IRE联合细胞同步化对Hela细胞消融作用伴G2/M期阻滞的实验研究--《遵义医学院》2016年硕士论文
IRE联合细胞同步化对Hela细胞消融作用伴G2/M期阻滞的实验研究
【摘要】：目的:探索不可逆电穿孔及脉冲电场联合细胞周期同步化对Hela细胞的消融作用,初步了解脉冲电场引起Hela细胞G2/M期阻滞的机制。方法:实验组为1.75 k V/cm、2.0 k V/cm、2.25 k V/cm、2.5 k V/cm,加对照组,共5组,脉冲参数为脉宽100μs,频率1 Hz,脉冲数8个。采用洛伐他汀同步G1期,羟基脲同步S期和G2/M期,流式细胞术检测确认。Hela细胞及同步各细胞周期的细胞进行电穿孔,6小时及12小时流式细胞术检测细胞周期情况;24小时后流式细胞术及荧光显微镜检测细胞凋亡情况;CCK-8 24小时后检测细胞活力;CCK-8连续检测7天测各组细胞电场处理后的增殖与活力(场强2.5k V/cm)。Hela细胞及同步各细胞周期的细胞进行场强为2.5 k V/cm的电场处理,14天吉姆萨染色观察克隆形成情况。Western Blot检测G2/M期细胞周期蛋白,初步了解脉冲电场引起Hela细胞G2/M期阻滞的相关机制。结果:(1)Lov作用24 h,可获取G1期细胞(83.39±3.91)%;HU作用24 h,弃去HU,继续培养3.5 h可获取S期细胞(82.12±3.44)%,继续培养8.5 h可获取G2期细胞(78.06±3.14)%。(2)流式细胞术检测各场强作用后6小时G2/M期细胞与对照组比较有增多趋势,2.5 k V/cm与对照组比较有显著差异(P0.05);24 h后流式细胞术检测细胞凋亡,G1期凋亡率明显高于G2期、S期及未同步组(P0.05),G2/M期凋亡最弱与未同步组有差异(P0.05)。(3)各组进行电穿孔后24 h,CCK-8检测细胞活力均明显被抑制,与对照组比较有显著差异(P0.05)。CCK-8连续检测7天观察各组细胞活力增殖情况,G2﹥S﹥control﹥G1,平板细胞克隆形成情况结果相同。(4)检测G2期细胞周期蛋白cyclin B1,p-Cdk1(Tyr-15)表达量增多、Cdk1表达量减少,较对照组有差异。结论:细胞周期同步化可影响不可逆电穿孔对Hela细胞的消融作用,对G1期细胞作用最强,对G2期作用最弱。脉冲电场可引起DNA损伤,引起Hela细胞G2/M期阻滞包含Cdc25-cyclin B1/Cdk1途径。值得注意的是随着脉冲电场的衰减,周边未被杀死的肿瘤细胞细胞周期的变化及电穿孔对各细胞周期不同的消融作用可能会加速肿瘤的复发。
【关键词】：
【学位授予单位】：遵义医学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2016【分类号】：R737.33【目录】：
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浅谈流式细胞仪
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流式细胞术(flowcytometry FCM)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析和分选的一门技术。在分析或分选过程中，包绕在流动液体中处理过的单个细胞或微粒通过聚焦的光源，产生电信号，这些信号代表光散射、荧光等参数，以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，以对其进一步的培养或分析。包绕细胞的液流称为鞘液。所用仪器称为（flowcytometer FCM）。流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光技术和计算机科学等多门学科和技术，具有检测速度快、精确、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。
一、(flowcytometer FCM)
&&& 1．流式细胞仪的基本结构
&&& &&流式细胞仪的结构一般可分四部分，即数据贮存和计算机控制系统、流动系统、激光系统、光学和电子系统。
&& （1）数据贮存和计算机控制系统
&&& &&数据贮存采用列表排队(List Mode)方式。利用计算机用多种图形来表明各参数间的相互关系，以单参数直方图，双参数二维点图，等高图等方式显示。数据分析一般设定正确的分析范围，划分计算区域和计算结果。
（2）流动系统
&&&&&流动系统是流式细胞仪的心脏，因为细胞悬液在被检测之前必须首先形成一个很细的稳流，细胞在其内部排成单列通过测量区。细胞悬液和鞘液分别（是分别还是同时）进入流动室，鞘液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过测量区，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。
