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【交流】免疫荧光染色成功经验的总结&[精华]
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这个帖子发布于8年零222天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
背景：日接到老板分配的新任务之一——做肝脏组织ZO-1（一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白）免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化很熟悉，在园子内也有不少置顶贴，但免疫荧光一直还没做过（原理知道，但细节不太了解）。
过程：我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想；近几日，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的认识，故发出此贴以便于与大家进行分享和讨论（前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论），不妥之处敬请指正。
问题：1、石蜡切片能否做免疫荧光染色？2、冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？3、一抗孵育的条件和浓度如何摸索？4、二抗孵育条件、浓度以及其它要点是什么？5、如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？6、如何避免荧光素提前衰退？7、普通荧光显微镜的操作指南和注意事项？...................................接下来，我来整理我近来的实践思考和论坛理论学习。同时十分欢迎大家进行交流、讨论和资源共享。相关链接：【整理】免疫荧光组织（细胞）化学和免疫胶体金技术大全（原理、试剂和器材、操作流程、常见问题及其解决方法）【求助】免疫荧光问题请教(十分紧急) 【原创】免疫组化技术常见问题及其解答集锦（不断更新中） 【原创】常用蛋白质水平检测方法比较
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wh2008 edited on
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固然免疫染色的方法及过程非常重要，直接影响到检测结果的好坏。但是检测技术也是非常重要的。不知诸位有没有听说过--多光谱成像技术，此技术使“多信息数据挖掘”成为现实。我们可以同时获得多个分子靶点的形态学信息、空间分布信息以及定量信息，从而可以获得各分子靶点间的相互关系信息。多光谱成像技术可以解决如下困难：1，完全去除自发荧光2，多分子靶点进行同时标记检测（包括明场的检测），共定位分析可以获得各个靶点之间的相互关系信息。结果如下：自上而下分别为：甲醛固定的前列腺组织特异性膜抗原（525nm的量子点标记）；肝脏组织切片（Hoechst标记细胞核，AF488标记细胞膜，Cy3标记细胞质）；淋巴细胞在分化的过程中生发中心相关靶点的标记（均为量子点标记））
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wh2008 如何避免荧光素提前衰退？1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。请教：1. 对于二抗的操作，如何进行避光？把房间的窗帘拉下来吗？黑暗的环境下岂不是影响操作？2. 抗荧光萃灭的封片液购自哪家公司？3. 指甲油怎么封？是用甘油封片后再用指甲油在盖玻片周围封起来吗？请楼主百忙之中抽出时间不吝赐教，先谢了！
