等位基因A/A、a/A、a/a三种基因型进行组合将产生九种交配形式，可归纳为以下四类交配系统。
（1）纯合子交配（Incrosses）：为亲代相同的显性纯合子交配，如A/A×A/A和a/a×a/a。
亲代：♂ＡＡ×♀ＡＡ　子代：基因型AA，表现型A。
（2）杂交（Crosses）:为亲代不相同的纯合子交配，如A/A×a/a和a/a×A/A。
亲代：♂ＡＡ×♀aa　子代：基因型Ａa　，表现型A。
卵子ＡAaＡaAaaAaAa
（3）回交（Backcrosses）：为亲代显性纯合子与杂合子交配。如A/A×a/A；a/A×A/A；a/A×a/a和a/a×a/A
亲代：♂Ａa×♀Aa　子代：基因型：1AA，1Aa　表现型：A，均为显性野鼠色。
卵子ＡaＡＡＡAaＡＡＡAa
（4）自交或称互交（Intercrosses）：亲代为两个杂合子交配：如a/A×a/A。
亲代：♂Ａa×♀Aa　子代：基因型：1/4AA，2/4Aa,1/4aa。表现型：3/4A，1/4a。
卵子ＡaＡＡＡAaＡaＡaAa
C57BL黑色a，C3H野鼠色，二者皆为纯合子。二者杂交：
种系中纯合性的程度通常以近交系数（F）表示，所谓近交系（Coefficient　of　inbreeding）也就是一个种系的个体中，两个等位基因具有相同来源的概率，通常以0～1之间的尺度来表示。F=0为完全杂合，F=1表示完全纯合。F值随近交繁殖连续的代数而递增。增加的比率决定于交配动物亲缘关系的密切程度。根据Feiconer（1960）的研究，认为全同兄弟姐妹交配，近交系前几代数值不恒定，如前四代近交系数上升率分别为28%、17%、20%和19%，以后每代上升率就恒定为19.1％。故Felconer提出一个便于计算的公式：Fn=1-(1-△F)n。n表示近交代数，△F是每进一代的近交系数上升率。例如繁殖了10代，△F为19%，代入公式，则
F10=1-（1-0.19）10=1-(0.81)10=1-0.4=87.84%
也就是说繁殖到第10代时，纯度可达到87.84%，还有12.16%是杂合的。由于交配方式不同，其△F也各不相同，同胞兄妹交配△F为19.1%，同父异母交配11.0%，回交（亲子交配）19.1%，堂兄妹交配为8%。全同胞兄妹或亲子交配前20代的近交系数计算状况可见表3-2。
表3－2　Felconer近亲系数表
代　数F代　数F10.250110.90820.375120.92630.500130.94040.594140.95150.672150.96160.734160.96870.785170.97480.826180.97990.859190.983100.886200.986
注：近交系不改变频率。
（二）近交可将群体分离为不同基因型的品系（Splitting　of　the　Population　into　Lines　of　Different　Gentypes）
原始种群经过近交分为若干近交系，在不同等位基因的不同位点上变为纯合子。原始种群的小鼠兄妹交配连续20代之后分离出两支等位基因A和a的近交品系：
1．等位基因A的品系：只生产野鼠色后代。
2．等位基因a的品系：只生产黑色后代。
近交品系动物的获得，可使原来杂合子的动物增加纯合性（Homozygosity），从而提高基因型的稳定性，获得想要的品系，实验者可以从动物的特定性状中进行选择。
（三）近交可引起近交衰退（Inbreeding　Depression）
