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懂质谱的高人请进，质谱分析蛋白质后的结果看不懂
如图，质谱分析结果中，peptide sequence那一行，括号是什么意思，哪一段才是多肽勒
Peptide sequencee
(K)LVNKIQK(L)
这里的括号是什么意思，那这段多肽包括括号里的内容还是怎么？
诶，这个是文献中看到的一张结果图，用的MALDI-TOF跑的，就不太懂旁边括号的意思，因为我们需要肽段
有可能哦，俺也不太懂，俺怀疑要么表示其两端
要么可能是不确定到底是哪个氨基酸，所以打了个括号
你认为哪种可能性比较大啊
是的，之前也有这种猜测，但是不确定，后面比对了前后序列之后，可以确定了，CPN同学貌似对这方面很懂啊，之前俺没有做过相关方面的
诶，这是国外专利上的哦，当时工作需要，看不大懂，在小木虫上问的，俺自己没做，你看联系学校帮做不，一般学校的分析测试中心可以做哦，不知道你工作了还是？
毕业了 也还在学校 联系了几家 有的做不了蛋白质 有个可以做的可是收费忒高了...
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目的 探讨循证外科在腹腔镜胆囊切除术（LC）中的重要意义。方法 回顾性分析3例LC术后黄疸的临床资料。结果 3例LC术后黄疸患者均存在术前循证检查不完善的缺陷。结论 LC术前进行全面的循证外科检查是预防术后黄疸的根本措施。
【关键词】& 腹腔镜；胆囊切除；黄疸；循证外科
&&& 2002年9月～2006年9月我院共完成腹腔镜手术1218例，其中腹腔镜胆囊切除术（LC）手术1007例。LC术后发生黄疸3例，发生率0.3&。分析3例LC术后黄疸病例，发现3例LC手术患者均存在术前循证外科检查不足的缺陷。
&&& 1& 临床资料
&&& 1.1& 一般资料& 本组3例中男2例，女1例。年龄分别为66岁、45岁、35岁。出现黄疸时间分别为：术后3个月，术后2周，术后3天。发生术后黄疸原因分别为：胰头癌1例，胆总管下端结石1例［1］，术前肝功能不全1例。
&&& 1.2& 治疗方法& 第1例LC术后3个月出现进行性加重黄疸，CT扫描及免疫学检测结果，诊断为胰头癌。即行剖腹探查，因腹腔广泛转移无法根治而关腹。第2例LC术后2周出现黄疸，彩超显示胆总管下端结石，遂行EST治愈。第3例LC术后3天出现黄疸，生化检查显示肝功能受损，行护肝综合治疗4周治愈。
&&& 1.3& 结果& 第1例胰头癌剖腹探查术后1个月死亡。其余2例顺利康复。
&&& 2& 讨论
&&& 2.1& 对患者主诉重视不够& LC术前未行深入的循证外科检查。本组第1例为66岁老龄男性胆囊结石患者，术前诉腰背部疼痛，管床医师认为是胆囊结石所表现的一般放射性疼痛，未引起重视，未进行腹部CT扫描。LC术非常顺利。术后患者又诉腰背部疼痛，管床医师认为是手术后的常见现象，同样未进行深入的循证外科检查。导致了遗漏诊断、延误病情的严重后果。
&&& 2.2& 医疗保险经费制约了一些必要的LC术前循证外科检查& 本组第2例为45岁男性患者，术前黑白B超报告为胆囊多发性结石，胆总管内未发现异常。因患者属于医疗保险，要行彩超、CT等深入循证外科检查，则必须提出专门报告，而且检查阴性结果时要扣除医院相应的检查经费。因此LC术未能将彩超、CT等列为常规检查。本例LC术非常顺利。但术后2周出现黄疸，补充彩超检查，诊断为胆总管下段结石，行EST治愈。
&&& 2.3& 迁就患者要求忽略了必要的LC术前循证外科检查& 本组第3例患者为35岁的女性患者，由我院一位科主任介绍而来，要求尽快安排手术，检查从简从快。因此管床医师以朋友义气为重采用了一些患者在当地县医院的检查结果，同样LC术非常顺利。术后第三天出现黄疸、腹水，腹水多时一天达6000 ml。追问病史和补充检查发现患者术前已有肝功能不全。经内科护肝综合治疗，住院4周痊愈出院。
&&& 以上3例LC术后黄疸发生情况各不相同，但有3点完全相同：（1）所有黄疸都与手术本身无直接关系，属于非损伤性黄疸。（2）均没有严格按循证外科原则行医。（3）均给医院带来了不良的社会影响。只要认真吸取这些深刻教训，排除各种干扰，尊重科学，尊重医疗原则，严格按循证外科原则行医，就完全可以避免类似问题的发生［2］。
【参考文献】
& 1 杨镇.循证医学与循证外科.中国实用外科杂志，）：1.