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wh2008 如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？产生原因：（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。（6）荧光素不纯、标本固定不当等。（7）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。消除方法：（1）购买高质量、高纯度的荧光素二抗。（2）二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。（3）调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。（4）增加清洗次数和延长清洗时间。（5）延长血清封闭时间。（6）适当稀释二抗浓度至出现特异性染色阳性，而非特异性染色保持阴性。楼主您好，我正在做角膜上皮的ZO-1，想请问下您用的二抗是国产的还是进口的，您一抗和二抗是多大浓度的。我的倒是出了，但问题就是要看的部位荧光很弱，邻近的组织非特异染色特别强（主要是胶原）。我的一抗是SANTA的（1：200），二抗是中杉的羊抗兔TRITC（1：100）。我做另一个蛋白用的同公司的二抗，羊抗兔FITC就没有非特异染色了，请问那是不是ZO-1的那组二抗有问题呢？我该怎么办呢？请帮忙分析下，不胜感激。还有贴子里提的新买的二抗透析法，那个具体是如何操作的呢？谢谢
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今天拍照（1）肝脏冰冻切片的ZO-1表达（胞膜蛋白，正常对照400*）
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wh2008 edited on
冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程中可能会对抗原的性质造成影响。4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。
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wh2008 edited on
如何避免荧光素提前衰退？1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。
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普通荧光显微镜的操作指南和注意事项？1、操作指南：（1）关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯。为延长汞灯的使用寿命，汞灯开启不到15-30分钟的请在15-30分钟后关闭汞灯。再次打开汞灯电源的间隔时间也应该在15-30分钟以上，避免反复开关。（2）根据样品荧光素选择相应荧光组件。使用减光片对荧光强度适当调整（因为荧光强度不可调，所以只能使用各种减光片来调整观察效果）（3）选择滤光片。常用的有绿、蓝、紫、紫外等，分别对应不同的激发光波长。（4）放好染色切片，找到合适的视野。在荧光状态下观察标本，标本内的荧光会较快的衰减，所以要避免长时间的在荧光下观察，可以先在明场下调整好要观察的位置再使用荧光。（5）需拍照先确认照相机已装好。（6）使用结束关闭所有电源并做好使用记录。 （7）如需详细说明，请借阅说明书。2、主要事项：（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5~15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。（3）防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。（4）检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h。（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后。（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。（7）荧光亮度的判断标准：一般为四级，即“—”——无或可见微弱自发荧光。“+”——仅能见明确可见的荧光。“++”——可见有明亮的荧光。“+++”——可见耀眼的荧光。（8）所使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油。 （9）电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