亲缘接近的交配所产生的后代常常会出现生长、成活、生育、抗病、适应环境等能力的减退，这种现象称之为近交衰退，如何克服和解决这个问题，是培育近交系动物的关键所在。由于近交衰退的缘故，从一个供繁殖的种群培育和建立一个近交系时，往往需要从杂交群或几个近交系开始才能成功，而且的近交几代后，有些系可以因生育或生活率低而断绝；留下的受近交衰退影响较小的后代有些可以维持下来，而另外的也可能最后被淘汰。也由于同样的原因，过去建立的某些近交系，现在只有某些亚系还仍然存在，有些不能全部存活，甚至难以维持。
近交衰退发生的原因是多方面的，从遗传学的角度解释主要有两点：
1．有害的隐性基因的暴露。一般病态的突变基因绝大多数都是隐性的，所以处于杂合状态时是不表现出病态或不利的性状。这些有害基因的作用可被显性的杂合子等位基因所掩盖，但经过一段近亲繁殖，纯合的基因（纯合子）比例渐渐增多，于是有害的隐性基因相遇成为纯合子而显出作用，出现了不利的性状，对个体的生长发育、生活和生育等产生明显的不利影响。例如杂种动物所带有的不育的隐性基因往往被其显性的等位基因所掩盖，而不表达其不育的性状，但由于纯育，动物的纯合性逐渐增高，不育的现象也就表现出来了。
2．多基因平衡的破坏。个体的发育受多个基因共同作用的影响，虽然其中每个基因的作用效应微小。对环境适应较好的野生或杂交动物，由于自然选择的作用有利于保存那些生物适应能力较强的基因组合具有平衡的多基因系统，近交繁殖往往会破坏这个平衡，造成个体发育的不稳定。
近交衰退往往在近交培养过程中的最初若干世代中表现出来，以后经过一定的人工选择，带有纯合有害基因的动物被逐渐淘汰，或者由于无意识地保留了一小部分的杂合性，经过5～10代左右的培育繁殖，后代中生育与生活力可以逐渐稳定，不再下降。
由于近交系动物是采用近亲繁殖方式，因此容易引起生活力的降低、生长繁殖力退化、抗病力降低等近交衰退变化，为了防止这些问题产生，应注意如下几点：
1．为防止种群传代终断，可采用回交方式（即父×女或母×子）而不计算近交代数，这样可以维持种群不致在繁殖中终断。
2．饲料营养的保证很重要，在一般传代至5～7代时会出现生命力下降，生长繁殖退化，或出现产仔畸形等情况，因此应在饲料中适当增加营养成分以保证子代生长发育正常。
3．在传代中注意检查子代的情况选优去劣，选择体质健康、生殖力旺盛的后代而不能选择体弱繁殖力差的动物。
4．近交到6～7代时，可出现致死的有害基因，而且这种致死基因随近交代数增加而不断升高，可引起个体死亡，为此，培育近交品系，开始不必用同窝兄妹交配，用同父异母，或同母异父的兄妹交配，如待近交品系建立后再改变致死基因则很困难。
一、近交系的特征
（一）基因纯合性。通过持续20代以上的近亲繁殖，基因已高度纯合化。纯合子的纯度在理论上接近最高点，基因已有98.6%以上完全纯合，仅有1%左右不纯合，因此近交品系动物的基因是一致的，遗传组成亦相同。在一个近交品系内所有动物的各个基因位点都应该是纯合子，这样的个体与该品系中任何一个动物交配所产生的后代也应该是纯合子，在这些动物中没有暗藏的隐性基因。
（二）遗传稳定性。由于近亲繁殖增加了在特定部位纯合子互相配合的可能性，因而减少了遗传变异，基因型可长期处于稳定状态，这种相对稳定性来自纯合性。因为基因高度纯合，所以纯合子基因可以极稳定地传给后代。如DBA系已维持好60多年，C57BL系已维持了50多年，但至今仍与原品系极相似。当然近交系动物有时会因突变造成基因改变而发生变异，是为例外。因此，近交系动物在遗传上是相当稳定的，遗传上的变异仅发生在少量残留杂合基因或基因突变上，而这种机率非常低。如果品系在被确认为近交系后坚持近交，同时辅以遗传监测，有时地发现和清除遗传变异的动物，保持近交系动物遗传稳定性是绝对没有问题的。