2 陈训如.腹腔镜手术的并发症与对策.昆明：云南科学技术出版社，4.
作者单位：435001 湖北黄石，黄石市第一人民医院日期：日 - 来自[]栏目
【关键词】& 胆囊切除术 超声 腹腔镜
&&& 腹腔镜胆囊切出已被临床广泛应用，其优点是创伤轻微、康复快、病人痛苦轻，住院时间短等。为了手术安全实施降低术后并发症，术前筛选病例甚为重要。本文对我院年期间行腹腔镜胆囊切除术（LC）的300例患者的术前B超诊断与术后结果资料进行分析，探讨超声诊断在LC手术中的临床应用价值。
&&& 1资料与方法
&&& 本组300例，其中男121例，女179例。年龄15～73岁。均为我院住院及门诊的胆囊疾病患者。
&&& 患者术前晨间空腹超声检查，按常规右肋缘下、右肋间在不同体位（仰卧位、左侧卧位、部分患者膝胸卧位）进行纵、横、斜切面作系列扫查，检查胆囊与胆道，作出超声诊断，然后进行LC手术。全部病例均病理证实。
&&& 300例胆囊疾病患者术前超声诊断与术后病理诊断结果见表1。 表1术前超声诊断与术后病理诊断结果从上表可知，各类胆囊疾病术前超声诊断与术后病理诊断的总体符合率达97.7%，说明超声检查能为绝大多数患者进行LC提供明确的诊断依据。在235例术前B超诊断为胆囊结石合并慢性胆囊炎患者中，有10例胆囊壁增厚&0.5 cm，其手术中剥离胆囊床较困难，费时、出血多、术后康复时间长；有6例术前B超检查胆总管轻度扩张内径0.7～0.9 cm，但未见胆总管结石，LC术中发现胆总管下段结石转为开腹手术。有2例B超诊断为慢性萎缩性胆囊炎充满型胆囊结石的患者，因胆囊壁广泛粘连、纤维型钙化，LC手术非常难，改为开腹手术切除胆囊 。在24例术前B超诊断胆囊隆起样病变的患者中，1例手术病理证实胆囊息肉癌变。
&&& 选择手术适应症是LC成功、顺利与否的关键。术前超声检查不仅可以明确胆囊与胆囊内异常回声的位置、大小、形态及胆囊壁的厚度，而且还可了解肝内外胆管有无扩张或结石，为LC术前选择合适病例提供直接的诊断依据。对术前B超检查发现胆总管结石并扩张的胆囊结石患者，应慎做LC手术。据文献报道在术前B超检查胆总管无结石者，开腹胆囊切除术中发现10%左右的患者合并有胆总管结石，而术中意外发现率占 2%~3%，这与术前B超对胆总管下段结石检出率较低有关，但通过改进超声探测方法，可提高检出率［2］。
&&& 胆囊壁厚度与手术难度的关系早已引起人们注意，认为LC手术难度与胆囊壁厚度呈正关系，本文结果支持这一看法。胆囊壁厚度与胆囊炎病史的长短以及发作次数关系密切，即使在开腹手术中，胆囊壁厚度也是影响手术难度的重要因素。对胆囊壁厚度大于0.5 cm者，LC手术难度大，且增加了并发症的发生，延长了康复时间，对此类患者应慎做LC手术。对萎缩性胆囊炎患者应提高警惕，减少误诊，并慎做LC手术，以此减少并发症的发生。胆囊颈部嵌顿性结石并急性胆囊炎者，因急性炎症期，组织水肿明显，易剥离胆囊床，适宜尽早行LC手术。所以，胆囊结石并急慢性胆囊炎、胆囊隆起样病变患者，胆囊壁厚度小于0.5 cm，排除萎缩性胆囊，胆总管无结石不扩张，是LC手术的良好适应症，最适宜做LC手术。
&&& 随着腹腔镜胆囊切除术在临床上的广泛开展，术前B超检查筛选病人发挥着重要作用，可为胆囊疾病患者术前选择手术方式提供可靠依据。
【参考文献】
& ［1］ 陈建尧，蔡秀军. 急性胆囊炎腹腔镜切除术79例临床分析［J］. 中国微创外科杂志，）：69-70.
