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细菌基因组DNA提取方法
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磁珠法提取血浆DNA时,裂解液,结合液,洗脱液分别指什么
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基金检测之磁珠法提取核酸过程中常见的五种误区
以生物作为提取核酸的主要介质，相比于常见的氯仿抽提法和离心柱法，磁珠法的使用还存在很多误区，主要有以下几种表现：误区一：试剂量越多，提取结果越好裂解效果不好？多加点裂解液。洗涤效果不好？多加点洗涤液。这是很多客户在使用试剂盒中的惯性思维。但是对于法而言，每增加一部分液体体积，就减少了更多的磁珠碰撞几率，而降低磁珠碰撞几率，会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候，虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用，但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，无法保证磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的，所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定完全有效。以行业内GNT-B02全血基因组DNA试剂盒而言，一般裂解液使用量不应超过400ul/次，洗涤液使用量不应超过500ul/次。如果确实需要放大体系，和样本用量也应该相应增加，这种放大不一定是等比例的。误区二：越多，提取效果越好很多操作人员在提取效果不佳的时候，首先考虑的用量，认为磁珠量大，就能吸上更多的核酸，不得不说这种想法是错误的。磁珠的主要特点是既可以分散于液体中，磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的，也就是所谓的上限比例，过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中，而丧失其分散的特性，也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。而过量的磁珠也会吸附更多的杂质，对于除杂的效果影响非常大。甚至有些时候，过多的磁珠会吸附蛋白酶、等在液体体系中起主要作用的功能成分，导致整个试剂盒效率低下。有很多时候，在提取效果不佳的时候，减少磁珠使用量，反而是提升提取效果的最优途径。以GNT-02系列为例，在提取常量样本（植物组织，全血等）时，通常用量为10ul/次；在提取微量样本（如血清游离DNA，口腔拭子等）时，磁珠用量为15~20ul/次。如需超过这个使用量，需要和技术工程师进行沟通。误区三：样本取用的越多，提取效果越好在样本不够新鲜或者核酸含量本身就很少的情况下，往往核酸提取效果不好，很多老师就会采用多取样本的方式增加核酸提取量。但简单地增加样本取样量，有时会引入过多的杂质，超出裂解液裂解能力，也会使提取效率降低，所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低，建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的完全性，使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。误区四：洗涤次数越多，提取效果越好提取得到的核酸杂质过多时，使用者会考虑多进行几次洗涤，以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸，但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸，且增加了核酸断裂水解的可能性，所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。GNT系列的试剂盒，单一纯化类试剂盒的洗涤次数为2次，植物、动物类试剂盒的洗涤次数为3次，血液类试剂盒洗涤次数为3~4次。误区五：某品牌好，就应该在所有试验中效果都好的种类是多种多样的，粒径大小不同，分散性不同，磁响应时间不同，包被基础基质不同，外层修饰官能团不同，包被密度不同，官能团臂长不同，会导致磁珠特性千差万别。所以不同磁珠所适应的实验和体系也是不同的。就像同样是核酸提取的试剂，配方也并不完全相同，同样应用于核酸提取的磁珠，性质也并非完全一致。有的磁珠在常量核酸提取中表现出了更高的吸附效率，有的磁珠更适用于微量核酸提取。有的磁珠适合偏酸性系列的试剂体系，有的磁珠适合偏碱性系列的试剂体系。有的磁珠磁响应性好但是沉降速度快，更适合磁棒式自动提取仪；有的磁珠沉降速度慢但是磁响应时间长，更适合移液式自动提取仪。很少有一种磁珠能适用于所有实验的情况，除了固定的试剂盒配合，多数情况下，磁珠和试剂体系都要做一定时间的配合调整。厂商除了提供和试剂盒外，也要提供磁珠提取技术服务，包括帮助客户调整磁珠的用量和试剂的细节，让客户能够找到更适用的体系获得最佳的实验效果。