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如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？产生原因：（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。（6）荧光素不纯、标本固定不当等。（7）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。消除方法：（1）购买高质量、高纯度的荧光素二抗。（2）二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。（3）调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。（4）增加清洗次数和延长清洗时间。（5）延长血清封闭时间。（6）适当稀释二抗浓度至出现特异性染色阳性，而非特异性染色保持阴性。
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一抗孵育的条件和浓度如何摸索？1、孵育条件选择：根据大量外文文献参考，4度过夜的最多，37度或直接室温的较少。故可以按照4度过夜+室温或37度复温（增进抗体抗原结合和防止脱片）。2、组织切片的选择：仅选择某一组同一只动物标本，这样才有可比性，且最好是预想肯定阳性的组别中的动物切片。3、一抗浓度摸索：主要参照说明书推荐的浓度，并结合文献中对于某种组织的大概浓度范围，同时也要考虑不同公司之间同一抗体的浓度和效价的不同。从最高浓度向低浓度方向多摸索几个梯度，等浓度摸索好后，在大量的做不同组别的切片。
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再发一张200*ZO-1（正常对照）
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而染毒组ZO-1表达明显减弱：
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你知道北京什么地方可以花钱做荧光免疫组化吗？
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LZ的片子做的很漂亮！我也是用肝的冰冻切片做免疫荧光，发现在FITC和TRITC通道上有很强的自发荧光，集中在胞质。不知道LZ遇到过没有，有没有什么解决的办法呢？
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弱弱的问一下4度过夜具体是几个小时啊？
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star1985renfei 你知道北京什么地方可以花钱做荧光免疫组化吗？我在合肥，不好意思。
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xiaofei20086 弱弱的问一下4度过夜具体是几个小时啊？我一般14h—24h左右，但是我还复温30min-45min。
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CPRCPRCPR LZ的片子做的很漂亮！我也是用肝的冰冻切片做免疫荧光，发现在FITC和TRITC通道上有很强的自发荧光，集中在胞质。不知道LZ遇到过没有，有没有什么解决的办法呢？自发荧光可能原因有：（1）游离荧光素残留在二抗中，故新买的二抗最好进行透析或层析除去游离荧光素 ，尽量买高质量的二抗。（2）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之相应抗体结合。通过延长血清孵育时间来封闭非特异性抗原。（3）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。（4）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。（5）适当稀释二抗浓度至出现特异性染色阳性，而非特异性染色保持阴性。