&&& &（3）激光系统
&&& &&多采用氩离子激光器。使发射光在可见光谱范围内488nm激发。目前市场上大多数荧光色素适用于此波长。激光的单色性好，功率高，稳定。
（4）光学和电子系统
&&& &&激光束射至经流体力学聚焦的个别细胞和粒子后，光散射在各个方向(360?)发射。有两个光散射参数需收集，前向角散射(FSC)主要用于检测细胞体积的大小。另一为侧向散射(SSC)用于检测细胞膜，胞质，核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒。
&&& &&荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的。荧光波长与激光波长不同，而且强度较弱，因此要使用光学滤片滤除非荧光信号并使用灵敏的检测器。荧光测量时通常使用线性放大器（即放大器的输出与输入是线性关系），适用于较小范围内变化的信号，如前向角散射和DNA测量。但有时需要对数放大器（即输出与输入是对数关系）。如果原来输出为1，当输入增加到原来的10倍时，输出是2。在免疫学检测中常使用对数放大器，因为在免疫学的样品中，可能有的细胞未被染色而仅有自发荧光，为阴性群体；被染上色的细胞特异性荧光可能比自发荧光强数倍到数十倍，为阳性群体。使用对数放大器可以同时分辨出亮度差异大的多个细胞亚群，容易选定不同亚群间的分界点，有利于流式细胞仪的分析和分选。
&&& &&荧光信号的补偿：当用一种激光束同时激发两种染料发射出两种不同波长的荧光时，两种荧光发射光谱有一定的重迭，可用电补偿减去不适合荧光通道测定的重迭信号。
&&&&&（5）细胞分选系统
&& & &细胞分选可使被指定的细胞从细胞群体中分离出来。流式细胞仪所测定的任何参数都可以作为细胞分选依据，被选出来的细胞的均一性与所测参数有关。其工作原理是把液滴形成信号在压电晶体上使之产生机械振动（不太通顺），液柱断裂成一连串均匀的液滴，一部分液滴中包有细胞，如果其特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则带有特定的电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，偏转落入指定的收集器内，完成细胞分类收集的目的。
2．流式细胞仪的类型
&& &&流式细胞仪分为两大类，一类为临床分析型(又名台式机)，特点为仪器光路调节系统固定，程度高，易学易掌握。如Becton Dickinson(简称BD)公司的FACSCalibur、Beckman-Coulter公司的EPICSXL、Cytomation公司的MOFLO、Partec公司的Pas、Aber公司的Microcyte、Ortho公司Cytoron等；另一类为科研(分选)型，特点为可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并且将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于更广泛的科学研究之用。如BD公司的FACS Vantage，Beckman Coulter公司的EPICSALTRA，Cytomation公司的MOFLOMLS及Partec公司的Pas-III等。最近BD公司推出了FACSAria,其优点为具备科研分选型标准而操作与临床分析型同样简便，程度高。
&3．流式细胞仪检测的质量控制
&&& &&（1）样品与试剂
&&& &&血液、骨髓、体液等必须当天采集，6 h之内进行免疫荧光染色；活化血小板检测应在采血后立即染色与固定。组织样品可采用机械法去聚集并过滤，最好用单细胞制备仪（machine）处理。试剂、、、固定剂等必须符合标准。
&&& （2）对照设置
&&& 目的是避免各种因素可能造成的假阳性或假阴性反应。
&&& ①同型对照：与单克隆（MoAb）相同的、未免疫小鼠标记荧光素的免疫球蛋白亚类作对照。主要考虑细胞的自发荧光、非特异性结合等影响因素。
&&& ②阳性对照：已知阳性标本能否确定为阳性。达不到要求时不能进行临床试验。
&&& ③阴性对照：用已知不表达某种抗原的细胞作样品检测，应出现阴性。目的是避免实验的非特异性反应。
&&& ④正常对照：对一种新的MoAb，在使用前进行对照试验，可保证仪器在最佳条件下获取样品。
&&& ⑤质控品：
&&& 试剂厂方提供与待测样品成分相近的稳定的质控物，并提供检测项目的靶值和质控范围，作为某一试验项目的全程质量检测物，评估试验结果的可靠性。如BDMulti-Check Control 是淋巴细胞及其亚群分析的全血质控品。
&&& （3）仪器的校准与性能检测
