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大肠杆菌表达的蛋白可溶，但是活性很低，如何提高活性？
BL21中表达的蛋白大部分可溶，但是EMSA检测活性很低，诱导条件是25度3h，IPTG 1mM。怎么提高活性呢？是否要继续降低温度到18度，18度的话是诱导3h还是过夜？
什么辅助因子呢？看文献都没有提到
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1.75亿学生的选择
如何提高大肠杆菌表达天然构像蛋白质的产量
ck第六弹梉谏
这点上有很多种方法可以实现.pet应用手册你可以下下来,好好研读.我将提高蛋白质产量的部分,简单总结如下,希望对你有所帮助.增强可溶性和蛋白的正确折叠：1.为避免包涵体的生成,一切能够降低蛋白质合成速率的条件均适合.温度：建议低温过夜诱导.裂解buffer：可以加入去污剂将与膜粘连的蛋白提出来.定位在周质或者胞质中表达（用有信号肽的载体等,在这种环境中利于形成二硫键,折叠正确）.2.正确选择宿主菌,比如说一些有稀有密码子的,用origami,或者rosetta.3.有毒的基因,用petcoco系统不错.4.还可以好几个target proteins共表达,pet系列有许多商品化的东西.你可以去看看.我可以将手册发给你.
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我在做两个酶的共表达，第一个表达特少，第二个还好。单个表达也是这样，你给个建议吧。该怎么办！
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1.75亿学生的选择
为了提高重组蛋白在大肠杆菌的表达量,在表达载体上游碱基变换.为什么?为了提高重组蛋白在大肠杆菌的表达量,可以在目的基因的ATG上游,表达载体上游行碱基的变换,增加或减少碱基的数目,这是为什么?在此部位的操作主要针对载体上的什么元件,为什么?
ATG上游是启动子的位置 启动子有强弱之分,增加或减少碱基的数目可能使启动子由弱变强,从而提高重组蛋白在大肠杆菌的表达量.
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扫描下载二维码重组人蛋白在ecoli中表达量低的原因 - 实验交流 - 生物秀
标题: 重组人蛋白在ecoli中表达量低的原因
摘要: 重组人蛋白在ecoli中表达量低的原因这个问题大家或多或少都遇到过，同时也都有自己的见解。解决这个问题对所有的人都有帮助，我坚信。 关键词:[]……
这个问题大家或多或少都遇到过，同时也都有自己的见解。解决这个问题对所有的人都有帮助，我坚信。
请斑竹同意开展此话题的讨论
为了帮助大家开始，楼主可以自己先谈一下，也好抛砖引玉。
我觉得中等分子量的蛋白比较好表达，检测容易，积累的蛋白不会因为太小而被降解，分子量偏大时细菌的合成效率必然受限制。稀有密码子也许是影响外源蛋白表达量低的原因，有人说在N端影响比较大，我觉得在全部序列中多次出现稀有密码子很可能的不到预期产量的蛋白质。启动子效率是原因之一，就活性而言，包含体，并由之产生的温度、诱导物浓度都会决定所获得的产物产量、活性。下面清大家多谈谈自己的感受，谢谢！
这是一个很复杂的问题，我也说两句，也作抛砖引玉！我只说说基因序列本身的影响吧！基因序列对重组人蛋白在ecoli中表达量的表达量有较大影响作用，能否分泌表达重组蛋白可能很多时候也与基因自身序列有关。例如目前，已知与序列相关的影响抗体表达和分泌的主要因素可能包括1)RNA的二级结构,尤其是5’端的二级结构,可阻碍抗体的翻译;（这个我们可以应用软件设计来消除，这是后话）(2)大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)使用频率低的相同稀有密码子的连续出现,可降低抗体的翻译速度;(3)抗体可变区基因克隆时,由于使用简并引物,造成FR区相对保守的氨基酸位点突变为其它氨基酸;(4)表达抗体间非正常二硫键的形成;(5)其它未知因素.Pluckthum利用Mcpc603Fv研究抗体序列与抗体表量之间的关系发现，在重链框架区P40A、S63A、A64P突变可使抗体的表达量提高60倍[59]。利用定点突变的方法研究抗体序列对抗CD3 ScFv表达量的影响，结果发现，CD3抗体重链(Glu6Gln)、(Cys105Ser)两个位点发生突变，即可使抗CD3 ScFv的表达量提高200倍。因此,分析基因序列本身,并辅以蛋白质三维结构模拟及对比分析,通过定点突变对基因序列进行改造,有望提高重组蛋白在ecoli中表达的产量,同时保持其相应的生物学活性。当然，这只是一个方面，希望大家互相交流以促共同提高，完成好自己的课题或工作。
