植物细胞工程
植物细胞工程
30学时(理论20& 实验10)
一、课程的性质、地位和任务
植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性很强的新兴学科，是生物技术的重要内容，近年来发展迅速。不论在植物细胞生物学的基础理论方面还是在实际应用方面。都取得了很多具有重大意义的研究成果。回顾植物细胞工程发展历程，可以看到其取得的每项重要进展，无不和研究方法的改进或实验技术的革新有直接关系。例如，没有花药培养技术的建立就不会有单倍体育种的成功，没有PEG诱导的原生质体融合方法的创造就难于进行体细胞杂交；没有电激法、基因枪等基因转移技术的发明也就无法获得禾谷类作物的转基因植物等。因此，目前世界上所有以改良作物、培育新品种为目标的植物生物工程实验室，不但都建立了植物组织和细胞培养等离体操作技术。并且十分重视研究和发展植物离体操作的新方法和新技术。
本课程为园艺专业本科生和研究生的选修课。植物细胞工程课程的开设，有利于学生掌握植物组织培养的理论和实际操作技术，为学生进一步从事分子水平上定向改良植物性状，培育植物新品种的研究奠定基础，也为部分学生进一步深造或从事与生物技术有关的工作打好基础。
二、课程教学的基本要求
&&& 1．掌握植物组织培养的基本原理、基本理论，掌握培养基的制备、材料的接种，无菌培养和植株再生技术。
&&& 2．掌握不同组织和器官培养操作技术。了解花粉和花药培养、胚胎和子房培养、原生质体培养、体细胞杂交、人工种子、植物超低温保存的理论和实验技术。
&&& 3．了解植物基因工程的下游实验技术，并掌握基因转化研究的进展和动向。&&&
三、课程理论教学大纲及学时分配
第1章& 概述& (2学时)
&&& 1.1植物细胞工程的意义和内容
1.1.1植物细胞工程的有关概念& 1.1.2植物细胞工程的意义和内容& 1.1.3植物细胞工程的分类
&&& 1.2植物组织培养的发展历史
1.2.1探索阶段 1.2.2奠基阶段 1.2.3迅速发展阶段
&& &1.3植物组织培养的应用原理
1.3.1细胞全能性理论&&& 1.3.2植株再生作用&&& 1.3.3细胞的分化和形态建成
第二章 植物组织培养实验室的设置& (2学时)
&& &2.1设备和器材
2.1.1实验室和工厂化生产车间的组成& 2.1.2主要仪器设备和器材及其使用
&&& 2.2培养材料和培养条件
2.2.1培养材料的选择& 2.2.2影响培养的条件
第3章& 培养基& (2学时)
&&& 3.1培养基的种类和成分
3.1.1培养基的种类& 3.1.2培养基的成分、作用及应用方法
&&& 3.2培养基的制备
3.2.1培养基母液的制备& 3.2.2培养基的配制& 3.2.3培养基的灭菌及保存
&&& 3.3生长调节物质在组织培养中的应用规律
第4章& 植物细胞悬浮培养& (2学时)
4.1细胞悬浮培养的意义
4.1.1细胞悬浮培养的概念& 4.1.2细胞悬浮培养研究进展和意义
&&& 4.2细胞悬浮培养技术
4.1.2细胞悬浮培养的基本方法& 4.1.3单细胞的分离方法& 4.1.4单细胞的培养方法
& &&4.3细胞突变体的筛选
4.3.1细胞突变体的产生& 4.3.2细胞突变体的筛选方法
第5章& 花药和花粉培养& (2学时)
&&& 5.1花药和花粉培养的研究概况
5.1.1花药和花粉培养的意义& 5.1.2花粉和花药培养的研究进展
&&& 5.2花药和花粉培养方法
5.2.1预处理& 5.2.2培养方法
&&& 5.3单倍体育种
5.3.1加倍方法& 5.3.2单倍体育种中存在的问题
第6章& 植物快速繁殖技术和无病毒良种的繁育& (2学时)
&&& 6.1植物快速繁殖技术和无病毒良种繁育的研究和生产概况
6.1.1快速繁殖技术的市场动向& 6.1.2无病毒良种繁育的研究进展
&&& 6.2快速繁殖的操作程序
6.2.1外植体的选择&& 6.2.2外植体表面消毒方法&& 6.2.3植株的诱导和增殖& 6.2.4试管苗的移栽
&&& 6.3培养脱毒苗的原理和方法