［2］ 陈敏华. 腹部疾病超声图谱［M］. 北京：北京科学技术文献出版社，.
作者单位：巴中市骨科医院，四川 巴中 636000日期：日 - 来自[]栏目摘　要　采用LC/MS&联用技术测定蝎毒二级提取物的分子量,&共分离出22个组分,&分子量为的有13个组分,&的有7个组分,&的各一组分。　　关键词　蝎毒；&LC/MS；&分子量；&活性成分；&测定　　蝎毒是一种生物活性物质,&具有较高的药用价值,&蝎毒粗液经柱层析分离出蝎毒素约30个,&主要为多肽类物质［1］。&近年来,&科学工作者对蝎毒素的分离,&纯化及药理作用进行了研究。&蝎毒的临床应用主要集中在抗肿瘤作用及镇痛作用［2～5］。蝎毒二级提取物,&具有较强的抗癌活性,&虽然对其进行了药理和临床应用研究,&但其基础研究还不充分,&有效成分组成和理化性质(如分子量)尚未进行深入探讨。液相色谱/电喷雾离子化质谱法（LC/ESIMS）是近年来出现的一种新型分离分析联用技术［6］,&对分子量测定具有独特的优势。作者采用该技术对蝎毒二级提取物有效成分的组成及分子量进行了分析。1　仪器与试剂　　HP1100&LC/MSD,&该系统包括双高压溶剂泵,&在线真空脱气机,&带恒温单元的自动进样器,&内置柱切换阀的柱温箱以及光二极管阵列检测器和大气压离子化接口的四极质谱检定器,&色谱和质谱数据的采集和处理由HP化学工作站完成。色谱柱：Zorbox&300-SBC18&,&5&μm&,&2.1&mm&ID&×10&cm，乙腈(色谱纯),&三氟醋酸(TFA)&(分析纯),&所用水为经Millipore&纯化水系统的纯净水。2　流动相的配制　　流动相&A,&取1.0&ml&三氟醋酸加经微孔滤膜过滤并超声脱气的1000&ml水-乙腈(95∶5)混合溶剂中。　　流动相&B,&取0.85&ml&三氟醋酸加经微孔滤膜过滤并超声脱气的1000&ml水-乙腈(5∶95）混合溶剂中。3　色谱分离与质谱条件　　色谱分离按二元梯度方式进行。梯度洗脱程序:&在0→100&min&内,&流动相A&由95%→40%,&流动相&B&由5%→60%,&流速,&0.35&ml/min。柱后流出物依次经UV和MSD检测。UV检测波长为&210&nm，经UV检测器流出的流份通过三通与添加的TFA-fix溶液(丙酸-异丙醇&=&20∶80)混合在气动辅助方式下进入电喷雾离子化(ESI)喷雾室。　　质谱检测参数:&m/z&扫描范围&400.00～2000.00,干燥气温度&350&℃,&干燥气流速&12.0&L/min&,&雾化气压力&40&Pa,&电喷雾电压4000&V,&离子化方式:&ESI,&质谱扫描间隔&0.20&Da,&进样量&50.0&μl。4　结果与讨论　　色谱图上各峰的分子量见表1,&图1为HPLC色谱图和MSD总离子流图。Fig&1.MSD&and&HPLC&of&scorpion&venom&extractiona,&HPLC;&b,&MSD&total&ions&current&chromatogram　　蝎毒中已分离出的有效成分约30个［1］,&主要是50～70个氨基酸残基组成的多肽,&根据SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(SDS-PAGE)测定结果,&其分子量在之间,&绝大多数为,&蝎毒的分离纯化一般采用Sephadex&G-50和Sephadex&G-25进行,&分子量测定采用SDS不连续聚丙烯酰胺垂直电泳。蝎毒二级提取物经Sephadex&G-50和Sephadex&G-25纯化而得。经过药理和临床实验得知,&蝎毒二级提取物不但能够高选择性地杀伤肿瘤细胞,&还可减轻化疗时对骨髓造血功能的抑制及增强正常组织对放疗的抗辐射能力［2，3］,&为一种天然,&高效,&副作用小的新型生物性抗肿瘤有效成分。&蝎毒二级提取物虽经Sephadex&G-50和Sephadex&G-25多次分离纯化,&但本次实验结果表明蝎毒二级提取物仍然是多肽的复杂混合物,&蝎毒二级提取物其HPLC色谱图中有22个峰,&提取各组分的总离子流图的质谱图进行结果分析,&分子量的有13个成分,&的有7个成分,&分子量为的各一个组分。实验结果表明,&LC/MS方法分离效果好,&分子量定量准确。张振中(河南医科大学药学系，郑州&450052)　饶耀刚(河南医科大学药学系，郑州&450052)　韩俊(广州市药品检验所，&广州&510000)　杜斌(河南医科大学药学系，郑州&450052)　韩雪飞(河南医科大学生物毒素中心，&郑州&450052)　吴如金(中国药科大学药物分析学教研室，&南京&210009)参&考&文&献1，王成裕，雷留根，&韩雪飞，&等.&蝎毒纯化因子Ⅱ对大鼠神经肌肉兴奋性的影响.&河南医科大学学报,&）:&92，田爱琴,&马湘玲,&赵培荣，等.&马氏钳蝎蝎毒对食管癌细胞株细胞周期的影响.&河南医科大学学报,&1997，&32(4）:&183，董伟华,&臧梦维,&孔天翰，等.&钳蝎蝎毒组分Ⅱ对人直肠腺癌C1184&细胞生长的影响.&肿瘤防治研究,&):&1504，李新新,&张瑞德,&刘素珍，等.&辽宁产东亚钳蝎毒对躯体痛作用的影响.&针刺研究,&)&:&735，张瑞德,&陈京红,&马晓玲，等.&辽宁产东亚钳蝎毒内脏痛镇痛作用的机理研究.&中国医科大学学报,&):&12日期：日 - 来自[]栏目【机　构】&中国药科大学分析测试中心，南京210009&国家中药现代【刊　名】中药新药与临床药理.).-160-163&【文　摘】&采用LC／MS技术测定了中药三七（包括药材，中间体及针剂成品）的指纹图谱，通过实验比较，确定75％，乙醇作为较适宜的提取溶剂，对中间体和成品则直接进样分析，并比较了三者的相关性。&&日期：日 - 来自[]栏目
可能的原因
解 决 方 法
保留时间变化
1.柱温变化
2.等度与梯度间未能充分平衡
至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够
用&25mmol/L的缓冲液
每天冲洗柱
5.柱内条件变化
稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命
采用保护柱
保留时间缩短
1.流速增加
检查泵,重新设定流速
2.样品超载
降低样品量
3.键合相流失
流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化
防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加
