怎样配制percoll细胞分离胶配制液

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-02-20 02:54 标签： 细胞培养基的配制
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试剂名称：Percoll 细胞分离液（现货）
英文名称：Percoll
国产/进口：进口
产地/品牌：Pharmacia
规格：Pharmacia17-0891-01&
参考报价：450
总点击数：2376
本半年点击数：43
产品类别：
订货热线：021-
Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
(一)　原理
Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(&20mosm／kg H２O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
二)操作方法及注意事项
　　1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。
　Percoll浓度(％)　　70　　　　60　　　　50　　　　40　　　　30　　　　　20
　　比重g／ml　　　& 1.090 &&&&1.077& &&&1.067 &&&&1.056 &&&&1.043&& &&&&1.031
2.不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
&&& 3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
&&& 4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
&&& 5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
　　(三)分离纯化细胞举例
　　1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1&10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。
&&& 2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。
(四)　人不同血细胞的漂浮密度
　　　　　　　　　　表　　　人不同血细胞的漂浮密度
　　　──────────────┬──────────────────
　　　细　胞　　　漂浮密度　　　　│ 细　胞　　　　　　　漂浮密度
　　　──────────────┼──────────────────
　　　红细胞　　1.09-1.11　　　 　│淋巴细胞　　　　　　　1.052-1.077
　　　粒细胞　　　　　　　　　　 &│ B淋巴细胞　　　　　 1.062-1.075
　　　嗜酸性　　1.09-1.095　　　 &│ T淋巴细胞　　　　　 1.065-1.077
　　　嗜中性　　1.080-1.085　　　 │ 淋巴母细胞　　　　　1.065-1.077
　　　单核细胞　1.050-1.066　　　 │自然杀伤细胞　　　　　1.050-1.070
　　　血小板　　1.030-1.060　　　 │
　　　──────────────┴──────────────────
(五)问与答　
问：请问percoll连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll连续梯度?
答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：1的比例混合，此时溶液 为100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg
Percoll浓度(％) &70&&& &60 &&&&&50 &&&&&40 &&&&&30 &&&&&&20
比重g／ml &&&&&1.090& 1.077 &&&1.067& &1.056 &&1.043 &&&1.031
&&& 公司成立于2004年，以前主要代理德国Greinorm和瑞士生产的实验室仪器设备，现因公司扩大经营范围，新设生物技术部，更名为上海欧韦达仪器科技有限公司。
&&& 公司是专业从事生物技术产品销售以及技术服务的高科技企业，公司主要为广大科研用户提供各种高品质的试剂、仪器设备和技术服务，如抗体、细胞因子、氨基酸、ELISA试剂盒、多肽、蛋白质、 抗生素、维生素、 生物缓冲液、表面活性剂、 酶、蛋白酶代谢酶等抑制剂、酶底物 、细胞培养基、微生物培养基、电泳试剂、染料、指示剂、PCR试剂、各种转印膜、核酸提取试剂或试剂盒、密度计、电泳仪、防爆冰箱、超低温冰箱、水质分析仪、纯水机、化学分析仪等。我们在发展的过程中，不断引进国外知名品牌产品，如Sigma、Merck、Wako、Invitrogen、Amersharm Roche、Axygen、Amresco、Pharmacia、BD、Gibco、Hyclone、Corning、cell signal、ABCAM、SANTA Cruz、Lifespan、Greinorm、HANNA、HACH、ALLIANCE、lab-line、Up、Pentair、Aquapro、热电等。同时，本公司代理销售国内知名厂商的优质科研试剂、仪器和耗材。
公司目前已与国内外多家著名试剂供应商建立了长期稳定的合作关系，也与同行保持着良好的沟通，能快速的为客户提供价格低廉、品质一流的产品。
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