（三）同基因性。基因型或称遗传型是一切遗传基础的总和，是内在的遗传本质。同基因性，是指一个近交品系中所有个体在遗传上是同源的。由于基因高度纯合和基因型相当稳定，而致个体间极为相似，即同一品系内具有基本相同的遗传组成和基因点，也就是基因型相同。这种遗传上的均质性可采用组织移植方法来检测，也可用一只动物检测群体的基因型；从子代群体中检定母系群体。
（四）表现型的均一性。表现型是基因在环境因素作用下表现出来的、可被直接观察到的亲代的性状。在相同环境因素的作用下，由于遗传是均质的，所以其表现型是均一的，反应性是一致的。近交品系动物的性状如肿瘤发病率、形态学特点、血型和组织型、对药物的反应、甚至行为的类型等都可高度遗传，均衡一致远比远交系为强，因此可用较少量的近交品系动物，达到统计需要的精密度。
（五）个体性。由于不同品系都具有不同的遗传组成和生物学特性，所以不同品系各有不同的特性。目前国际上公认的250个近交品系小鼠间，均各有明显的区别，有其不同的反应性和敏感性，如自家免疫病鼠、白内障鼠、脑积水鼠、多尿症鼠、缺乏免疫球蛋白M鼠、对胰岛素敏感鼠等等。因此，选择近交品系鼠时，必须注意其是否适合各项研究设计的需要，决不能认为近交系动物遗传均一、基因型相同、反应性一致，就随便选一个品系来做实验。
个体性从整个近交系动物来看，每个品系在遗传上都是独特的，这表明在相当广泛的特性上，有些品系可能自发一些疾病，成为研究人类疾病理想的模型。在某些情况下，品系间的送别显示在量上，而不是在质上，而这一点在研究上也非常有用。因为以此可在很多的近交系中筛选出对某些因子敏感和非敏感的品系以达到不同的试验目的。
（六）分布的广泛性。许多近交系在国际上广泛分布，从而有可能在世界各国之间进行比较研究。这在理论上意味着不同地区、不同国家的科学家有可能去重复或验证已取得的理论和数据。但因环境变化可引起遗传变异，因此，环境条件应力求尽可能一致。如同一近交品系的两只动物，一只吃完善的饲料，另一只吃营养不足的饲料，则二者可发生不同的变化。
（七）资料可查性。近交品系的一个最有价值的特点是最常用的品系都具有相当数量的背景资料，由于近交品系动物在培育和保种的过程中都有详细的记录，加之这些动物分布广泛，经常使用，目前已有相当数量的文献记载着各个品系的生物学特征，这些有关品系的特征、寿命和自发性疾病等资料，对研究工作选择品系是极为重要的，而且这些基本数据对于设计新的实验和解释所得结果提供了便利条件。
（八）可分辨性。每个近交品系都具有自己独特的生化标志基因等特点，研究工作者可定期进行检测，以识别所使用的近交品系动物是否可靠。方法有：生化位点法、皮肤移植法、毛色基因法和下颌骨测量法。由于绝大多数近交品系在很多遗传位点上已有了分型，如果掌握了这些方法，可以根据这些位点的分型轻而易举的将混合在一起的两个外貌近似的品系分辨出来。
二、使用近交系的优点
使用实验动物进行各项科学研究的一个关键问题，就是怎样使动物实验的结果正确、可靠、有规律性、重复性好，从而精确判定实验结果、得出正确的结论。使用一般普通饲养的实验动物是采用任意交配的繁殖方法，所产生的动物个体差异较大，所以必然影响实验结果的均一性，有时难以判定实验结果。选用近交系动物作实验就能克服这些缺点，满足实验研究的需要。采用纯系动物作实验，具有下列主要优点：
1．具有相同的基因型，表现型也一致，所以其反应是一致的，实验结果正确、可靠。由于连续近交繁殖，同一近交系的各个体具有相同的基因型，在相同的环境条件下又具有相同的表现型，故其性状即其各种生物学特性比较一致，对外来刺激反应也一致。
2．各品系均有其独特的特性，根据实验目的可选用不同品系来作实验，实验重复性好，所用动物少，实验周期短，节省人力、物力和时间。