　　使用标准荧光微球，运行FACSComp软件，校准通过，表明仪器状况良好。
二、流式细胞仪的功能和临床应用
&&& 流式细胞仪最大的贡献在于促进了免疫学基础研究和临床诊断。目前流式细胞术已被广泛用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学和临床检验等多学科领域的基础和临床研究。&&&
&& 1．流式细胞仪的功能
&&& &（1）细胞参量分析&
&&& &包括细胞大小、形状、蛋白荧光、氧化还原状态，膜的结构、流动性、微粘度、膜电位，酶活性，钙离子含量，pH值，染色质结构，DNA合成，碱基比例等。
&&& &（2）细胞表型分析
&&& &从1982年正式以CD(clustor of differentiation) 来表达（示）白细胞分化抗原。己确定的CD序号从CDl一CD247，这些细胞表面分化抗原，可以将人体组织细胞分为T细胞、B细胞、髓样细胞、血小板、NK细胞、粘附分子、内皮细胞，受体／趋化性受体、干细胞／祖细胞、碳水化合物／凝集素、非谱系组共13系。CD抗原在细胞表面的获得和丢失在一定程度上反映细胞分化程度和功能状态。研究CD的意义在于①理解CD抗原分子本身的一些特性及其与免疫功能的关系；②认识和探讨CD抗原所表达细胞的功能及其在疾病发生中的作用。
（3）细胞分选 &&
&&& &&这是FCM的一项重要功能，目前FCM对细胞亚群的分选纯度可以达到99%，除了对特定的亚群加以分选外，还可以分出所需要的染色体加以分析甚至能结合PCR方法加以扩增，这多用于研究中。
&&& 2．流式细胞仪检测在临床的应用
&&& &&流式细胞仪的功能决定了其在医学领域的重要地位，目前在临床上主要用于细胞表型分析、造血系肿瘤诊断和分型、移植前配型及与免疫有关疾病分析等。
&&& &&（1）CD抗原与白细胞分析
&&& &&①T细胞
&&& &&CD3+（注意下面CD分子的格式应一致）：成熟T淋巴细胞，是鉴定T细胞的重要标志，判断细胞免疫状况。
&&& &&CD4+：T辅助/诱导细胞亚群
&&& &&CD8+：T抑制/细胞毒亚群
&&&&&CD4+ /CD8+比值：是免疫状态标志的检测指标，正常CD4+ /CD8+比值为1.2∽2.9,在肿瘤、免疫缺陷病、病毒感染、自身免疫病、器官移植后都有诊断、预后和治疗的指导价值，其比例降低与病变程度有关。
&&& &CD8+ /CD28+ 与CD8+ /CD28&：前者为细胞毒T细胞（Tc），后者为抑制性T细胞（Ts）。
&&& &CD4+/CD25+ 与CD4+ /CD25&：前者为免疫调节性T细胞，后者为效应T细胞。
&&& &CD4+ /CD29+：辅助性诱导细胞，辅助B细胞产生抗体和诱导细胞介导的淋巴细胞溶解作用，自身免疫性疾病可见增多。
&&& &CD4+ /CD 45RA+ 与CD4+ /CD 45Ro+：前者为原初细胞（naive cell）主要功能是诱导Ts细胞活化和辅助其功能活性。SLE、MS患者外周血CD4+ /CD 45RA+细胞减少，后者为记忆细胞（memory cell）。
&&& &②B淋巴细胞：CD19+是总的B淋巴细胞特异抗原，判断体液免疫状况。CD23+为IgE低亲和力受体，分布于B淋巴细胞、嗜酸粒细胞上，增多与变态反应性疾病、肾病综合症、白血病等有关。
&&& &③NK淋巴细胞： CD3&/CD（16+56）+ 细胞表型。
&&& &④单核/巨噬细胞标志：CD14+细胞
&&& （2）CD 抗原与血小板分析
&&& &&分析单个血小板或血小板亚群膜糖蛋白，是血小板膜糖分析方法学上的重大发展，对先天性与获得性血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断，尤其是评价血栓性疾病与血栓前状态发生与发展过程中血小板的活化程度及其诊断、治疗、预防等具有特别重要的意义。FCM分析血小板膜糖蛋白方法简便、快速、标本用量少、灵敏度高、特异性强、结果准确，为血小板的基础和临床研究提供了崭新的手段。
&&& &&CD62p(P选择素)是一种糖蛋白，存在于血小板&;颗粒以及内皮细胞中。CD62p在体内或体外刺激后，即转移至膜表面，巨核细胞也有表达。CD62p又称GMP&140或PADGEM蛋白(血小板活化依赖&;颗粒膜蛋白)，它在血小板与单核细胞及中性粒细胞相互作用中起关键作用。
&&& &CD63为溶酶体膜糖蛋白，在多种细胞的表面和胞浆内，尤其是在血小板内部都能检测到，血小板活化后即转移至膜表面。
&&& &测血小板相关免疫球蛋白（PAIg）包括抗IgG、IgM、IgA有助于诊断免疫性血小板减少症。
&&& &一些血小板的胞浆中含有核酸物质RNA，可被噻唑橙（Thiazole orange,TO）染色称网织血小板。网织血小板是刚从骨髓中释放出来的血小板，可用于血小板减少性疾病的鉴别诊断和疗效监测。