"蛋白质三维结构模拟及对比分析"摘自yxiangmind请问你如何进行protein三维结构模拟和对比？你有做过吗？有没有什么经验可以传授？
推荐你到http://cmbi./提供的一些生物信息(bioinformation)(bioinformation)学工具看看，也许你能找到你感兴趣的软件：关于结构模拟和对比方面。我本人做的不多，不过如果你有兴趣，我们可以讨论一下。
同意yxiangmind 的分析
对于提高重组蛋白的表达量，主要从两方面入手，即上游和中游，对于上游主要是基因构建上，表达载体的确立，宿主菌的选择，当然了也包括一些对目的基因的改造，但是原则是不改变目的基因的功能区域，同时在上游构建中，需要考虑两个问题，即产物的表达形式的问题，是以可溶的形式表达，还是以包涵体的形式表达，其目的性要弄清楚，在基因水平上可以从mRNA的稳定性，启动子的选择，密码子的偏好性，SD序列与起始密码子的距离，对表达进行研究，同时要选择合适的表达载体和菌株，一个好的表达载体和菌株能严重影响到目的产物的表达量，对于融合表达的蛋白，选择合适的融合伴侣也是很重要的，对于抗体的表达，由于抗体含有二硫键，所以融合表达对其正确结构的形成更有意义，尤其是融合伴侣trx在抗体表达中作用是很显著的，trx在表达过程中游双重作用，既有分子伴侣的作用，同时又能改变大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)细胞质中的生理环境，有利于二硫键的形成和在折叠过程中正确结构的识别，与此同时，与分子伴侣或折叠酶的共表达也能提高蛋白的表达量，尤其是具有生物活性的功能性蛋白，对于以非融合形式不能得到表达或表达量低的情况下，融合蛋白的表达的作用尤为明显，
其实对于蛋白质表达，对中游的摸索也就是菌体发酵条件的优化同样重要，一系列研究表面，在利用大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)生产重组蛋白的过程中，中游技术也是影响蛋白表达量的一个关键，由于蛋白的特异性，所以发酵条件是不可能有一个固定的模式的。对于诱导剂的浓度，诱导温度，诱导时间，摇床的速度，培养基的成分，质粒的稳定性，表达产物对细胞的毒性，都需要综合考虑，例如高温有利于包涵体的形成，而低温有利于可溶组分含量的增加，所以可以根据你表达形式的需要对温度进行优化，对于培养基的成分，可以在培养基里面加一些辅助因子，比如金属离子，尤其是在功能性蛋白的表达过程中，由于一般功能性蛋白都需要有辅助因子的参与才能具有生物活性，所以在培养基中增加这样一些成分，有利于目的蛋白表达量的增加，同时，还可以在培养基中加一些氧化物，比如双氧水，可以增加细胞质中的氧化环境，而有利于二硫键的正确形成，当然这样也会增加菌体的氧化状态压力，这是需要一个平衡的。 对于重组蛋白的生产，是一个实际加理论的过程，需要解决的问题很多，有很多时候，是一个不断循环的过程，为了选择一种最佳的构建，表达，纯化方案
对于提高重组蛋白的表达量，主要从两方面入手，即上游和中游，对于上游主要是基因构建上，表达载体的确立，宿主菌的选择，当然了也包括一些对目的基因的改造，但是原则是不改变目的基因的功能区域，同时在上游构建中，需要考虑两个问题，即产物的表达形式的问题，是以可溶的形式表达，还是以包涵体的形式表达，其目的性要弄清楚，在基因水平上可以从mRNA的稳定性，启动子的选择，密码子的偏好性，SD序列与起始密码子的距离，对表达进行研究，同时要选择合适的表达载体和菌株，一个好的表达载体和菌株能严重影响到目的产物的表达量，对于融合表达的蛋白，选择合适的融合伴侣也是很重要的，对于抗体的表达，由于抗体含有二硫键，所以融合表达对其正确结构的形成更有意义，尤其是融合伴侣trx在抗体表达中作用是很显著的，trx在表达过程中游双重作用，既有分子伴侣的作用，同时又能改变大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)细胞质中的生理环境，有利于二硫键的形成和在折叠过程中正确结构的识别，与此同时，与分子伴侣或折叠酶的共表达也能提高蛋白的表达量，尤其是具有生物活性的功能性蛋白，对于以非融合形式不能得到表达或表达量低的情况下，融合蛋白的表达的作用尤为明显，这段话，是比较经典的一段话，在里反复出现不止数次，有些名段的感觉！呵呵这里头大概提到15个应该考虑的方面，事实上，任何其中一个做不好，可能都会有所影响表达量！所谓水无常势，法无定法，若能抓住主要矛盾分析，很多问题就迎刃而解。