保留时间延长
1.流速下降
管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化
用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
3.键合相流失
4.流动相组成变化
5.温度降低
出现肩峰或分叉
1.样品体积过大
用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
2.样品溶剂过强
采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道
更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效
更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏
更换进样器转子
1.进样阀残余峰
每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物
3.柱未平衡
重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)
每天新配,用抗氧化剂
5.水污染(反相)
通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
1.气泡(尖锐峰)
流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声)
清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声
4.电干扰(偶然噪声)
采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡
流动相脱气,加柱后背压
降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用
加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
4.同前(四)4
5.同前(四)3
5.同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大
连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降
用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
1.进样体积过大
2.在进样阀中造成峰扩展
进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢
设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大
设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
5.流动相粘度过高
增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大
用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长
等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大
将连接管径和连接管长度降至最小
9.样品过载
进小浓度小体积样品
日期：日 - 来自[]栏目
摘要目的：用LC/MS/MS和RP-HPLC法研究泻心汤煎煮产生的沉淀物 。方法:利用LC-MS-MS法对泻心汤沉淀物进行了初步研究,
又利用RP-HPLC法,测定了泻心汤沉淀物中小檗碱在小鼠体内的吸收。结果：发现其中含有小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱,但在给小鼠灌服泻心汤沉淀物后24
h内的几个时间段中,均未能从血浆中测到小檗碱。结论：泻心汤沉淀物进入体内后小檗碱并未进入血液,推测如果泻心汤沉淀物具有活性,估计也只可能在胃肠道起作用。
on the Precipitate Produced in Preparation of ComplexPrescription of Chinese Herbal Medicines Xiexin Decoctionby LC/MS/MS and RP-HPLCXue Yan
and Zhou Tonghui（ Institute
of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking
Union Medical College,Beijing 100050）Wang Xiaomin（ Perkin-Elmer
Sciex Instruments,Concord,Ont, Canada L4K 4V8）AbstractObjective：To study the precipitate formed during decocting of the
Chinese herbal complex prescription Xiexin decoction and the absorption
of the precipitate in rats.Method: LC/MS/MS and reversed phase HPLC
were used to study the precipitate and the berberine absorption
in rats respectively.Result: Berberine , palmatine, coptisine
and jatrorrhizine were found in the precipitate, but no berberine
was found in rat plasma after administration of the precipitate
to rats. Conclusion: It can be concluded that the Coptis
alkaloids were precipitated off the decoction and when the precipitate
entered the body , berberine did not go into the blood. Thus, if