6.3.1培养脱毒苗的原理& 6.3.2外植体的选择&& 6.3.3无病苗的生产和鉴定方法
&&& 6.4植物组织培养中存在的问题和对策
6.4.1污染的产生和对策&& 6.4.2变异的产生和对策
第7章& 原生质体培养和体细胞融合技术& (2学时)
& &&7.1概述
7.1.1原生质体融合技术的概念和重要性&& 7.1.2原生质体融合技术的研究进展
&&& 7.2原生质体融合操作技术
7.2.1原生质体融合的方法& 7.2.2融合体的选择& 7.2.3体细胞杂种的鉴定方法
第8章& 人工种子& (1学时)
&&& 8.1人工种子的概念、意义
&&& 8.2人工种子研制方法
8.2.1研制程序 8.2.2人工种子研究中存在的问题& 8.2.3转化试验
8.3人工种子的前景
第9章& 植物材料超低温保存技术& (2学时)
9.1超低温保存的作用和意义
9.2超低温保存的原理
9.3超低温保存的基本设备和程序
9.4影响超低温保存效果的一些主要因素
第十章植物基因转化技术& (3学时)
10.1植物基因转化的研究概况
10.1.1基因工程的研究历史& 10.1.2基因工程育种的优点& 10.1.3转基因植物发展的特点& 10.1.4植物基因工程的应用
10.2园艺植物基因转化成功事例
& 10.2.1花卉转基因& 10.2.2果树转基因& 10.2.3.树木转基因
10.3介绍几种常用的基因转化方法&
10.3.1农杆菌介导的外源基因的转化&& 10.2.2基因枪转化外源基因& 10.2.3PEG介导的外源基因的转化
10.3转基因植物的检测方法
10.3.1转基因植物的Southern印迹杂交& 10.3.2外源基因表达的RT－PCR检测& 10.3.3外源基因表达的Northern检测&& 10.3.4外源基因表达的Western检测
四、课程实验教学大纲及学时分配
&&& 一、参观植物组织培养实验室，要求学生掌握植物组织培养实验室的设计和主要仪器设备。(1学时)
&&& 二、要求学生学会培养基的配制及灭菌和接种操作。& (3学时)
&&& 三、植物胚胎培养，要求学生掌握离体培养的操作程序和方法，包括外植体消毒、接种、继代培养及污染原因的分析及控制方法。（3学时）
&&& 四、植物花粉和花药的培养。要求学生能进行花粉的预处理和培养方法．(3学时)浸入液氮保存；10影响超低温保存效果的主要因素：1）材料的基本；第十章；1植物基因工程包括两大部分即目的基因的克隆和目的；2植物基因转化受体系统一般是指用于转化的外植体通；4植物基因转化受体系统的类型及其特性1）经过愈伤；乎适用于每一种通过离体培养途径能再生植株的植物；；5植物基因转化受体系统的建立：1）高频再生系统的；与其分生能力有着直接的关系；选转化细胞
浸入液氮保存。４）包埋脱水法是在预培养和干燥法的基础上增加了一个包埋程序。此方法包括３个步骤：先是将材料用藻酸钙包埋，然后将包埋后含有保存材料的藻酸钙小珠在含有高浓度（ 或梯度浓度）蔗糖的培养基上预培养，最后浸入液氮保存。材料包埋后再进行预培养和干燥，增强了材料对干燥脱水和骤冷的抗性，使一些含液泡的外植体也可以进行液氮保存。运用包埋脱水法常选用蔗糖作冰冻保护剂，并采用硅胶或无菌气流进行干燥。
10 影响超低温保存效果的主要因素：1）材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态。不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同。植物细胞培养物的生长年龄是决定冻存后细胞成活率的最重要因素之一。指数生长期和滞后期的幼龄细胞抗冻力强，存活率高。2）预培养和低温锻炼，预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含量，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高材料的抗冻力。对于离体培养的植物，常在冻存前进行不同程度的预处理，可以提高抗冻力。