希望大家能够结合自己的实践，说说自己的感受。我们这个的目的不是说只帮助别人，更希望大家互相交流，能够进行思想的碰撞，产生更多的IDEA！LECTUERS ARE ALWAYS DULL AND UNREWARDING，BUT COMMUNICATION REALLY DIFFERENT，HOPE FOR UR JOINNING IN！THANKS FOR dynamo_lee‘s passion！
嗬嗬，其实我说的就是自己的实践东西，可惜楼上以为我是在高谈阔论，哎。。。
嗬嗬，其实我说的就是自己的实践东西，可惜楼上以为我是在高谈阔论，哎。。。别生气，我是乱说一气的，希望能不吝赐教！下面是考虑到mRNA的自由能，从而实现了高表达的一个例子。小弟以前做的，再次抛砖引玉，希望大家不要吝啬将自己的成功感受写来！应用DNAsis对 PROTEIN Ab进行分析，改造，实现原核非融合表达这是原始序列（约700bp），开始实践了很多的方法，都没有表达。GTGAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGTTTCTGGGTATACCTTCACAGCCTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGAAGTGGATGGGC ……应用DNAsis对 PROTEIN Ab的mRNA二级结构进行优化，使mRNA的自由能从 –15Kcal/mol降到约-3，结果实现了高表达。这的确让我兴奋，同时这也是信息(bioinformation)(bioinformation)学在蛋白表达的上成功利用的一个好的例子。不过由于一些原因，还没有写文章，大家先一睹为快。
不过，在分泌表达上我曾经试过很多的方法，总找不到有效的方法来提高产物的量，这也让我很郁闷，当然，我期望的量至少是10mg/l。由于以前我作的是多基因表达载体，产物间的二硫键多的时候可到13-15个，所以这方面看了一点，不知诸位有什么高见。
分泌性表达本身就不好做，其实关键是信号肽的选择上，表达量很低，对于分泌性表达，其实在酵母系统中我觉得是比较成功的，其研究也是比较多，最近我们也在就大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)的分泌表达进行有关合作，对方的分泌表达做得不错，具体细节正在商讨中，对于含有二硫键的表达大部分是采用融合蛋白的表达形式，我们所研究的蛋白含有6对二硫键，是用trx作为融合伴侣，并对发酵条件进行了优化，可溶性的表达量不错，其实在上游构建上，我们还有很多工作要做，所以这是一个系统过程，问题需要一步一步解决，这方面工作正在开展中。对于mRNA的结构的稳定性，我想主要是解决5’端类似发夹结构的问题，以防止核糖体过早的脱落，而使得目的基因不能正确表达，或者会出现不完整的目的蛋白片断的出现，因此采用定点突变是解决这类问题不错的选择，楼上的经验很不错，提供了一个好的切入点，
不过，我看国外分泌表达的例子，大多都是单基因表达。在信号肽的选择上，现在偏向用PHOA启动子，实际上，很多的时候，拿来载体的时候，启动子已经选定了，除非你自己想去有意识的改造。酵母系统现在的确做的多，大多人都是Invitrogen的产品，不过，这毕竟属于两个不同的体系，都会有自己特殊的一些问题，这方面我们以前也有人作过，效果不是太好。这方面可以另开帖子讨论。采用融合蛋白的表达形式，似乎不错，但为了去除融合蛋白，也有可能也会引入新的问题，因此在选择是否融合的问题上应该慎重。我们用过Novagen （好象是这个，记不清了）的9套表达载体，据说已经成功表达了N多的蛋白，有的也含有融合伴侣，但试过之后，才发现针对不同的东西，表达相差甚远。这的确需要一个不断优化和摸索的过程，很多工作需要做。
