《原代细胞培养》_精选优秀范文十篇
原代细胞培养
原代细胞培养
范文一：原代细胞培养之－－细胞分离技术原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。二、实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。（二）消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（1） 胰蛋白酶分散技术胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。③酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%（活力1:200或1:250）,但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。④温度 一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。⑥无机盐离子 若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。⑦消化时间 如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。分离方法如下：①过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三种：热消化多次提取 将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。冷消化多次提取 方法同上，只是消化温度为4℃。先热消化后冷消化 将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。（2） 胶原酶（Collagenase）消化法胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性（见表4-1）和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间（小时）有差异（见表4-2），以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶（对细胞表面糖基有作用），采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别项 目 胰蛋白酶 胶原酶消化特性 适用于消化软组织 适用于消化纤维多的组织用 量 0.01%～0.5% 0.1～0.3mg/mL（200u/mL）消化时间 0.5～2小时（小块） 1～12小时pH 8～9 6.5～7.0作用强度 强烈 缓和细胞影响 时间过长有影响 无大影响血清、钙、镁离子 有影响 无影响表4-2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间（小时）（0.5～1cm3）酶 种 类 较 硬 组 织 软 组 织4℃ 室 温 37℃ 4℃ 室 温 37℃胰蛋白酶（0.25%） 24～48 1～6 1～2 12～24 1～2 0.5～1胶原酶（200u/mL） 24 6 6.5 12 3 0.25两者联合（对冲） 12～46 12～24 4～12 12～24 6～12 1～2除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。2、非酶消化法（EDTA消化法）EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。消化分离法的操作步骤：（1）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。（2） 加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。注意事项如下：（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。（2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失原文地址：原代细胞培养之－－细胞分离技术原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。二、实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。（二）消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（1） 胰蛋白酶分散技术胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。③酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%（活力1:200或1:250）,但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。④温度 一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。⑥无机盐离子 若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。⑦消化时间 如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。分离方法如下：①过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三种：热消化多次提取 将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。冷消化多次提取 方法同上，只是消化温度为4℃。先热消化后冷消化 将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。（2） 胶原酶（Collagenase）消化法胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性（见表4-1）和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间（小时）有差异（见表4-2），以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶（对细胞表面糖基有作用），采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别项 目 胰蛋白酶 胶原酶消化特性 适用于消化软组织 适用于消化纤维多的组织用 量 0.01%～0.5% 0.1～0.3mg/mL（200u/mL）消化时间 0.5～2小时（小块） 1～12小时pH 8～9 6.5～7.0作用强度 强烈 缓和细胞影响 时间过长有影响 无大影响血清、钙、镁离子 有影响 无影响表4-2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间（小时）（0.5～1cm3）酶 种 类 较 硬 组 织 软 组 织4℃ 室 温 37℃ 4℃ 室 温 37℃胰蛋白酶（0.25%） 24～48 1～6 1～2 12～24 1～2 0.5～1胶原酶（200u/mL） 24 6 6.5 12 3 0.25两者联合（对冲） 12～46 12～24 4～12 12～24 6～12 1～2除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。2、非酶消化法（EDTA消化法）EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。消化分离法的操作步骤：（1）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。（2） 加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。注意事项如下：（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。（2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失