预处理包括增加培养基中的糖浓度，提高渗透压，减少细胞内自由水的含量；在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂。3）冰冻保护剂的应用，一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活下来，生物体的低温保存离不开冰冻保护剂（CPA） 。冰冻保护剂也称作抗冻剂，合理地选择冰冻保护剂，对低温保存至关重要。冰冻保护剂应具有以下特点：易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂保存的作用主要表现在：增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高溶液的黏滞性，阻止冰晶生长。渗透型冰冻保护剂多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的黏性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护的目的。常用的渗透型冰冻保护剂有甘油、二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺和丙二醇等。但渗透型冰冻保护剂的使用浓度，渗入细胞的能力和对水分子活性的影响等各不相同， 如甘油适宜于慢速冷却，而DMSO却易于渗入细胞，并在常温下稍有毒性。非渗透型冰冻保护剂能溶于水，但不能进入细胞， 它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。非渗透型冰冻保护剂主要有聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、白蛋白和羟乙基淀粉等。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。DSMO是迄今广泛采用的一种冰冻保护剂，在单独使用时，表现出较好的效果。但它有一定的毒性，也可能引起基因的遗传变异。
1 植物基因工程包括两大部分即目的基因的克隆和目的基因的表达。其中目的基因的表达除了一些特殊研究目的外，均需要在植物细胞内完成，只有将目的基因导入植物细胞中，才能使其实现表达并最终行使相应功能。目的基因如何进入植物细胞是实现基因表达关键之一。植物受体系统的建立是基因工程的重要环节之一。
2 植物基因转化受体系统一般是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统,一个成功的受体系统必须具有较强地接受外源基因的能力， 能够高效再生植株，并能将外源基因稳定地遗传给后代。 3 植物基因转化受体系统的条件1）高效稳定的再生能力，用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有良好的实验稳定性和重复性。不同分化程度的细胞，其脱分化和再分化的能力具有很大差异。2）较高的遗传稳定性，植物基因转化是有目的地将外源基因导入植物并使其整合、表达和遗传，从而达到修饰植物原有的遗传物质、改造不良的农艺性状的目的。这要求植物受体系统接受外源DNA后不影响其自身的遗传体系，又能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性。3）具有稳定的外植体来源，建立一个高效的组织培养再生系统并能应用于基因转化，还需要有稳定的外植体来源。因为基因转化的频率较低，实验重复较多，能比较容易地获得大量外植体的转化体系对于建立适宜的受体系统相当重要。转化的外植体一般采用种子，无菌实生苗的胚轴、子叶或幼叶，进行离体快速繁殖的材料如一些植物的试管苗，以及可较高频率诱导的营养变态器官等。无菌材料作为外植体来源，可以避免消毒处理对材料的造成的伤害， 从而提高培养效率。离体培养的无菌材料一般是在控制条件下培养的，可保持较好的一致性，因而有利于提高转化实验的重复性。