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保存至快速回贴　　赛默飞世尔科技推出的Thermo Scientific KingFisher 磁珠纯化技术是新一代样品纯化技术，在 KingFisher系统上利用转移磁珠的纯化方法，从普通样品如：血液、动植物组织、细菌、细胞、病毒；以及疑难样品如：唾液、土壤、粪便、FFPE、法检等样品中，自动化快速提取高产量、高质量、高完整度的DNA、RNA样品。KingFisher 磁珠纯化技术及KingFisher自动磁珠纯化仪，除了在核酸纯化领域有卓越的表现外，作为开放的平台，根据试剂盒种类不同，KingFisher 也出色应用于蛋白质纯化、免疫细胞分选、细菌富集等领域。
随着分子生物技术的发展，科研及临床检测要求的提高，核酸纯化方法也经历了密度梯度离心，酚氯仿、苯酚、异戊醇抽提，二氧化硅吸附等化学物理方法。目前，基于硅胶膜对核酸特异结合的原理所开发的方法已成为核酸纯化的主流方法。为了减少化学、物理因素对核酸的破坏和降解，科学家们力求开发快速、温和的纯化方法，在确保遗传信息的完整性同时，提高工作效率。而KingFisher磁珠纯化法不仅满足了科研工作者对核酸质量的高要求，同时其自动化、通量高、速度快、灵敏度高的特性也提高了科研工作者的工作效率。目前转移磁珠的磁珠纯化方案正在逐步替代以往的各种方法，特别是目前普遍应用的离心柱法。
酚法抽提、玻璃珠沉淀法、离心柱法与磁珠法：
经典的核酸纯化法采用酚、氯仿抽提，样品经过处理后分为水相和有机相，通过酒精离心沉淀水相中核酸的方法纯化样品中的核酸，这就是我们所说的酚-率氯仿抽提法。酚法抽提相对稳定，至今仍被多数科技工作者广泛应用，也是其他多种提取方法的操作基础。
随后，科学家发现核酸与硅存在特异结合，并开发了用玻璃珠吸附核酸，离心沉淀后经过洗和洗脱得到纯化的核酸样品，因玻璃珠比重较大，容易离心到管底，从而缩短了离心时间，目前此方法仍被部分实验室采用。
后来科学家将玻璃珠改成玻璃纤维，并将玻璃纤维制成薄膜状，置于离心管中层，用离心的方法从裂解液中吸附，这就是目前核酸纯化的主流方法--离心柱法。离心柱法极大简化了操作流程、缩短操作时间，目前已成为大多数实验室主流纯化方法；但离心柱法样品与硅介质结合时间短，样品回收率低，并对样品有一定的损伤。&
图1 基于离心法的核酸纯化
以上提到的三种方法都是需要离心操作的纯化方法（图1），每一批样品的提取都涉及到开关离心管盖、废液处理、加液的操作，不仅引入了人为误差，也容易在大批量样品处理时造成交叉污染。而应用磁珠纯化技术，则可以利用磁铁特异吸附磁珠（图2A），从而省去离心操作，减少人为操作环节，避免人为误差，不仅节省时间，同时使高通量纯化成为可能。
&图2 磁珠纯化的原理及转移液体、转移磁珠的设计
Thermo Scientific KingFisher转移磁珠纯化方案的专利设计无论离心柱过滤法还是磁珠法，都是基于硅介质与核酸特异结合的原理而发展起来的。离心柱法所采用的硅胶膜实际上就是玻璃纤维，而磁珠之所以能够结合核酸也是因为其表面包被了玻璃纤维。而磁珠纯化法本身也经历了转移液体的磁珠纯化和转移磁珠的磁珠纯化两个阶段。
最初的设计是用磁力架将磁珠吸附在管内壁，随后将不含磁珠的液体吸走，达到结合、洗涤、洗脱的目的（图2B）。但转移液体需要吸头移液操作，首先会有大量的液体残留，其次吸液时会损耗一些磁珠，降低磁珠回收率，再者吸液操作的废液处理及移液过程中容易产生交叉污染。
为了弥补转移液体方案的不足，赛默飞世尔科技开发了一种转移磁珠的纯化方案。与转移液体的方案不同，转移磁珠方案用磁力棒吸附、转移磁珠，省去了移液操作，缩短了由移液带来的操作时间（图2C）；同时在保证磁珠完全回收转移的同时，使液体残留量降至最低水平；从而提高了样品纯度和后续检测灵敏度。
公司的研发团队将这种技术命名为KingFisher技术 （专利号US 6447729, US 6448092）。KingFisher在英文中是翠鸟的意思，美国的动物行为学家发现，KingFisher（翠鸟）可以从复杂的河流环境中捕食自己喜欢吃的鱼类，而磁力棒吸附、转移磁珠的操作就像KingFisher从河中捕鱼一样，因此将这种技术命名为KingFisher磁珠纯化法。