3．国际上分布广泛，不同国家的科研单位由于使用同一近交系动物所取得的结果是相似的，便于国内和国际间学术交流和实验重复。
4．可以作为有价值的病理学模型，如有致癌品系、抗癌品系、致白血病品系，嗜酒性品系、易抽搐品系等，是研究人类疾病的重要实验材料。
5．它是标准的实验材料，动物生长发育到一定时间就有一定的规格。
6．有大量的历史资料可查，每个品系均有其详细的遗传学资料，遗传背景明确，其生物学特性、生理生化特点、常见疾病（包括自发性疾病）等都有过系统的研究，便于研究者查阅和选择应用。
三、近交系动物在生物医学研究中的应用
近交系动物首先应用于遗传学研究，以后又为肿瘤和免疫学家所重视。在肿瘤的研究工作中应用最广泛，培育的品系也最多，对肿瘤的病因学、发病学、实验治疗和新抗癌药物的研究等都发挥了重要作用。所以近交系动物的建立已受到世界各国医学科学研究工作者的重视。正如化学家需要分析纯的化学药品、物理学家需要高度精密的仪器一样，近交系动物对医学研究是至关重要的。伦敦大学古勃宁说：“……生物学中近交的应用和化学中应用分析平秤的意义一样重要。”波尔法氏说“……癌的免疫治疗的最好途径的发展与1952年开始和发展起来的近交系动物是有关的”。
随着医学科学研究的飞速发展，近交系动物的培育及应用愈来愈被人们所重视，为适合不同课题研究需要而培育的近交系动物品系也愈来愈多，在医学、生物学、药物学等各个领域内的应用也日益广泛。生物制品、药品、食品等产品检定，疾病诊断、生理、病理、肿瘤、免疫、内分泌等学科的研究工作中都需要使用近交系动物进行各种实验。
近交系小鼠目前在国内许多科研单位已得到重视和应用。尤其在遗传、肿瘤、免疫、放射、白血病等研究中应用较多，其中在肿瘤、白血病研究中的应用更多，可以挑选致癌系小鼠进行致癌，可以在同一时间内获得许多生长同肿瘤的动物，然后进行各种种瘤的理论和防治研究。
在生物医学实验研究中应用最广泛的是近交系小鼠，它可以根据各种特殊实验的需要培育各种品系，如致癌鼠、抗癌鼠、糖尿病鼠、白血病鼠、先天性肌肉萎缩症鼠等。近交系小鼠应用也较多，近交系的金黄地鼠、豚鼠以及兔狗等也有应用。1975年出版的第三版《国际实验动物索引》中公布的的交系动物品系数，小鼠388系，大鼠130系，豚鼠8系，家兔2系，黑线仓鼠2系、金黄地鼠38系。现在世界上已经有纯品系小鼠500多个品系，大鼠包括亚系在内约200多个，豚鼠12个，家兔6个。
从1952年以来，国际近交系小鼠标准命名委员会（Committee　on　Stanardized　Nomenclature　for　Mice）对承认的近交系小鼠进行命名，每隔4年在美国肿瘤研究杂志上公布一次，先后于、、、年共公布过八次。第一次1952年公布了124个品系，第五次1972年已发展到244个品系，1976年为252年品系，1980年为250个品系，1984年为250个品系，我国培育的615、津白Ⅰ和津白Ⅱ小鼠也得到承认并被列入。
近交系动物的广泛应用，极大地提高了实验结果的正确性和重复性。以近交系小鼠为例，目前已广泛应用于的肿瘤研究课题（见表8-1），也广泛应用于基础和临床医学的各类实验研究（见表8-2）。
杂交瘤（Hybnridoma）合成单克隆抗体（Monoclonal　antibodies）是近年来生物医学中一项重大的突破，将对人类肿瘤的治疗，传染病的防治和诊断及免疫机制的研究等方面产生巨大的影响和变革。这项新技术选用的主要实验材料就是BALB/C近交系小鼠，单克隆抗体研究就是从BALB/C小鼠骨髓瘤开始的，近几年来单克隆抗体的研究，又有了新的发展。双特异性单克隆抗体（bsMCA）的研究，是英国剑桥大学分子生物学实验室Milstein博士正在进行的研究（Milstein是单克隆抗体技术创始人之一），这在国际上刚开始，国内尚未展开此项研究。制备又特异性单克隆抗体就必须要用Lou株近交系大鼠，因为Lou株近交系大鼠制备单克隆抗体时，其腹水量比用BALB/C小鼠大几十倍，能较好地解决单克隆抗体的大量制备。双特异性单克隆抗体技术和杂交～杂瘤技术是单克隆抗体技术的新进展，bsMCA可代替交联剂和酶标技术，在免疫组化和免疫测定技术上有广泛应用，在癌症的导向治疗和体外免疫扫描诊断上也有广阔的应用前景。