4）抗生素敏感性，植物基因转化中，通常使用两类抗生素：一类是抑菌抗生素，另一类是选择性抗生素。抑菌抗生素一般是在农杆菌介导的转化体系中用来抑制农杆菌生长的抗生素， 以终止农杆菌的侵染反应。选择性抗生素是用来对转化子进行早期筛选的抗生素。对选择性抗生素的选择至少满足两个条件：一是植物受体材料对所选用的抗生素有一定的敏感性，当培养基中的抗生素达到一定浓度时，能够抑制非转化植物细胞的生长、发育和分化，而转化的植物细胞由于携带该抗生素的抗性基因，因此能正常地生长、分裂和分化；二是抗生素对受体植物没有剧烈的毒性，不会很快杀死植物细胞。5）农杆菌敏感性，对于利用农杆菌Ti或Ri质粒为载体所介导的植物基因转化来说，需要植物受体材料对农杆菌敏感。不同的植物，甚至是同一植物不同组织的细胞对农杆菌侵染的敏感性都存在很大的差异。在选择农杆菌转化系统前，必须测试受体系统对农杆菌侵染的敏感性，只有对农杆菌侵染敏感的植物材料才能作为受体系统。
4 植物基因转化受体系统的类型及其特性1）经过愈伤组织的受体系统，经过愈伤组织的受体系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得再生植株的受体系统。经过愈伤组织的受体系统，均为以植物组织为外植体的类型。经过愈伤组织的再生系统包括利用农杆菌直接侵染外植体，然后经过培养形成愈伤组织，再分化成植株；也包括将植物外植体先诱导形成愈伤组织，再利用愈伤组织转化外源基因，进而再生植株。其共同特点是： ａ外植体来源广泛，多种组织、器官均可诱导愈伤组织，甚至分化程度较深的组织、器官也能诱导出愈伤组织；ｂ扩繁量大，可获得较多的转化植株；ｃ适用的植物范围广，几
乎适用于每一种通过离体培养途径能再生植株的植物；ｄ由于从愈伤组织分化的不定芽常是多细胞起源，因而嵌合体多；ｅ获得的再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差。建立经过愈伤组织的受体系统，其植物外植体通常采用叶片、茎段、子叶和上胚轴等。在以农杆菌介导的转化体系中，受体细胞对农杆菌的感受状态往往直接影响转化效率。如直接使用外植体组织进行农杆菌侵染，应注意从活跃生长的植物部位选取外植体。如采用将外植体先诱导成愈伤组织再进行转化的方式，理论上大多数愈伤组织细胞处于分生细胞状态，易于接受外源基因，因此转化率较高。但注意的是，愈伤组织必须保持良好的生长状态，继代培养的愈伤组织，其继代周期不能过长，以免细胞老化而不利于转化和转化后的植株再生。2）不经过愈伤组织的受体系统，不经过愈伤组织的受体系统也称为直接分化再生系统，是指外植体细胞越过脱分化阶段，直接分化出不定芽，从而获得再生植株的受体系统。采用叶片、幼茎、子叶、胚轴以及一些营养变态器官等为外植体时，在适宜的培养技术控制下均可直接分化出芽。这一受体系统的主要特点是：ａ获得再生植株的周期短，操作简单；ｂ体细胞无性系变异相对较小，可较好地维持受体植物的遗传特征；ｃ转化的外源基因能稳定遗传，特别是由茎尖分生细胞建立的直接再生系统的遗传稳定性更佳；ｄ由于不定芽的再生可能起源于多细胞，直接再生系统同样可能出现较多的嵌合体；ｅ由外植体细胞直接分化芽比诱导愈伤组织要困难得多，要使转化细胞直接分化成植株则难度更大，其转化频率可能比愈伤组织要低。3）原生质体再生系统，原生质体是“裸露”的植物细胞，由于除去了细胞壁的屏障，能够直接高效地摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核，因此转化效率高且适合于现在建立的所有转化方法。原生质体受体系统通常处于相对均匀和稳定的控制环境中理论上有利于准确的转化和鉴定。通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克隆， 因此从转化原生质体获得的转基因植株及其特性的嵌合体少。4）细胞系及其体细胞胚受体系统，经过筛选和优化的植物细胞悬浮培养的细胞系，通常具有较好的遗传和生理状态的一致性，通过一定的培养基调节，可使细胞进入胚性状态进而形成体细胞胚。