Thermo Scientific KingFisher磁珠纯化仪的超强兼容性与延展性KingFisher磁珠自动纯化系统是一套完全开放的体系，几乎兼容所有市面上可以查到的，进口及国产基于磁珠法的纯化试剂盒，如：OMEGA、Qiagen、Ambion、Invitrogen、Invitek等进口品牌，以及天根、博坤、易瑞等国产试剂盒。应用这些多种多样的试剂盒，研究人员可以方便的从普通样品如：血液、体液、动植物组织、培养细胞、细菌等，以及疑难样品如：土壤、粪便、毛发、FFPE、唾液、法检痕量样品中，自动化快速提取高产量、高质量、高完整度的DNA、RNA样品。在 KingFisher Flex 系统上利用磁珠纯化方法提取的核酸样品可以直接进行核酸定量、实时荧光定量PCR仪检测、测序、芯片检测等下游实验，无需再纯化。从样品到纯化产品，只需15-45分钟（根据样本类型和试剂盒程序略有不同），并且可与其它仪器（包含第三方仪器）整合，提供无限扩展空间和真正意义的实验室自动化。
&图3 磁珠核心结构。KingFisher系列产品可以帮助科技工作者从复杂的各种类型的原始样品中，精确提取所需要的目的分子或细胞。
值得注意的是，KingFisher磁珠纯化仪所能做的事情绝不仅限于核酸提取，应用不同包被物包被的磁珠，可以从复杂的样品中提取高纯度的NDA、RNA、蛋白、抗体、细菌、细胞等（图3）。也可以根据不同的用户需要，在磁珠表面标记所需要的诱饵分子，从复杂的样品中钓取所需的单一目的分子或细胞。
Thermo Scientific KingFisher系列磁珠自动纯化仪目前，KingFisher磁珠自动纯化系列产品主要拥有15个样品通量的“KingFisher mL”；24个样品通量的“KingFisher”；和兼容24/96个样品通量的“KingFisher Flex”，可以满足不同样品数量用户的样品处理需求（图4）。KingFisher系列产品可以在15-45分钟内完成多达96个样品的平行纯化处理，在高通量的基础上保证样品纯度和检测灵敏度。
&& 图4 KingFisher系列产品成员
KingFisher磁珠纯化仪作为一种新型的纯化方案，已经成为一种科研以及应用趋势，逐步取代以往的柱法提取，目前已风靡欧美。至今在中国市场，KingFisher纯化仪也已经被各地高校、研究所、各科研机构、大批量种子检测、疫病监控、流行病控制、血液初筛、血库建库、高通量基因测序等机关、部门、企业广泛采纳，逐步成为核酸提取的主流应用方法。
应用实例1、KingFisher的磁珠回收率：KingFisher 96 DW Plate板型与加热块匹配嵌合的独特设计也保证加热的最大效率。如果用其它型号的96孔板，热块会抬升板底高度，从而影响混匀操作甚至造成仪器不稳定性。实验数据表明96 DW Plate的磁珠回收率比其他96孔板的回收率更高。使用96 DW Plate进行磁珠孔到孔的水平转移，其回收率高达99.4%（图 5）。
&图5& KingFisher 96 DW Plate与其它型号96-well Plate对比。上图：KingFisher 96 DW Plate (a) 与加热块的吻合，b. c. d.为其它型号的96-well Plate；下图：磁珠回收率对比，KingFisher 96 DW Plate回收率大于99.4%。
2、血液DNA提取：用ThermoFisher Scientific “KingFisher Blood DNA Kit”从多至3-8 ml全血中提取DNA。产物回收率、纯度、完整度均达到高水平（图 6）。全过程约45-60分钟。
图6 从3 ml全血中提取DNA。左图：24个样品的产量和OD260/280；右图：8个重复样品的提取均一性。（KingFisher Flex 24 DW Plate提取）
3、动物组织DNA提取：应用OMEGA MagSi Tissue DNA Kit，实验者可以方便的从10 mg动物组织中提取样品DNA（图 7）。样品预处理后在KingFisher上的运行时间大约30 分钟。
&& 图7 从10 mg动物组织样品中提取DNA和定量PCR分析。
4、植物组织RNA提取：应用OMEGA MagSi Plant RNA Kit，实验者可以在60分钟内，从50 mg植物组织中，一次纯化96个平行样品（图 8）。
&图8 从50 mg植物组织中提取总RNA。（KingFisher Flex 96 DW Plate提取）
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