the precipitate possessed any biological activity , it would mainly
function in the gastrointestinal ducts.Key words　LC/MS/MS, RP－HPLC, Xiexin decoction, precipitate,berberine　　人们已经注意到中药中很多药物之间,如甘草与芒硝、麻黄、黄芩、黄连之间［1］,大黄与茵陈、双花之间,苦参与大黄、黄芩、栀子之间［2］,以及一些常用方剂,如泻心汤、葛根黄芩黄连汤［3］、白头翁汤［4］在煎煮时都会出现浑浊,产生沉淀,且在服用汤剂时,患者喝进的汤药,实际大多是一些含有沉淀物的混悬液。那么,这些沉淀物中都含有什么成分,进入体内后,是否会被吸收进入血液而发挥药效作用呢?为此,我们选择了中药复方中的经典方“泻心汤（黄连、大黄、黄芩）”对其沉淀物进行了研究。1　材料与仪器PE-SCIEXAPI365型LC/MS/MS联用仪；Waters510型输液泵,岛津SPD-2A紫外检测器,岛津C-R3A积分仪；盐酸小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱：中国药品生物制品检定所；硫酸奎尼丁，BDH
，为本室何丽一教授赠；十二烷基硫酸钠（分析纯）,北京东环联合化工厂；其它试剂均为分析纯。大黄（蓼科植物掌叶大黄Rheum
palmatum L.）,黄连（毛莨科植物黄连Coptis chinensis Franch）,黄芩（
唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi）购于市药材公司,并经我所植物室陈毓亨教授鉴定。18～22g♂昆明种小鼠,中国医学科学院动物所饲养场。2　沉淀物化学成分的定性实验2.1　泻心汤沉淀物的制备　按泻心汤中药材量的配比关系：大黄-黄连-黄芩(2∶1∶1）,分别称取大黄、黄连、黄芩各一定量,先后加4倍及2倍的水,煎煮2次,煎煮时间第一次为40min,第二次为30min,第一次煎煮前先用水浸泡30min,4层纱布过滤,合并2次滤液,置冰箱中过夜,次日离心过滤,弃去上清液,加水反复洗沉淀至水无色,干燥后备用。2.2　样品液的准备　沉淀物先溶解在二甲基亚砜中,再用甲醇-水（1∶1）溶液稀释成10 μg.mL-1。2.3　色谱条件　色谱柱:YMC-C18分析柱（2.0mm×50mm），流动相:（A）含有2
m mol.L-1醋酸铵及0.2％甲酸的水;（B）含有2
m mol.L-1醋酸铵及0.2％甲酸的甲醇，流速:200μL.min-1,梯度条件：开始25％B、75%A，30min后90%B、10%A，进样量：10μL。2.4　质谱条件　质谱仪校准方式:聚丙烯二醇溶液校准, 离子化方式:高流速的离子喷雾，加热电离温度：450℃，电离电压：5500V（正离子方式），喷雾压力：275kPa，辅助气体流速：6.0
L.min-1，屏障气体（curtain
gas flow）流速:2.0L.min-1。2.5　结果　按照前文已报道的方法［5］，每种化合物（小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱）先用流动注射方式以MS及MS/MS进行试验，以确定其前体离子（precursor
ion）,并选择产生离子(product ion)以及仪器操作条件，以便随后用LC/MS/MS模式进行多重反应监控实验［multiple
reaction monitoring(MRM)experiment ］，将泻心汤沉淀物的结果与标准图谱比较，确定泻心汤沉淀物中含有小檗碱、巴马丁碱、黄连碱、药根碱。见表1与图1～3（图中给出小檗碱、巴马丁碱的质谱图，黄连碱、药根碱图及标准品的离子流图从略）。表1　沉淀物中检出的物质及其性质名称分子离子（m/z）碎片离子（m/z）保留时间/min极性黄连碱320292,277,2627.98+药根碱338322,2949.09+小檗碱336320,292,2789.89+巴马丁碱352336,30810.20+3　沉淀物中小檗碱的体内吸收实验3.1　标准溶液　精密称取盐酸小檗碱0.767mg，用无水乙醇配成6.76、15.34、23.01、30.68
μg.mL-1的标准溶液。图1　泻心汤沉淀物与标准品产生离子质谱图的比较图2　泻心汤沉淀物几种成分产生离子的质谱图图3　泻心汤沉淀物一些成分的MRM离子流图3.3　生物样品的制备　小鼠断头取血,枸橼酸钠抗凝,离心取血浆。取0.2mL放入带塞的离心管中,加入18%十二烷基硫酸钠水溶液40μL,
内标溶液40μL, 氯仿2mL,振荡离心15min后,弃去上清液,取下层氯仿液1.8mL,氮气吹干,残渣加无水乙醇100μL溶解,取10μL进样。3.4　液相色谱条件　色谱柱: Kromasil-100C18（150mm×4.0mm）分析柱,YWG-C18（50mm×4.6
mm）保护柱,流动相:0.2mol.L-1酒石酸（内含0.5%十二烷基硫酸钠）-甲醇（5∶17）,流速:1.0
mL.min-1,柱温:室温,检测波长:270nm,灵敏度:0.08AUFS。3.5　结果3.5.1　样品处理　用枸橼酸钠抗凝采血后，离心分离出血浆，取不同浓度的盐酸小檗碱标准溶液各20μL,分别加入内标溶液40μL
, 放入带塞的离心管中挥干,加血浆0.2mL,18％的十二烷基硫酸钠水溶液40μL
,氯仿2mL,振荡离心后,弃去上清液,取下层氯仿液1.8mL,氮气吹干,残渣加100μL无水乙醇溶解,待测。3.5.2　血浆中小檗碱的标准曲线及回收率精密吸取0.3835mg.mL-1小檗碱储备液适量，配成不同浓度的标准溶液，各取20μL
,按样品处理项下进行操作，取10μL进样,得色谱图，见图4。将所得结果以小檗碱的浓度为横坐标,小檗碱与内标的峰面积之比为纵坐标作图,得小檗碱在血浆中的标准曲线,并求出回归方程为：Y=3.548X+0.818　r=0.9993小檗碱在0～30.68ng的范围内与峰面积之比呈线性关系。图4　小檗碱的高效液相色谱图　　将小檗碱用流动相逐步稀释进样，以血浆为背景空白,当S/N为2时,小檗碱的最低检测量为6ng。用血浆配制每1mL含小檗碱6.76、15.34、23.01、30.68μg的样品，按标准曲线项下进行操作，取10μL进样,计算实测值占加入值的百分率即得回收率。结果见表2。3.5.3　灌服泻心汤沉淀物后测定不同时间内血浆中小檗碱的浓度　用1%CMC-Na水溶液将泻心汤沉淀物（经测定,每100mg沉淀物中含6.651mg盐酸小檗碱）配成25mg.mL-1的混悬液,将24只小鼠分成8组,以250mg.kg-1的量给小鼠口服灌胃泻心汤沉淀物的混悬液,于灌胃后的30