这种培养系统在培养技术上相对于原生质体来说要容易得多，从转化效率的角度讲，又优于其它组织培养系统，因此被认为是最为理想的基因转化受体系统。这一系统的主要特点有：ａ胚性细胞繁殖量大，同步性好，是理想的基因转化感受态细胞，因而具有很强的接受外源 DNA的能力，转化率高。ｂ转化后的胚性细胞即可通过体细胞胚途径发育成完整植株，由于体细胞胚的发生多数为单细胞起源，因此转化获得的转基因植株嵌合体少。ｃ体细胞胚具有两极性，从而减少了不定芽发育途径中的生根培养过程，特别对那些生根困难的植物来讲，通过这一途径获得转基因植株更为有利。ｄ对于转基因系来讲，来自于同一体细胞胚的后代个体间遗传背景一致，无性系变异小，有利于转基因植株的生产和推广。5）生殖细胞受体系统,以生殖细胞如花粉粒和卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。主要从两个途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，从而建立单倍体的基因转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法和子房微注射法等。由于以具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞， 因此具有更强的接受外源DNA的潜能，一旦将外源基因导入这些细胞，如正常的受精过程一样，会收到“一劳永逸”的效果。由于受体细胞是单倍体细胞，转化的基因无显隐性的影响，能使基因充分表达，有利于性状的选育，而且通过加倍后即可成为纯合的二倍体新品种，大大缩短了复杂的选育纯化过程。花粉管通道法和子房注射法由于操作简单，受实验室条件限制较小，因而是目前利用性细胞受体中研究较多的方法。花粉管通道法可利用植物自身的授粉过程，将现代的分子育种与常规育种紧密结合，被认为是十分有潜力的受体系统。由于这些方法受到季节的影响，只能在短暂的开花期内进行，也使其应用受到限制。利用花粉或小孢子培养系统作为受体系统，可以建立单倍体水平上的细胞系，从而在单倍体水平上实现基因转化。在花粉及小孢子培养技术成熟的植物种类中，这是更为理想的受体系统。特别对一些多倍体植物，利用这一系统将可大大提高转化率。该系统是十分有潜力和可能大力发展的植物受体系统之一。
5 植物基因转化受体系统的建立：1）高频再生系统的建立，必须具有４个条件：ａ外植体的组织细胞具有诱导愈伤组织和再生完整植株的能力，并且最好是外植体能直接分化出芽； ｂ芽的分化率高；ｃ易于离体培养，具有高度可重复性；ｄ体细胞无性系变异小。为了建立这样一个高频再生系统应进行以下研究工作。（１）外植体的选择，首先要选择具有潜在地能较大接受外源基因能力的植物细胞类型。外植体的选择应重点考虑的问题。A 外植体生理年龄,任何植物的发育过程都要经过幼年型及成年型两个阶段。B 外植体细胞的生理状态
与其分生能力有着直接的关系。代谢活跃、休眠萌动的细胞具有更强的生长潜能，有利于培养成功。C 外植体的遗传背景.D 外植体的选择与受体系统类型的匹配。2）培养基选择，培养基是离体培养中外植体生长发育的营养环境。根据该植物对营养条件的需求选择相应的培养基。（１）植物的营养特性，供试植物的种属类型、繁殖特性、栽培条件及品种等不同，对营养条件的需求则不同。（２）选择原则，应考虑的问题包括：ａ同一物种的培养基有类同性，即同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基类型基本相同；ｂ同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同；ｃ植物组织培养时所需营养成分与田间栽培条件有相似性；ｄMS培养基是大多数植物的通用培养基； ｅ无机盐的浓度是基本培养基类型的重要因素，应该作为培养基选择的重要参数；ｆ有机成分主要是种类的变化，每种成分含量的变化不大；ｇ不可忽视培养基中碳源的种类和浓度，应该在确定基本培养基类型后研究最适的碳源种类和浓度；ｈ提高磷酸根的水平可以抵消IAA对芽的抑制作用，促进芽的分化；ｉ水解酪蛋白能加强细胞分裂素对芽的诱导分化作用， 特别是当有高水平的IAA时更为显著。在一定的范围内，酪氨酸可以有效地替代水解酪蛋白的作用。（３）激素的选择,生长素的主要功能是诱导启动细胞分裂、 促进愈伤组织形成和生根等。常用的有2,4-Ｄ、NAA、IBA和IAA。2）抗生素敏感性，植物转基因中通常有两种目的要使用抗生素：一是抑制农杆菌生长， 二是筛