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wh2008 如何避免荧光素提前衰退？1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。请教：1. 对于二抗的操作，如何进行避光？把房间的窗帘拉下来吗？黑暗的环境下岂不是影响操作？2. 抗荧光萃灭的封片液购自哪家公司？3. 指甲油怎么封？是用甘油封片后再用指甲油在盖玻片周围封起来吗？请楼主百忙之中抽出时间不吝赐教，先谢了！
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savid888 请教：1. 对于二抗的操作，如何进行避光？把房间的窗帘拉下来吗？黑暗的环境下岂不是影响操作？2. 抗荧光萃灭的封片液购自哪家公司？3. 指甲油怎么封？是用甘油封片后再用指甲油在盖玻片周围封起来吗？请楼主百忙之中抽出时间不吝赐教，先谢了！ 1、对于二抗及其后续操作尽可能注意避光。关掉日光灯、稍微拉下窗帘以及孵育或浸洗时可以用黑色袋子/锡箔纸罩住即可。2、我的购自碧云天，其实进口也有卖的，我当时认为我的片子一般都是做过之后即拍照，就没有必要买贵的。3、片子做好后，先用封片液封好片，立即拍照（注意封片液的量不要太多、平拿平放），之后再用指甲油在盖玻片周围封起来即可。
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非常感谢。
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谢谢分享宝贵经验，想请教楼主一个问题。对于免疫荧光的染色，一抗和二抗的浓度一般都有最佳稀释度，这个怎么判断？那么如果浓度过高活过低会有什么影响？比如说，一抗说明书推荐用1：200， 我用1：50或者1：500会出现假阳性吗？
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理论上有个棋盘法可以判断的，不过我认为这个也不是那么绝对的。不管哪个浓度，只要你材料的目的部位有阳性而背景是阴性的就行了，所以要多试试几个抗体稀释度。不知道楼主有什么好方法。
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savid888 理论上有个棋盘法可以判断的，不过我认为这个也不是那么绝对的。不管哪个浓度，只要你材料的目的部位有阳性而背景是阴性的就行了，所以要多试试几个抗体稀释度。不知道楼主有什么好方法。哦，谢谢你的指点。情况是这样，我要研究一种新蛋白的表达定位，不知道它应该表达在什么位置上，之前用过高浓度的一抗和低浓度的一抗，表达位点有差别，所以你说的目的部位有阳性而背景是阴性对于我这种情况来说不太适用，这样，我把结果贴几张。红的是我要标记的蛋白，蓝的是细胞核。大部分红的都在细胞核外周，但是有一张图片红的蛋白确有少量出现在细胞核内。我就不知道这到底是不是信号，而这个结果确会关系到截然不同的两个结论
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stonebreaker_yu edited on
这张红的信号也在细胞核外
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1、理论上，免疫反应有前带(prezone)：抗体过量，抗原和抗体结合率低；后带(postzone)：抗原过量，抗原和抗体结合率低；等价带(equivalence zone)：抗原和抗体比例合适，抗原和抗体结合率最高。2、我在实践中，一般新做一种抗体时，先看看说明书推荐一抗孵育浓度，并结合大多数文献提及的有效浓度，然后设计一个高浓度和低浓度来做，根据结果再做相应的微调。二抗一般文献比较一致。3、初次做一种新抗体，建议一定要做PBS阴性对照，因为免疫组化/免疫荧光最大的优势就是细胞定位，而不做阴性对照，很难确定真实结果。
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但是这张，有少量红的信号出现在细胞核内了，事态严重了，我迷茫了