min及1、2、3、4、6、8、24h的8个时间段断头取血,枸橼酸钠抗凝,取血浆0.2mL依前法进行操作,测定不同时间时血浆中小檗碱的含量,同一血样测定3次。结果,在灌服泻心汤沉淀物后24h内的各个时间段,均未能从血浆中测出小檗碱。表2　血浆中小檗碱的回收率测定结果（n=4）加入量/μg.mL-1回收率/%SD6.7698.179.3915.3492.862.8423.01101.957.7130.68105.776.324　讨论作者单位：薛燕　周同惠 中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所
北京100050王小民 PE-SCIEX仪器公司 加拿大L4K　4V8参考文献1　富森　毅ら.甘草煎液中のグリチルリチン量におよぼす各种配合生药影响.生药学杂志，）:1382　孙启明，李国庆.31种中草药注射液配伍的沉淀反应.药学通报，）:403　野口　卫ら.黄连のアルカロイドと甘草および大黄の成分との汉方汤液中での沈殿反应について.汉方研究,1978,（4）:1224　丁林生，徐瑞华，吴振洁等.白头翁汤中小檗碱含量降低原因初探.中成药，1993,
5（1）:185　Wang Xiaomin.Characterization of Traditional Chinese Medicine
by Liquid Chromatography /Atmospheric Pressure Ionization Mass Spectrometry.J
Food Drug Anal,) :337收稿日期:
日期：日 - 来自[]栏目一、 培训目的： ● 基本了解1100LC硬件操作。 ● 掌握化学工作站的开机，关机，参数设定,学会数据采集,数据分析的基本操作。
二、 培训准备： 1、仪器设备： Agilent 1100LC ● G1310A :(单元泵)；G1312A(二元泵)；G1311A(四元泵)。 ● G1313A（自动进样器）。 ● G1316A（柱温箱）。 ● G1314A（VWD检测器）。 ● G1362A（示差检测器）。 ● G1315A/B (DAD检测器)。 ● G1321A (FLD检测器)。 ● 色谱柱: Zorbax eclipse XDB C8,150mm×4.6mm i.d。
2、溶剂准备： ● 色谱级纯或优级纯乙腈（ACN）或甲醇。 ● 二次蒸馏水
基本操作步骤: (一)、开机： 1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。 2、打开 1100 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面如下所示。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 5、把流动相放入溶剂瓶中。 6、打开Purge阀。 7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。 8 、设Flow：5ml/min，单击OK。 9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。 10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off，单击Ok关泵， 关闭 Purge valve。 11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：1.0ml/min。 12、单击泵下面的瓶图标，如图所示（以二元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。
(二)数据采集方法编辑： 1、开始编辑完整方法：
● 从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项，如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，单击Ok，进入下一画面。
2、方法信息： ● 在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。
● 单击Ok 进入下一画面。
3、泵参数设定：（以二元泵为例） ● 在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“Solvent B”处输入70.0,(A=100-B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。
● 单击Ok进入下一画面。
4、自动进样器参数设定: ● 选择合适的进样方式, 如图所示，进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为6号。“Standard Injection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program”---可以点击Edit 键进行进样程序编辑。
● 点击Ok进入下一画面。
5、柱温箱参数设定: ● 在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more&&” 键,如图所示,选中”Same as left”---使柱温箱的温度左右一致。
● 点击ok进入下一画面。
6、VWD检测器参数设定: ● 在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间, 如&0.1min (2s)。
● 在Timetable 中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。点击ok进入下一画面。
7、DAD检测器参数设定: ● 检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100 ● 检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit―狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。