范文二：原代细胞的培养法组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下：（1）按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。（2）将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶（底面积为17.5cm）可接种20~30小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。（3）培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。原代细胞培养-22、消化培养法该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。3、悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。4、器官培养器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培23的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。1、器官培养的特殊的要求（1）需要特殊的培养条件 因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm.（2）器官内部细胞需要有足够的氧气渗入 常采用以下两种方法：a. 将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。b. 提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5% CO2,以维持pH.2、器官培养的方法（1）将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。（2）将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。（3）将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm,水平面积不超过10mm,如为肝、肾不能大于1mm.（4）将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%,培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。（5）上述器官培养1~3周（每隔2~3天换液一次）后可用于实验和检测。 22
范文三：原代及传代细胞培养原代细胞培养是建立细胞系的关键，是各种培养必须经过的阶段。原代培养的特点是组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化。原代培养细胞，所有机能上的改变主要是表型（phenotype）上的改变，不一定为体细胞突变。因此采用原代培养细胞做实验，如药物测试，基因表达测试等有其独特的优点，是组织培养工作者应熟知和掌握的技术。原代细胞培养主要有离散细胞原代培养和组织块原代培养两种方法。组织块原代培养：组织块培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织。组织块培养操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动收到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。组织块培养可按下列程序操作：1.组织块修整：将取材得到的组织块用平衡盐溶液反复冲洗，然后置于灭菌的平皿或小瓶中用眼科剪剪碎，小块的直径一般小于1mm，剪碎的组织块京自然沉降富集备用。2.贴壁与培养：用眼科镊夹取小组织块，将其摆放在培养皿或培养瓶的底面上，每个小块之间的距离为0.5-1cm。摆放时不可携带过多的培养液，摆放完毕后静止一段时间，使组织块与瓶壁贴牢后添加培养液。也可将摆放好的组织块的培养瓶底部向上置培养箱中培养2-3小时候再添加培养液。添加培养液时一定要缓慢，不可将组织块冲起。然后将贴有组织块的培养瓶或培养皿轻轻放入培养箱培养，较硬的组织块3d之内不必进行观察和换液，以免组织块浮起。培养一段时间后细胞可从小块边缘向四周游出。通过生长增殖，最终亦可连接成片。原组织小块可完全散成细胞而消失。离散细胞原代培养动物细胞在体内有严密的组织结构，群体细胞之间以固有的分化方式相互联系，相互依存。离体之后仍保持原有的组织结构特性，多数组织的形态是固体结构，细胞与细胞或细胞与细胞间质之间联系紧密，要得到大量的离散细胞，必须采取必要的措施进行人工分离（消化培养）。部分组织的细胞自然状态下士松散的，从体内取出后不经处理（如血细胞）或稍加处理（如脾细胞）就可制成细胞悬液。细胞离散后，由于每个细胞都能与赖于生长的支持物接触，营养供应均匀，因而具有适应快、增殖快、建系快等优点。通常离散细胞的原代培养要经过取材、剪切、消化、接种等操作步骤。1 取材动物种类的不同、组织不同、生命期不同，其取材的方式也有所不同。胎儿组织是原代细胞培养的常用材料，具有不易污染、生命力强、易于消化、易于培养、易于适应等优点。小鼠胚胎、大鼠胎儿、鸡胚等小动物胚胎组织的取材，可将动物麻醉或处死后整体消毒（75%乙醇浸泡），然后送入无菌室，严格按无菌操作取材。2 单细胞分离机械分离消化分离体外培养细胞的纯化原代细胞培养往往含有的细胞种类较多，多是实验需要纯化的细胞进行建系。而细胞纯化是细胞培养和细胞建系的关键技术之一。细胞纯化可分为悬浮细胞纯化和贴壁细胞纯化。悬浮细胞的纯化密度梯度离心的方法是悬浮细胞纯化的常用方法，其基本原理是细胞密度不同，大小不同，离心式的沉降速率也就不同。在离心过程中沉降速率不同的细胞，可在不同的密度梯度界面上停留，使各类细胞相互分开。此外，还可根据细胞表面抗原种类的不同分离细胞。该技术要事先制备只对目的细胞的特异性抗体，让后将抗体纯化和固化，当要分离的细胞与固化抗体接触时便可将其捕捉，从而达到分离纯化的目的。目前许多市售的免疫细胞分离柱，如依据CD4和CD8表面抗原的细胞分离柱、B细胞分离柱、T细胞分离柱、巨噬细胞分离柱等。依据贴壁速度的细胞纯化原代细胞培养初期或细胞传代时均可依据细胞贴壁速度来分离不同类型的细胞。如原代培养的巨噬细胞群中往往含有淋巴细胞，中性粒细胞，成纤维细胞等，根据大多数巨噬细胞有极易于附着在玻璃表面的特性，先将细胞群至于玻璃培养容器中数小时，此后再用培养液或PBS冲洗去除尚未附着的其他细胞，借此可得到较纯的巨噬细胞。依据对消化酶敏感性的细胞纯化细胞类型不同，对同一消化酶的敏感性不同，培养的贴壁细胞在消化时敏感的者首先从瓶壁上脱落下来，借此可将不同类型的细胞分离开来。
范文四：一、实验材料准备1.
动物出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。2.
试剂低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。3.
手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和 50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。二、方法1.
将胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的浓度，并放置于 37℃水浴中温育好。2.
解剖取材：将乳鼠放入 0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重复以上过程。取材完毕后，撤掉取材的手术器械。注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。3.
用第二套手术器械进行下列操作。用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许 0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成 1mm大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌3子的锥形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。打开磁力搅拌器电源，预先将水温调节到 37℃)，调节转速至 60 rpm左右，消化15 min(务必保证水浴温度恒定在 37℃，并且消化时间不超过 15 min)。或者，如果采用的是水浴震荡器的话，不用加搅拌子，直接放在水浴震荡器中消化亦可，转速和消化时间相同。4.