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wh2008 1、理论上，免疫反应有前带(prezone)：抗体过量，抗原和抗体结合率低；后带(postzone)：抗原过量，抗原和抗体结合率低；等价带(equivalence zone)：抗原和抗体比例合适，抗原和抗体结合率最高。2、我在实践中，一般新做一种抗体时，先看看说明书推荐一抗孵育浓度，并结合大多数文献提及的有效浓度，然后设计一个高浓度和低浓度来做，根据结果再做相应的微调。二抗一般文献比较一致。3、初次做一种新抗体，建议一定要做PBS阴性对照，因为免疫组化/免疫荧光最大的优势就是细胞定位，而不做阴性对照，很难确定真实结果。谢谢指点，对于你说的第2点，我做的蛋白抗体没有推荐浓度也没有几篇文献，所以在摸索浓度的时候，我很难根据结果进行判断，就像我上面发的3张图片，我不知道该选那张图片作为最终结果，因为下一步还要做免疫电镜进行亚细胞结构的蛋白标记，要与荧光结果对应，所以荧光的结果对我尤为重要，我再做几次看看。还想请教你另一个问题，根据你的经验，像你说的前带和后带的情况，是不是这两种结果的荧光效果都不如等价带？也就是说可能出现有的抗原位点标记不上？多谢！
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-------------------------------------------------------------------------------- 我做的是细胞爬片免疫荧光方面的课题，问一下楼主细胞爬片免疫荧光的具体步骤是什么？我要检测膜抗原，
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您好，我很想知道你的7个问题的答案。问题：1、石蜡切片能否做免疫荧光染色？2、冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？3、一抗孵育的条件和浓度如何摸索？4、二抗孵育条件、浓度以及其它要点是什么？5、如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？6、如何避免荧光素提前衰退？7、普通荧光显微镜的操作指南和注意事项？可是看不到，请问在哪里可以看到？？谢谢
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不好意思哦，我已经看到前面的分析了，我开始不知道为什么看不到这些！谢谢LZ，我想请问一下lz，我做的也是免疫组化的免疫荧光，FITC，我使用的抗体全部是武汉博士德公司的，听说国外不承认博士德公司的抗体，文章发不了国外的期刊，请问是否是这样？？会不会不承认啊？非常感谢！
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wh2008 我一般14h—24h左右，但是我还复温30min-45min。请问复温是否效果好呢？？
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丁香园准中级站友
为消除非他异性荧光，多建议常规采用伊文蓝衬染，使背景为红色，与黄色荧光成为鲜明对比，是不是就是说，荧光二抗不能选用罗丹明等红色荧光标记的呢？如果荧光二抗选用罗丹明，又用伊文蓝衬染的话，是什么样子的呢？
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biancheng2007 不好意思哦，我已经看到前面的分析了，我开始不知道为什么看不到这些！谢谢LZ，我想请问一下lz，我做的也是免疫组化的免疫荧光，FITC，我使用的抗体全部是武汉博士德公司的，听说国外不承认博士德公司的抗体，文章发不了国外的期刊，请问是否是这样？？会不会不承认啊？非常感谢！不会的，从我们课题组发的SCI文章投稿中，好像没有人提这个问题，不过我们没用国产公司抗体。我个人认为只要你的试验图片染色很好就行了，至于那家公司是可以变通的，但图片不能造假呀。
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不好意思问一下：做免疫荧光时，标本的放置时间有限制吗？脑组织在4%甲醛里放了10多天了，还能作吗？谢谢指教啊！！！
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请教下楼上的高手们，我想做的是免疫荧光双标法，二抗的荧光素标记配合分别是cy5和FITC以及cy5和TRITC，我想问问以上这两种配合可以吗？荧光之间会不会产生干扰