嗯，分泌表达大部分都是单基因了，启动子的选择一般是根据载体来的，选择不同类型的载体而选择不同的启动子，当然了，也可以进行改造，在植物玉米基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)中，我们曾将35S启动子改造成玉米特有的启动子，效果还是不错的，对于酵母系统，我们原来也做过，但是表达量太低了，不过蛋白活性还是很不错的，尤其对于糖蛋白。其实表达这个东西就是这样的，不同的蛋白需要摸索不同的表达载体和表达条件，这是大家公认的一个规律，以前表达成功了，不能说明现在就可以，毕竟目的基因不一样。我们也曾遇到这样的问题，当然了没有办法，选择其他合适的表达载体了。融合表达主要是解决以非融合形式不能表达的问题，或者对于含有二硫键的蛋白的折叠问题。至于融合蛋白的切除，目前的研究还是比较成功的，比如gst系统通常采用的是柱上切割，连接两根gst层析柱，第一根柱挂融合蛋白，第二根柱挂切下来的gst，或没有完全切下来的融合蛋白，流出的就是目的蛋白。
这几天我看了一些关于酵母系统的表达，想继续深入的作一点工作。就象你讲的原来也做过些，但是表达量太低了，不过蛋白结合活性还是很不错的，我不要求糖基化。很多的情况下，蛋白多肽就解决问题了。况且酵母糖基化和人体的肯定有差别，或多或少会存在免疫原性的问题。另外，我以前作的一个蛋白就用和gst融合，不过后来用其筛选抗体库，始终感觉不是很方便，最终还是改为了非融合表达，幸运的是量还高，效果也好。相比之下，融合表达做法则在新药申报时会遇到较多的困难。
如果在非融合的条件下能表达，当然是很不错的选择了，其实如果想增加表达量，而对表达后的修饰和加工没有太多的要求的话，大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)是最好的，尤其是做结构和功能关系的理论研究，大量制备目的蛋白是开展这方面工作的前提条件，其实融合和非融合的选择，纯粹和你的目的基因的特异性有很大的关系，比如我们现在做的工作中，目的基因只能是以融合蛋白的形式进行表达，所以选择的方式也只能是这样，融合表达的优势和劣势还是比较明显的。选择什么样的表达方案，总的说来还是具体问题具体分析
哈哈，dynamo_lee说的及时。另外，你提及到“ 融合表达主要是解决以非融合形式不能表达的问题，或者对于含有二硫键的蛋白的折叠问题”，我有些不太理解，即使是融合表达，大多的时候产物也是以包涵体的形式存在，这是否和你所说的有些矛盾呢？
对于以非融合形式不能表达的问题，主要体现在mRNA5’端的不稳定性，所以使得目的基因不能表达，增加融合蛋白能改善5’端的物理环境，增加mRNA的稳定性。同时对于含有稀有密码子的目的基因，增加融合蛋白以后能增加tRNA的识别效率，从而使得难表达的基因获得表达，对于含有二硫键的蛋白质，由于大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)细胞质中的还原环境，使得二硫键不能够正确形成，而分子伴侣的加入能够改善细胞质中的还原状态，促使二硫键的正确形成，比如TRX，其具有分子伴侣的作用，在核糖体合成多肽链开始或多肽链从核糖体上释放出来的时候，就参与了多肽链的正确折叠，其通过支持二硫键异构的支路，支持正确结构的形成，与此同时，它还能改变细胞质中的氧化还原状态。其实对于包含体形成问题的解决，一直是基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)重组表达外源蛋白的关键问题所在，而解决这个问题从两方面入手，第一，是减少包含体的形成，第二是，研究新的溶解和复性手段，提高活性蛋白的回收率。不是说融合表达就一定是包含体，可以通过很多手段，减少包含体的形成，增加目的蛋白可溶组分的表达量
1)RNA的二级结构,尤其是5’端的二级结构,可阻碍抗体的翻译;……（利用定点突变的方法研究抗体序列对抗CD3 ScFv表达量的影响……想请教，如何分析二级结构预测的结果？有无明确的文献说明在排除其它原因的情况下，改变5’端的二级结构而使得表达量增高？想通过定点突变来提高表达量，能否对目的序列先做一下预测，确定优先突变哪些位点？难道一个一个去做？
就我个人感受，我觉得相对某一个特定的表达载体而言，宿主菌的选择非常重要！！！我曾经遇到这样的问题，最后发现问题是出在宿主菌的选择上。