● 点击Ok进入下一画面。
8、 RID检测器参数设定: ● 色谱条件: 进样体积: 20ul。&&&&&光学单元温度: Off 。 极性: 正。&&&&&&&&&&&峰宽(响应时间) : 4s 。 ● 如图所示: “Optical Unit Temperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。
● ***** 点击RID图标，选择RID Control ：Heater 设为On，若要循环流动相，必须将“Recycling Valve”设为ON。手动purge 参比池，将其设为On，并输入Purge 时间。
9、 FLD检测器参数设定: 色谱条件： ● 样品：P/N
用甲醇稀释为1:10。 ● 进样体积：5ul。 ● 柱温箱: 30℃ 。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 ● 响应时间=4s. 停止时间： 出峰完毕。 ● Excitation A: 激发波长:200-700nm,步长为1nm,或Zero Order。 ● Emission: 发射波长: 280-900nm, 步长为1nm,或Zero Order。 ● PMT: 大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少 PMT 值。 ● “Peak width”：大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设定值。 ● Multi Ex ： 多波长及光谱（激发）。 ● Multi Em：多波长及光谱（发射）。 ● 同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。
10、 在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”，单击Ok。
11、 单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”，单击Ok。
12、 从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中 Windows 2)。
13、 从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。
区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖掉。 Prefix―在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。
14、 从Instrument 菜单选择System on。
15、 等仪器Ready，基线平稳，从Method菜单中选择“Run method”，进样。 （DAD, VWD色谱图如下所示：）
（三）、数据分析方法编辑: 1、 从“View”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面。 2、 从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok。 3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options”选项，。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示时间，单击ok,或选择”Use Ranges” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。
4、积分: (1)、从“Integration”中选择 “Auto integrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项，选择合适的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。 (2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分。 (3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。
(4)、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。
5、打印报告: (1)、从“Report”菜单中选择“Specify report”选项，进入如上画面。 (2)、单击“Quantitative Results”框中Calculate右侧的黑三角，选中Percent（面积百分比），其它选项不变。 (3)、单击Ok. (4)、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report 底部的“Print”钮。
(四)、关机: ● 关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗] ● 退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shut down关）。 ● 关掉Agilent 1100电源开关。
(五)、Agilent 1100 LC维护保养： 1、 色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相） 2、 对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。 *3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。 *4、带seal-wash的 1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分2―3滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。 5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。