一、培育目标
培育目标分定向、不定向两种，定向是予先确定好要获得什么样的品种，然后有计划地进行培育，这种方法能在较短的时间里获得优良的品种。定向时有以细菌感受性为选育指标，如小鼠对沙门氏菌的感受性；也有采用遗传指标，如性成熟、初产日令、妊娠间隔、产仔数、哺乳量及离乳时体重等。不定向的是无意识的选择，预先交没有想要培育具有哪些特点的新品种，只是人们自然把比较有价值的留下，让它繁殖，去掉价值不大的品种，这样无意中起了选择的作用，这种选择过程是比较缓慢的，待纯化后回过头来做实验，测定其特性。
二、种鼠的选择
（一）基础种群的选择
1．从野生鼠中选择。可能具有实验小鼠所没有的未知遗传特性，但由于野生鼠需要经过一段驯化时期，有时人工繁殖有困难，所有这种情况应加以考虑。
2．从起源于没有经过的新繁殖的近交群中选择。由于其个体之间存在着某种程度的遗传变异近亲繁殖和选择，把可能获得并需要的特性固定下来。
3．从杂交群中选择。这种杂交群包括，近交系与近交系之间；近交系与远交系之间；远交系与远交系之间；野生鼠与远交群之间的各种类型的杂交。尤其是“三元”即三个不同品系之间，“四元”即四个品系之间的杂交，有可能通过交配而形成多种的基因组合，从中选出具有一定特性的鼠种作为基础群。
4．如果其它实验室和保种单位有质量较好基础种群种子，并有相应的检测数据证实其确为好种子，也可直接引起，这样较为简便易行。但引进时必须了解和掌握必要的资料，如家谱号（Pedigreed　No.）及其历史来源、交配方式、近交代数、遗传组成、生物学特性等。
（二）初代种鼠的选择
在选好基础　种鼠以后，进一步选出初代种群是极其重要的。
1．首先检查个体形态，如毛色、体型以及对外界刺激反应的敏感性等，有目的的选择后，即可进行繁殖。
2．对初代种群所产生的仔代，应进行病原微生物和药物感受性以及肿瘤诱发率等方面的检查，必须选留那些经过检查，而且有一定特性的双亲所生下的1～3胎仔鼠，作为下一代生产的种鼠。
3．第二代以后种群的选择。与选初代种群基本相同，但应注意二点：
（1）除注意其所需特性以外，还应注意其初产年龄、产仔数量、哺乳能力等方面的繁殖特性，应选择质量优良者。
（2）尽量在5～7代中选择具有所需特性的种鼠进行交配，因为5～7代是兄妹交配选择效果最好的代数，因此5～7代交配的组合尽可能大些，超过10代选择效果则较差。
三、培育方法
培育近品系的重要手段，一是交配繁殖，二是人工选择，两者经常是同时进行的。交配繁殖的目的在于使存在于基代双亲（即用于培育近交系的最初一对小鼠）中的不同遗传位点的不同基因通过连续许多代的重新组合达到纯合的程度，并保持足够数量的后裔可供交配时选择。人工选择的目的是挑选符合培养需要（有繁殖能力或其它的特殊性状）和淘汰不需要的个体。
（一）近交的交配方式
开始培育近交系种群和引起的近交系原种的维持，一般采用以下三种方法：
1．单线法：从近交系原种选出3～5个兄妹对进行兄妹交配，从中选出生产能力最好的一对进行繁殖，然后从中选择一对作为下一代生产的双亲，如此一代代的延续下去。这个方法生产的个体比较均一，但选择的范围太小，由于只有单线的仔代，易发生断代危险。