想请教，如何分析二级结构预测的结果？有无明确的文献说明在排除其它原因的情况下，改变5’端的二级结构而使得表达量增高？想通过定点突变来提高表达量，能否对目的序列先做一下预测，确定优先突变哪些位点？难道一个一个去做？ 我用的是DNAsis来分析的（顺便将一些稀有密码子突变）。至于改变5’端的二级结构而使得表达量增高有这方面的报道的，不妨查一下。不过很多的时候为了排除其它原因：比如是否为RNA的量增多所引起的高表达，通常还得有交多的实验来支持你的说法！对目的序列先做一下预测，确定几个优先突变位点，采用简并引物进行PCR并进行载体构建。最后大规模筛选即可（20来个克隆足以）！就我个人感受，我觉得相对某一个特定的表达载体而言，宿主菌的选择非常重要！！！我曾经遇到这样的问题，最后发现问题是出在宿主菌的选择上。对上面这个基因，我们试了5个菌株，变化不大。一般的换菌似乎增长不了一个数量级的，有些时候让人着急！
这几天我看了一些关于酵母系统的表达，想继续深入的作一点工作。就象你讲的原来也做过些，但是表达量太低了，不过蛋白结合活性还是很不错的，我不要求糖基化。很多的情况下，蛋白多肽就解决问题了。况且酵母糖基化和人体的肯定有差别，或多或少会存在免疫原性的问题。另外，我以前作的一个蛋白就用和gst融合，不过后来用其筛选抗体库，始终感觉不是很方便，最终还是改为了非融合表达，幸运的是量还高，效果也好。相比之下，融合表达做法则在新药申报时会遇到较多的困难。酵母表达系统现在用的多的是毕赤酵母，而不用酿酒酵母，主要是考虑到上述说的糖基化带来的对人或多或少存在免疫原性的问题，而毕赤酵母在这方面要优于酿酒酵母，invitrogen买断了这个方面的专利，所以你发现只有这家公司做这方面的载体，如果你的蛋白不需要糖基化，完全没有必要用这种表达系的！
其实有时候影响蛋白质表达的原因真是匪夷所思，我的一位同事在表达VEGF时，PCR出来的基因中部发生了一个base的突变（同义突变），所有人认为对表达不会产生影响，可是尝试了各种表达载体就是不表达，最后将该base突变回来，表达条件没有任何改变，表达量却非常高，只是一个内部base的改变，影响竟是如此直大。
看了各位大侠的高论，对我以前蛋白表达所遇到的问题又有了新的认识，真是受益多多。我曾经表达过一个病毒的四段蛋白，转入PGEX后均不表达，在排除了顺框的问题后，又换了两种常见的宿主菌，没效果，换载体PET-28，没成效，一个老师建议我用PET-30，说对表达某些易降解和有毒性的蛋白效果较好，试了，也没用。最后，换了一个加入了稀有密码子的宿主菌BL21-RP及RIL，有一个蛋白得到了表达，当时真的很高兴，辛苦了一年，终于有了回报，可惜当时不知道有这么一个网，要不也不用走这么多弯路了。不过这一路艰苦走过来，收获也挺大的，再看到各位楼主的帖子，互相印证，感触良多，收获大大的！
请问如何优化密码子?用软件吗？请问偏爱密码子有哪些？
别生气，我是乱说一气的，希望能不吝赐教！下面是考虑到mRNA的自由能，从而实现了高表达的一个例子。小弟以前做的，再次抛砖引玉，希望大家不要吝啬将自己的成功感受写来！应用DNAsis对 PROTEIN Ab进行分析，改造，实现原核非融合表达这是原始序列（约700bp），开始实践了很多的方法，都没有表达。GTGAAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGTTTCTGGGTATACCTTCACAGCCTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGAAGTGGATGGGC ……应用DNAsis对 PROTEIN Ab的mRNA二级结构进行优化，使mRNA的自由能从 –15Kcal/mol降到约-3，结果实现了高表达。这的确让我兴奋，同时这也是信息(bioinformation)(bioinformation)学在蛋白表达的上成功利用的一个好的例子。不过由于一些原因，还没有写文章，大家先一睹为快。注意道你改变的三个位点都是codon的摇摆碱基上，以前这三个位点是不是稀有密码子？改变以后呢？
对啊，上面这位说得非常的有道理，如何证明不是密码子偏爱性的改变导致了表达量的改变呢～～～？？？
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