3．辅助白血病和淋巴瘤分型和诊断
&& &&FCM是血液病MICC分型法中免疫表型分析的重要手段。免疫分型可为临床指导治疗，判断预后，预测复发提供帮助。
&&& （1）白血病系列分化抗原：&&&
&&& T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7、CD10
&&& B淋巴细胞白血病：CDl9、CD20、CD21、CD22，CDl0
NK细胞白血病：CDl6、CD56、CD57
&&& 粒细胞白血病：CDl3、CD33、MPO（髓过）
&&& 单核细胞白血病：CDl4、CDl5、 CDl1b
&&& 红血病：血型糖蛋白A(glycophorinA)，CDl3
&&& 巨核细胞白血病：CD41，CD42、CD61&
&&& （2）白血病系列非特异性抗原：
&&& CD34+、HLA-DR+、CD38-为干细胞、CD34+、HLA-DR+、CD38+为原始细胞，CD34-、HLA-DR-、CD38+为幼稚细胞。
&&& &&白血病细胞系列确定后，可根据系列抗原表达特点选择单抗进一步分亚型。
4．HIV和获得性免疫缺陷综合征（AIDS）
&&&&& &HIV主要感染CD4+T细胞，CD4+受体是病毒进入的主要途径。正常血中CD4+T细胞约1000细胞/ul（400---1500细胞/ul）。&400&500细胞/ul表示病毒强烈影响免疫系统。&200细胞/ul即使没有症状可确定AIDS，有预后价值。HIV感染早期CD8+T细胞增多，发展为AIDS则下降。
&&& 5．DNA含量分析以及细胞分化周期分析
&&&&&DNA含量检测根据细胞周期动力学概念，在一个周期内可分为4个时相，依次为G1期、S期、G2期和M期，见图2。利用DNA分析软件可以确定各时相细胞的比例。能够进行DNA含量分析的标本可以是PBL，正常、病变或肿瘤组织，针吸或活检组织，石蜡包埋组织，胸水、腹水，膀胱冲洗液和体外培养细胞。
&&& &&DNA含量分析的目的在于确定某一组织或细胞群体的增殖状态，引入DNA指数(D1)即DNA倍体的概念可以用于区别肿瘤的良恶性，恶性肿瘤的增殖状态。
&&& &二倍体细胞的DI=1，在临床上二倍体细胞DI在0.9&1.0之间，根据DI可以确定细胞DNA倍体。
&& &6．化疗药物用药指导，敏感药物筛选
&&& &&药物作用处理后的细胞采用Calcein-AM（Florescein-methylene aminodiacetic acid 荧光素亚甲亚氨二醋酸）与PI染色。Calcein-AM 为非荧光乙酰甲氨基酯经活细胞非特异性酯酶水解可变为荧光结合物，而死细胞不能水解因而无荧光。死细胞可被PI染成红色，活细胞不被PI染色，两者区分明显，可用以筛选药物。
7．实体器官移植配型和排异监测&
&&& &&可判断受者的免疫状态、免疫抑制剂疗效和全身免疫抑制程度。移植前交叉配型检测类抗原的抗体(PRA)、血管内皮细胞抗原(VEA)抗体，可以提高移植率。
8．细胞凋亡(cell apoptosis)检测
&& &&细胞凋亡可清除体内有害的细胞群，维持内环境的稳定。细胞凋亡阐明一些疾病的发病机制，导致疾病新疗法的出现。FCM利用光散射和荧光染色能够通过检测细胞光散射改变、膜结构和转运功能改变、DNA含量变化和DNA断裂点标记，从多方面分析和鉴定凋亡。是目前能够同时区分凋亡与坏死的唯一手段。
&&& &&碘化丙啶(P1)标记FCM分析时，在细胞周期分析图中表现为G0/G1期峰前的亚G1期(sub-G1)峰。位于细胞膜脂质双层内侧的磷脂酰丝氨酸(Ps)，反转至外侧是凋亡早期膜结构的特异性改变。annexin-V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，与PS具有高亲和力，以酶或荧光素标记的annexin-V为可鉴定凋亡，与PI结合经流式细胞仪(FCM)分析，是唯一可区分凋亡早、晚期（如何区分）与坏死的方法。
&9．Th1与Th2细胞及细胞因子
&&& &&辅助性T细胞根据其产生的细胞因子及功能的不同可分为Th1与Th2两大类。Th1细胞分泌IL-2、IFN&、主要参与细胞免疫；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，主要参与体液免疫。两者相互调节、相互平衡，其平衡失调与多种疾病有关。应用流式细胞仪可检测细胞内细胞因子。
&&& 近年来美国BD公司提供CBA（Cytometric bead array）,采用一系列微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测溶液中被检测物质的量。此法优点为同时可检测多项指标如人Th1/Th2 CBA可检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF&、IFN&；人炎症性细胞因子CBA可同时检测IL-8、IL-1&、IL-6、IL-10、TNF&、和IL-12。