选转化细胞。针对抗生素筛选的实验称之为抗生素敏感性实验。3）农杆菌敏感性试验
农杆菌介导的基因转化是目前植物基因转化中使用较广、技术较成熟的实验体系。
6 受体系统常见的问题及其解决途径：1）再生能力及其遗传稳定性，用于植物转基因的组织培养体系，其核心是创造大量的可再生细胞，且这些细胞能在继代繁殖、选择培养等过程中保持其再生能力。用于植物转基因的组织培养体系与一般的植物组织培养体系有一定差异，因作为转化体系的培养有一个较长的抗性愈伤组织筛选继代过程。植物材料（如愈伤组织）随着继代次数的增加其再生能力下降，少筛选继代次数，促进快速分化成苗，选用合适的外植体和采用最适的筛选培养基等，是解决抗性愈伤再生能力下降的主要途径。体细胞变异是遗传改良可加以利用的资源，利用组织培养创造体细胞变异用以改良作物性状。2）愈伤组织褐化是离体培养中常见的问题，褐化可发生在愈伤组织继代培养阶段，也可发生在分化植株的过程中。褐化是细胞老化、停止生长的结果。褐化愈伤组织的细胞如果没有及时的补救措施，会导致细胞的大量死亡或整个愈伤组织的死亡。愈伤组织褐化除了与品种基因型、 外植体来源、愈伤组织继代次数等有关外，培养基及培养条件常对褐化的程度具有关键性的影响。培养基中添加较高的选择和抑菌抗生素，容易造成抗性愈伤组织的褐化。3）再生植株玻璃化，离体培养再生植株的玻璃化有时的频率很高。4）影响受体系统转化效率的因素:A 农杆菌菌株（１）,农杆菌菌株类型,农杆菌染色体基因的作用直接影响T-DNA转移的效率，不同的农杆菌菌株有不同的宿主范围，并有其特异侵染的最适宿主。不同类型的农杆菌菌株的毒力不同。一般３类农杆菌菌株的侵染力的排列,农杆碱型（琥珀碱型）菌株＞胭脂碱型菌株＞章鱼碱型菌株。（２）农杆菌菌株的侵染活力,高侵染活力的菌株一般处在对数生长期。B Vir基因活化的诱导物，Vir基因活化是农杆菌Ti质粒转移的先决条件。C 外植体的类型和生理状态,正确选择外植体是植物转基因操作成功的重要条件，明确受体细胞的转化能力是选择外植体的依据。D 外植体的预培养与外植体的转化率有明显关系。每种外植体均有其最佳预培养时间，太长反而降低外植体的转化率，一般以２～3ｄ为宜。外植体的预培养有以下作用：ａ促进细胞分裂，使受体细胞处于更容易整合外源DNA的状态；ｂ田间取材的外植体通过预培养起到驯化作用，使外植体适应于试管离体培养的条件；ｃ有利于外植体与培养基平整接触。F 外植体的接种及共培养,外植体的接种是指把农杆菌工程菌株接种到外植体的侵染转化部位。常用的方法是将外植体浸泡在预先准备好的工程菌株中，浸泡一定时间后，用无菌吸水纸吸干，然后置于共培养的培养基上进行共培养。共培养即指农杆菌与外植体共同培养的过程。接种时间长或接种菌液浓度过高容易引起后续培养中的污染； 接种时间太短或接种菌液浓度过低，易造成转化效率低下。G 转化细胞的选择培养和转化植株再生（１）转化细胞的选择是基因转化的重要步骤。转化细胞和非转化细胞在非选择培养基上的生长存在着竞争，而且非转化细胞在这种条件下的生长往往更具优势，转化细胞反而生长较弱。一般在转化载体构建时就应该考虑后期转化细胞的选择问题。通常的做法是在转化载体上加入一个选择标记基因。（２）转化植株再生转化体系的转化频率高低在很大程度取决于转化植株再生系统的优劣，而再生系统的主要是培养基。筛选和优化植株再生培养基是提高转化效率的一个重要因素。
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解析质量好中差
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