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固然免疫染色的方法及过程非常重要，直接影响到检测结果的好坏。但是检测技术也是非常重要的。不知诸位有没有听说过--多光谱成像技术，此技术使“多信息数据挖掘”成为现实。我们可以同时获得多个分子靶点的形态学信息、空间分布信息以及定量信息，从而可以获得各分子靶点间的相互关系信息。多光谱成像技术可以解决如下困难：1，完全去除自发荧光2，多分子靶点进行同时标记检测（包括明场的检测），共定位分析可以获得各个靶点之间的相互关系信息。结果如下：自上而下分别为：甲醛固定的前列腺组织特异性膜抗原（525nm的量子点标记）；肝脏组织切片（Hoechst标记细胞核，AF488标记细胞膜，Cy3标记细胞质）；淋巴细胞在分化的过程中生发中心相关靶点的标记（均为量子点标记））
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各靶点信号单独分离后的结果如下：
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关于丁香园“神奇动物”花絮彩蛋强整理：那些你想知道的、你不知道的都在这里。|界面新闻o娱乐&神奇动物&你们都有去看么？在这庞大的魔法世界，还隐藏了太多的伏笔与彩蛋，你们都注意到了没有。这次，特意邀请了资深哈波粉丝食素的夜骐帮大家整理了这篇&神奇动物&的彩蛋花絮集，那些有趣的彩蛋，好玩的花絮，以及各种你们渴望知道的东西，都在这里：
刷完《神奇动物在哪里》的午夜场、首映日，各位巫师盆友们有没有被回家的幸福感淹没？
这次主角变了，神兽变了，但罗琳大神一个伏笔埋十年的习惯没有变！还是那个原汁原味的纯血统魔法世界。乍看之下《神奇动物在哪里》在展示一个新世界设定，骨血里却把《哈利&波特》的一条呼声很高的支线剧情串完整联起来了&&
　　1.格林德沃是伏地魔的前辈
看完电影才发现，原来男主角纽特找神兽只是幌子，一切都在为黑魔王格林德沃出场做铺垫。格林德沃绝对算得上伏地魔的&前辈&，他是魔法世界的上一代大魔头。
与《魔法石》电影里的伏地魔一样，格林德沃只闻其名不见其人，尽管在巫师舆论界怒刷存在感，可本尊出场只有开头与结尾两次，共计两句台词。
　　2.纽特为什么不用幻影移形去纽约？
电影里我们一次次看到主角们施展幻影移形的魔法，从一个地方突然消失去往另一个地方。那么肯定有人好奇，为什么一位闯荡江湖的资深英国巫师非要走麻瓜海关，坐轮渡漂洋过海去纽约呢？
罗琳最近在推特上解答了这个问题。首先，幻影移形是有距离限制的，随着距离的增加成功难度更大，尤其是这种跨国境转移危险更大。按照《哈利&波特》原著描述，幻影移形失败会造成&分体&，强行幻影移形的结局很可能是你的上半身到了美国，下半身还留在英国。
在电影开头闪过的N张报纸中，有一个头条是&美国禁止饲育魔法动物&，因此纽特其实是带着一箱违禁品闯入美国的，比起美国巫师们，麻瓜安检自然更好骗。此外，这一箱子神奇动物本身也具有魔法，幻影移形对它们造成的影响也无法预知。风险这么大，不如低调点坐船。
3.死亡圣器项链什么来头？
&死亡圣器&代表着隐形衣、复活石与老魔杖这三件魔法宝物，传说中掌握死亡圣器就会拥有打败死神的力量。整个概念虽说是在《哈利&波特》完结篇才提出来，但死亡圣器的元素其实贯穿了整个系列：哈利祖传的隐形衣就是三件死亡圣器之一；邓布利多也一直是老魔杖的拥有者。
《哈利波特》系列写到格林德沃与邓布利多在年轻时曾经痴迷研究死亡圣器的传说，邓布利多在给格林德沃写的信里，都会把名字首字母的A里画一个死亡圣器，作为两人的秘密记号。后来，格林德沃与他的追随者以死亡圣器作为标志，如同伏地魔的黑魔标记一样。
《神奇动物在哪里》中，伪装成格雷夫斯的格林德沃，就把信物死亡圣器项链交给克雷登斯换取信任，同时也给最后揭晓真身埋下伏笔。
4.邓布利多的妹妹也有默默然？
2001年，罗琳在出版《神奇动物在哪里》课本的时候构想了一个名叫&默默然&的魔法世界出版社，纽特&斯卡曼德环游世界写下这本书正是由他们出资赞助的。
电影里，默默然（Obscurus）成了年轻巫师因压抑魔法能力而催生出的黑魔法能量，它们依赖宿主巫师而存在，具有随时爆发的可怕攻击力，好似一颗不定时核弹。有默默然附身的克雷登斯很容易让人联想到邓布利多的妹妹阿丽安娜。
书中写道阿丽安娜在6岁时魔法能力突然爆发袭击了麻瓜小男孩，邓布利多一家害怕她再度失控，从此把她雪藏起来，还对外宣称她是&哑炮&，即出生在魔法家庭却不会魔法的人。