10．网织红细胞计数
&&& &&传统技术用煌焦油蓝染料,染色涂片后,光镜下计数,方法费时且只计数1000个细胞,误差较大。使用噻唑橙(Thiazole Orange, TO)染料,可与核酸形成荧光-核酸复合物,流式细胞仪上检测50000个红细胞求得百分率与绝对数,有助于贫血的鉴别
&11．造血干祖细胞检测
&&& &&骨髓移植的适应症主要有白血病、先天性免疫缺陷病、再障等。骨髓移植实质是造血干细胞的移植。CD34+细胞常作为多能干细胞的标志。
&&& &&骨髓移植前检测CD34+细胞是很重要的一个步骤。样品经抗CD34+荧光抗体染色，可识别和定量CD34+细胞。
12．糖皮质激素受体（glycocorticoid receptor,GCR）检测
&& &&测GCR常用细胞溶质放射配基受体（请确认）结合测定，它可定量，但需细胞量多、检测时间长。流式细胞仪可测淋巴细胞总GCR，此法虽半定量，但检测所需样品量少。对长期激素治疗或确定下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴功能紊乱，评估细胞内GCR水平有一定价值。
&& &13．环氧合酶（Cyclooxygenase,COX）检测
&&& &&环氧合酶（COX）是花生四烯酸合成前列腺素（PG）的限速酶。它催化产生的PG参与机体多种生理和病理生理过程。COX有两种类型:COX-1和COX-2。COX-1为结构性的&看家基因&产物,在多数组织细胞中持续低浓度表达，参与维持机体正常的生理功能。COX-2为可诱导性的，炎症、细胞因子、生长因子等刺激可使其大量表达，参与和加重炎症反应，促进肿瘤细胞增殖、新生血管形成，促进黏附、抑制免疫与抑制细胞凋亡。应用流式细胞仪可监测人血单核细胞经LPS刺激后COX-2与COX-1的水平。对炎症、血栓、肿瘤等病的发病机制、疗效和预后判断均有一定价值。
&&& &&近年来应用流式细胞术检测特异性CTL细胞、细胞信号传导等亦在迅速开展。&&&&&&&&&&&&&&&
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【求助】用流式细胞仪如何分选出M期细胞？
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:)如何用流式细胞仪分选出有丝分裂期的细胞？有什么方法？或者文献？谢谢！
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有丝分裂细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N) ，而G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ，而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，用DNA染料处理细胞后，可以将细胞周期各时相区分为G1/ G0 期,S 期和G2/ M 期,并可通过计算获得各时相的百分率。 M期是细胞周期的重要研究对象，但由于G2期和M期的DNA含量一致，仅用DNA染料无法区分。Larsen等（1984）利用mithramycin结合DNA染料分析多聚甲醛固定的有丝分裂细胞，利用其mithramycin染色和FSC的特性将G2期和M期细胞区分开来。 有丝分裂细胞DNA染色被多聚甲醛淬灭的比间期细胞少，mithramycin的荧光高20~40%，而FSC降低30~60%，该方法与显微镜计数的相关性很高。 下图摘自Mathias, S et al
Differential modulation of paclitaxel-mediated apoptosis by p21Waf1 and p27Kip1 Oncogene (23 -2429 Mithramycin A
别名：MithracinAureolic acidAurelic acidPlicamycin希望能加分
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关于丁香园G2/M周期阻滞-学术百科-知网空间
G2/M周期阻滞
G2/M周期阻滞
研究细胞增殖动力学时,不仅要分析细胞周期,还要包括一些其他的参数,称为细胞动力学参数...G2期为细胞分裂周期中另一个敏感阶段，很多理化因素都可阻抑G2期，使细胞不能进入M期，导致分裂指数下降。（4）M期（有丝分裂期）：为细胞分裂期，可分
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