维护知识问答1、 为什么溶剂和样品要过滤? 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 样品过滤头的类型： 30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。 13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。 3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。 滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
2、 为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？ HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项. 清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。
3、 为什么Agilent 1100LC的流动相管路非常细? 在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent 1100LC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。 毛细管线分类：0.17mm内径 ------绿色 ;0.12mm内径-------红色。 PEEK 管线：内径 -----0.130.180.250.5mm。 毛细管线优点: 柔韧性好. ***Agilent 公司同时备有1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。
4、 流动相使用前为什么要脱气？ 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。 常用的脱气方法比较： 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？ 溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4―7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。 A：请严格执行溶剂过滤。 B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠. D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。 E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。 堵塞后的处理法方法： 将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。
6、 Agilent 1100LC泵如何维护？ Agilent 1100LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。 A：流动相使用前请必须脱气、过滤。 B：使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。 C：关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如甲醇），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗] D：及时更换Purge Valve内的过滤芯。（当打开Purge Valve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。E：使用合适的密封圈。
7、 如何选择合适的泵头活塞密封圈？ 泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n/pk） ***注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0―200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。
8、 使用梯度比例发时要注意那些事项？ 当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。 强烈建议：当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。
9、 在线真空脱气机使用要注意那些事项？ 一般来说，Agilent 1100LC 的真空脱气机无需过多维护，只需注意几个注意事项就可以了。 A：第一次使用，要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体；更换不同类型的溶剂时，要先抽空，再抽满。 B：不用的通道要充满溶剂或密闭起来。
10、 更换色谱柱时要注意什么事项? 在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低 。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent 1100LC 在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头，当完成第一次安张后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积。 下面是不同厂家柱子接头的形状和长度，请参考：
11、 手动进样阀需做那些维护，使用时要注意什么？ 对于手动进样器，当使用缓冲溶液后，或者进浓度差异比较大的样品时要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。 注意事项： ● 安装时六通阀的5，6出口要与注射器在同一水平线上，以防止虹吸现象的发生，导致进样量的重复性变异。 ● 进样量的多少要根据定量管的LOOP体积决定。 当样品量少时： 进样体积由注射器的进样体积决定，但最大进样体积 要小于1/2loop体积。 当样品量较多时：进样体积由定量管的体积决定，为保证样品完全把定量管的流动相置换干净，需注射5―6倍的LOOP体积。 ● C：要使用专用的液相注射器进样，绝对不可以用气相的注射器。日期：日 - 来自[]栏目
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