从水浴中取出锥形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血红细胞和成纤维类细胞。5.
加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液几次，机械分散细胞(组织消化后会成为粘稠的胶体状)，注意：不要过分吹打，否则会导致组织过度消化，37℃水浴搅拌再消化 10-15 min；如果乳鼠数目少(比如 5、6 只的时候)，消化时间可以减少为 5-10 min，否则很容易消化过度。上述消化处理的同时，往一支 50 ml 的一次性无菌离心管中加入 20 ml 预冷的含 10%血清的培养液，并放置冰台上。消化处理之后，小心移出上清转至上述加有培养液的离心管中，第一次消化收集的分离出的细胞，第一次消化结束后；继续第二次消化，余下的组织块加入 10 ml 新胰酶继续消化。6.
重复 5 消化步骤，直至剩余少许组织块为止，一般消化 4-5 次可以消化绝大多数的组织块(不含弃去消化液的那次)。7.
第 1、2 次含细胞的消化液放在一根离心管中，过 180 目筛网后，一起离心；第 3、4 次含细胞的消化液放在一根离心管中，过 180 目筛网后，一起离心。最后，分别用 8 ml含 20%血清的培养液重悬两管细胞，接种到一个 75 cm2的塑料培养瓶中，放置在培养箱中1.5 小时后，取出，弃贴壁细胞(主要是成纤维细胞和内皮细胞)，将未贴壁的细胞悬液取出，台盼篮拒染法计数后，加入培养液调整细胞浓度为5-6x105个/ml，接种到目的培养器皿中。5.
一般不用加BrdU，如果培养时间长(发现成纤维细胞也极少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纤维细胞增殖。加了BrdU，心肌细胞搏动的持续时间会更长。9.
接种后 24 小时，用温的培养基或者平衡盐液轻轻冲洗培养的心肌细胞一次，以去处未贴壁的细胞(部分细胞会在 24 小时后贴，结果很多细胞重叠生长)，再更换培养液，即可。可以按照实验需要在培养 48 h 或 72 h 后施加处理因素。三、 结果心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在 24 h左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好， DMEM培养基在初始培养时为深红色，两天后变为淡黄色，应该是营养成分下降的表现，也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充。鉴定的最简单的办法就是搏动与否，注意：当搏动比较微弱的时候，在 10 倍物镜下可能看不到搏动，换成20 或40倍的物镜可能能观察到。检验操作是否合格的最好的办法就是看心肌细胞的纯度和搏动能力。另外，心肌细胞表达肌动蛋白，可以作为鉴定，但不是唯一的特征性指标，因为平滑肌细胞也表达。
范文五：细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。原代培养的方法有：a. 组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。b. 酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养 。【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA混合消化液。4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。2.无菌条件下暴露子宫。3.用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜， 剪断子宫角。4.取出整个子宫，置于盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。用PBS洗涤3次，弃除表面残余血迹。5.沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。充分洗涤，清洗表面。6.用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜。用PBS洗涤3次。7.去除胚胎头部、内脏和四肢。将躯干部置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞。(二)小鼠胚胎成纤维细胞的培养：1.用无菌眼科小剪刀或剃须刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。2.室温下静置1min。弃上层液，留下胚胎组织碎块。3.添加胎牛血清接种到培养瓶内。每5-30个鼠胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。静置5min后，倒置加入适量培养液，并倒置在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。4.2-3小时后,将培养瓶翻转过来，使培养液覆盖植块。继续在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。5.培养开始的前两天不要晃动培养瓶。第三天见植块附着在培养瓶壁，周围生长出细胞。补充培养液，继续培养，每天倒置在显微镜下观察。过4天后在倒置显微镜下观察拍片。【实验结果】图二 小鼠胚胎成纤维细胞原代培养【结果分析】从照片来看，细胞原代培养较成功，大部分细胞活性较好，呈梭形附着与瓶壁上，密度适中，死细胞较少。可继续进行后续传代培养。【注意事项】1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。2.要注意无菌操作。其要求应高于外科手术。3.