1899年，当热血青年邓布利多与格林德沃处在友谊蜜月期的时候，两人因一次激烈争执导致在场的阿丽安娜情绪爆发在魔咒混战中不幸死亡，从此刻起，邓布利多与格林德沃彻底决裂。
5.格林德沃为何远渡美国找默默然？
在电影故事发生的1926年，43岁的格林德沃刚起事，妄图让世界臣服在巫师脚下。他虽然拥有一批支持者，但尚未在欧洲建立起稳固的统治权，距离权力与魔法能力的巅峰还很遥远。
为寻找大规模恐怖袭击武器，格林德沃也许从邓布利多妹妹的身上得到了灵感。电影里，扮成格雷夫斯的格林德沃多次诱导克雷登斯，向他描述自己看到的未来：&我清楚地看到，这孩子与你养母走得很近，我看到将来你和我并肩而立......&
这种神棍画风，让人不禁联想到《哈利波特》里特里劳妮教授的著名预言：&那个拥有征服黑魔头能量的男孩走近了，他出生在7月末......&格林德沃赴美寻找武器的动因，或许会引出另一段贯穿《神奇动物》系列的预言。
　　6.美国魔法世界有多落后？
英美魔法世界的文化差异可不只是美国人把麻瓜（不会魔法的人）叫做麻鸡（No-Maj）。借用纽特的话就是：&你们对待麻瓜的态度太落后了&。美国巫师从来都是隐姓埋名低调生活，不敢在麻瓜/麻鸡世界显露魔法，一不小心就会被狂热猎巫人士追杀。巫师界也有一批叛徒会收非魔法人士的赏金，用法术来追捕自己的同胞。
为了让魔法世界远离暴露真身的风险，巫师政府美国魔法国会（简称MACUSA）设立了一系列条款约束巫师行为，包括要求所有巫师注册自己持有的魔杖（映射枪支管控法规）、不允许饲养神奇动物（太容易制造关注度）、不许与麻瓜/麻鸡交朋友或者通婚等等。影片开头以及MACUSA总部里出现的报纸头条都暗示了美国巫师这样严苛的生存环境。
7.美国魔法国会看着很面熟？
美国魔法国会（MACUSA）职能相当于英国魔法部，但是内部要高大上很多。至少员工不用刻意钻进电话亭，或者从马桶把自己冲进去，他们可以混迹在街头人群中，从现实世界里纽约的天际线伍尔沃大厦的旋转门进入MACUSA总部。据说罗琳选中这里的原因是伍尔沃大厦入口上方有一只猫头鹰塑像，这是哈利&波特魔法世界的代表元素。
MACUSA的圆形徽章上刻着全称Magical Congress of theUnited States of America，跟美国麻瓜/麻鸡政府的星条旗+山鹰标志不同，美国巫师政府是星条旗+凤凰的设计。MACUSA标志上（包括被凤凰翅膀环绕的那些）一共出现了48颗星星，这是因为1926年的时候，阿拉斯加跟夏威夷还没有加入美国。
MACUSA总部的设计有很多地方会勾起大家对《哈利&波特》的回忆。比如大厅的天花板与霍格沃茨一样是看不到穹顶，只显示天气；悬在中空的挂钟跟韦斯莱家的挂钟似的，不会做只是显示时间这么平庸的小事，而是根据魔法世界暴露等级来转动指针；MACUSA大厅内与英国魔法部一样，挂着时任主席或部长的巨幅画像。
电影中的MACUSA主席来头不小，罗琳此前撰写过北美魔法历史，曾提及这位赛拉菲娜&皮克科瑞女士是十年难得一遇的天才少女，执行力与决断力也非同一般，难怪面对格林德沃的凶猛攻击还能面不改色心不跳。
8.巫师联合国影射二战欧洲？
亨利&肖被默默然猎杀之后，国际巫师政府代表团集体出现在MACUSA开大会。其中认出纽特的巫师就是时任英国魔法部部长赫克托&法奥利，法奥利向来轻视格林德沃的威胁，他的不作为助涨了格林德沃在欧洲发展壮大，罗琳创作角色也是有意影射二战时期纵容希特勒的英国首相张伯伦。
9. 纽特皮箱照片里的妹子是谁？
纽特在随身带着一位姑娘的照片，从电影里我们知道她叫做丽塔&莱斯特兰奇。这个姓氏可是《哈利&波特》时代伏地魔最忠实追随者贝拉特里克斯的夫家姓氏。莱斯特兰奇是英国声名显赫的纯血统家族，与马尔福家族一样与黑魔法有扯不开的关系。按照辈分，丽塔应该与贝拉的父母是一代人。
奎妮读到纽特的心思之后，断定丽塔是一味索取的自私性格。然而她也是纽特在霍格沃茨念书期间唯一的朋友。
影片中，格雷夫斯在审问纽特时提到他因为接触神奇动物伤害别人而被霍格沃茨开除，怎么看人畜无害的纽特也不像会做出这种事的人，最近罗琳终于透露了纽特被开除的原因：&他是替别人顶包而被开除的&，这跟《哈利&波特与密室》里被冤枉的海格如出一辙。不难揣测，丽塔很可能就是导致纽特离开霍格沃茨的原因。
另外，被霍格沃茨开除之后，连同魔杖都会被折断。海格当年曾偷偷把断魔杖修好伪装成雨伞，为什么纽特得以保留自己的魔杖呢？罗琳表态这也是她埋得线索，个中缘由会在之后的故事里真相大白。