2．平行法：选3～5对兄妹对，每个兄妹对都选留下一代种鼠，一代代的延续下去，这个方法生产的个体不太均一，但选择范围大，易发生分化。
3．选优法：这个方法保留了上述两个方法的优点克服了两个方法中的缺点，是个较好的保种方法。假定每代选6对，每对都选自同一双亲的仔代同胞兄妹，在繁殖过程中，每一代均保持6对，当某对出现不孕或生产能力降低，而不适于继续繁殖时，则可从另一对所生的后代中选择优良者加以代替。近交系原种动物的维持方法见图3-2。
图3-2近交系原种群（基础群）的维持方法
（二）交配繁殖
1．近交系的培育要在专用固定的饲养室内进行。为了避免别的鼠系的进入和防止可能发生的感染，应有严密的隔离设备和措施。如墙壁门窗都不能有缝道，饲养罐盖子要十分严密，不能让任何小鼠随便进入。外观相似种系不同的动物应分室饲养。工作人员进入饲养室时需带口罩，非饲养人员不能随便进入。饲养罐、饮器、食具等使用前都要灭菌消毒等。
2．应该严格遵照单对配对，父母同罐的要求。这样便于随时检查和发现问题。而且雄鼠不离开雌鼠可以减少搞错谱系的危险，雄鼠也不干扰幼鼠的哺育和成长。一般不应采取一雄二雌的交配饲养方式，因为两个雌鼠可能同时怀孕，有时难于辨认年龄相仿的仔鼠与母鼠的关系。
3．对同系的每个鼠都应有详细明确的谱系和户籍记录：包括饲养罐号，同对的雌雄鼠号码（可根据父母鼠号码、胎数、同胎中第几号等确定）、培育代数、生育日期、胎数、产雌雄仔鼠数、断乳后存活的雌雄仔鼠数，选作传代交配的仔鼠号等等。记录不全或户籍登记错误往往会造成无法挽救的损失，特别是当这个错误未被及时发觉时。如果对一个动物谱系身份有怀疑，应立即予以丢弃。另外，所有饲养罐也要加贴有明确记录的标签并随时进行检查，发现任何情况都就立即记入户籍记录。
4．选用第一、二胎同胎仔鼠作b×s交配比b×o交配更易处理，而且常常繁殖的更好。如有必要也可用同父母不同胎的仔鼠配对。譬如在一胎仔鼠的性别完全或大部分相同的时候，经过很多代的近交繁殖以后，有时也可以用亲缘关系较远的堂（表）兄妹进行交配。当然这时近交系数要退回到它们的共同祖先（对堂兄妹交配来说是退回到祖代）这一代的F值。但如这种做法只是为了想提高繁殖较差的生育率，那么倒不如停止这条线的繁殖，另找一个生育较高的亚系作为近交繁殖的新起点更为妥善，因为前面的做法即使能够培育出一个近交系来，它的后裔也往往难以提供足够的实验动物数量。
5．在近交系培育过程中，为了保证对生育力有一定的选择范围（生育力的选择常常需要挑选多产和断乳后存活的仔鼠较多的亚系进行交配繁殖），每一代都应保留一定数目（3～4个）的亚系，以后随着代数的增加，除留下最后2～3代分出的亚系外，其余可陆续淘汰或抛弃，直到最后留下一个可追溯到基代的品系。因此除了记录下谱系和户籍之外，常常还需要随时绘制象下面的那些谱系图，如图3-3，以便分清或随时终止某些亚系。
图3-3　近交系培育过程中动物的谱系图
提供交配繁殖的亚系选择应特别注意：
（1）这个亚系应具有培育所需要的性状。
（2）至少与准备终断的亚系有差不多的生育率和生活力。在繁殖良好的种系中一般在第3～4代以后就可终断其它的亚系而只留一个亚系。如果子裔不太多，至少需传5～6代甚至10代以后才能这样作。
6．在完成20代b×s交配繁殖而建成一个近交系之后，要繁殖足够的动物提供实验需要，同时又不放弃选择最适合的动物进行繁殖并尽可能的保持遗传的一致性，最好的作法是从近交系中取出几对较好的动物继续照上面的办法进行b×s交配传代，并保持谱系和户籍记录，同时把其余的动物另室饲养，让最后三代任意交配，加速繁殖。可以每罐放1雄4雌，待受孕后取出母鼠，用它们的后代提供实验需要。开始时，应注意多保留雌鼠。