纽特告诉雅各布，一战时期他曾与乌克兰铁肚皮龙一起战斗。这种火龙在《哈利&波特与死亡圣器（下）》电影出现过，哈利、罗恩与赫敏曾闯入乌克兰铁肚皮看守的莱斯特兰奇家族地下金库，并在那里找到了伏地魔魂器之赫奇帕奇金杯，最后三人组骑着巨龙掀翻了巫师银行古灵阁的屋顶。七十年后这支金库看门龙与纽特当年打仗时的&战友&或许有渊源。
10.最好的魔法学校在哪里？
《神奇动物在哪里》告诉我们原来美国也有霍格沃茨一样的存在&&伊法魔尼魔法学校！奎妮与蒂娜姐妹就在那里毕业，深深以为伊法魔尼是世上最好的学校。
其实，伊法魔尼是一位霍格沃茨迷妹来到美国之后创建的。伊法魔尼的创始人名叫伊索特&赛尔，是霍格沃茨四大创始人之一萨拉查&斯莱特林的后裔，伊索特从小被痴迷黑魔法的姑妈囚禁，不允许她去霍格沃茨学习魔法，后来她逃往美国，参照心中对霍格沃茨的期待创建了伊法魔尼。
11.格林德沃如何暴露身份？
纽特不仅擅长观察动物，也擅长观察人类。格林德沃假扮的格雷夫斯在MACUSA审问纽特的时候露出了破绽。
美国的傲罗部长为什么会知道一位默默无名的英国巫师被开除的破事？为什么会对邓布利多与纽特的关系一清二楚？为何会觉得失去宿主的默默然&没有利用价值&？与邓布利多私交不错的纽特可能也知道阿丽安娜那段往事，地铁站的战斗中，纽特被假格雷夫斯暴虐，再看他宣扬的那番言论，所有信息加在一起让纽特对他产生怀疑。
12.纽约麻鸡是怎么被清除记忆的？
电影尾声处，雷鸟在暴雨中混入了蜷翼魔的毒液，毒液经过雨水稀释将纽约麻鸡对魔法的不快记忆清除掉了。
所有被清除记忆的麻鸡都是直接或者间接被雨水触碰，很多是直接淋雨（比如雅各布），有些没淋雨的通过喝水喝或者洗澡（银行家宾利先生）等方式接触到经过过滤和管道循环的记忆消除水，最终忘记了这两天内发生的一切。
【散养彩蛋】
1.开头和片中曾三次响起&哈利&波特&系列最著名的音乐符号&&海德薇的主旋律片段
2.纽特在过海关的时候，把皮箱调节成麻瓜可见的模式，箱子内出现了一条黄黑相间的围巾，这是他在霍格沃茨就读赫奇帕奇学院的标志。
3.魁地奇梗：纽特刚到纽约就撞上二次塞勒姆反巫师集会，玛丽&露&拜尔本问他&你是位寻找者吗？寻找真理？&（Are you a seeker？a seeker of truth?)
Seeker除了寻找者的意思之外，还代表魁地奇比赛里的&找球手&（负责抓金色飞贼，比如哈利在格兰芬多队的角色），纽特误以为在说魁地奇，就回应道：&我更像是追球手&（I'm more of a chaser），chaser在魁地奇比赛中代表追球手（负责把红色鬼飞球投入圆框得分），同时也有追求者的意思，所以纽特的回答也不会被麻瓜误解，他们听到的意思是&我更像是追求者&。
4.一些在《哈利&波特》电影里出现过的神奇动物与魔法生物也在片中客串了，纽特箱子中有《火焰杯》三强争霸赛第二个项目出现过的水怪格林迪洛，纽特一行在地下酒馆里出现了独自饮酒的巨怪和招待员家养小精灵，酒馆的老板跟对角巷巫师银行的业务员同属于妖精一族。
5.梅林很忙：大魔法师&梅林&的名字是英国巫师最喜欢的感叹词前缀，被滥用程度如同麻瓜语言中的&上帝&二字。&梅林保佑&&梅林的胡子&&仁慈的梅林啊&都是常见口头禅，《混血王子》变成沙发的魔药教授被邓布利多一下戳穿就喷出了感慨词&梅林的胡子&，这也是纽特喜欢用的口头禅。蒂娜等美国巫师口条词语则是&仁慈的刘易斯啊&&莫里根保佑&这些类似词组。
6．在罗琳的原著设定里，纽特&斯卡曼德的孙子娶了哈利的同学卢娜。
【接下来怎么拍】
1.罗琳透露纽特&斯卡曼德还是续集主要人物，第二部蒂娜、奎妮与雅各布都会回归。续集中德普扮演的格林德沃戏份会加重，年轻时代邓布利多即将亮相，目前正在选演员。第二部会有邓布利多与纽特的对手戏。
2.死亡圣器之一的老魔杖会在续集中出现，第二部会有来自中国的神奇动物出场，罗琳表示并不是火龙。
3.未来还有四部《神奇动物》续集等待上映，片名会是《神奇动物XXX》，保持《哈利&波特》系列《哈利波特与XXX》的统一风格。
4.《神奇动物》五部曲的故事时间将横跨19年（罗琳偏爱使用的周期数字），也就意味着最后一部电影会在1945年结束，在哈利波特魔法世界的编年史上，这一年发生了震惊巫师界的邓布利多与格林德沃旷世大决战。
5.接下来的故事以英国和法国为主，美国魔法世界不再是叙事主线。
6.第二部《神奇动物》电影将在明年上半年开拍，2018年11月上映，依然由大卫&耶茨导演，罗琳创作剧本。
来源：桃桃淘电影原标题：更多专业报道，请
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