运用消化法时胰酶温度应小于370C，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1—10分钟，而是至少20分钟，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中可存活10分钟以上。如果胰酶作用过强，则这些细胞膜易被损伤而不易生存。4.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。【思考题】一、如何提高原代细胞培养的成功率？答：1. 在选择材料的时候一定要注意选取比较健康的小鼠。在处理胚胎的时候要干净利落。不要把胳膊等部位的细胞混进去了。2. 操作一定要无菌，不能污染。在剪碎细胞的时候，一定要注意尽量剪得碎一点。3. .运用消化法时胰酶温度应小于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半4. 如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。5. 取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。二、为克服微生物污染应采取那些措施？答：超净工作台紫外线处理30分钟, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用洗涤液拭擦双手消毒。用75%酒精擦双手、移液器消毒 。枪头要灭过菌才可用。滴管以及试管等要过酒精灯火焰。枪头伸进容器内后最好更换之后再取别的液体。要注意更换剪刀，培养皿等实验工具。不能够交叉污染。再者，不能够在实验的时候将手从实验台中拿出，随意的摸其它东西。
范文六：实验五 细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。二者可分别使用，也可共同使用。钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。原代培养和传代培养的细胞依据其生长状态，可分为贴壁生长细胞与非贴壁生长细胞。 一般说来，来自外周血的细胞，如红细胞、白细胞、白血病细胞等都是非贴壁细胞；而来自其他组织的细胞则多为贴壁细胞。贴壁细胞依照其镜下特征，可分为以下4种类型。① 成纤维型细胞。②上皮型细胞。③游走型细胞。④多形型细胞。本次实验中原代培养的为兔肾成纤维细胞，生长状态良好时为标准的成纤维型细胞。传代培养的HeLa细胞为黑人宫颈癌细胞，为标准的上皮型细胞。3.实验材料3.1器材:手术器械一套，直径9cm培养皿一套，培养瓶4个，吸管3支，离心管2个(以上用品为每只乳兔所用)，C02培养箱，超净工作台，酒精灯，倒置显微镜，HeLa细胞。3.2试剂：0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液，RPMI-1640培养液 (含5%小牛血清)，0.01%PBS，75%乙醇。3.3动物：乳兔4.实验方法4.1细胞的原代培养4.1.1方法① 取材: 用颈椎脱位法处死乳兔，然后把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中，数秒消毒后取出(注意：浸泡时间过长，乙醇从口和肛门侵入体内会影响组织生长)，携入超净台，放在大平皿中。分别用碘酒和乙醇进行一次背部消毒，再用消毒过的剪刀剪开乳兔背部的皮肤和肌肉，取出肾脏，置于另一个无菌培养皿中。②切割: 用灭菌的PBS液将取出的肾脏清洗3次，然后用眼科剪刀和镊子仔细将肾脏外包膜除去，之后将组织反复剪碎，直至剪成0.5～1mm3左右的小块。再用PBS液清洗，直至组织块发白为止。然后移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到离心管的管底，弃去上清液。 ② 消化分离: 吸取0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，加上胶塞，在37℃水浴箱中消化8～10分钟，每隔几分钟轻轻摇动一下离心管，使组织与消化液充分接触。消化结束后静置3分钟，吸去上清。④接种培养：向离心管中加入5～10ml含5%小牛血清的1640培养液，用吸管吹打混匀，移入2个培养瓶中。盖好瓶塞，做好标记，置于C02培养箱中37℃培养。4.1.2结果观察细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5～7天即可形成单层。4.2细胞的传代培养4.2.1方法① 将长成单层的细胞从CO2培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少量消化液 (以液面覆盖住细胞即可)，之后立即弃掉消化液。②静置3～5分钟，加入3～5ml新鲜培养液(在酒精灯上进行操作)，吹打，制成细胞悬液。 ③将细胞悬液吸出2ml左石，加入另一无菌培养瓶中(在酒精灯上进行操作)，并向每个培养瓶中分别加入3ml左右培养液，盖好瓶塞，做好标记，送回二氧化碳培养箱中，37℃继续进行培养。4.2.2结果观察一般情况下，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶的壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，并需要再次传代。5.结果与讨论5.1绘出镜下所见贴壁生长的兔肾细胞及HeLa细胞的形态。5.2讨论在细胞培养的过程中避免污染的关键环节。6.注意事项6.1细胞培养十分重要的事项是整个过程都要注意无菌操作。操作者操作前要洗手，并用75%乙醇消毒或0.2%新洁尔灭泡手。6.2使用的超净工作台在操作前用紫外线照射20～30分钟，并打开吹风机。6.3培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞。打开之前要用75%乙醇瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下。打开瓶口后全部操作过程都要在超净台内完成。操作完毕，加上瓶塞，才能拿到超净台外。6.4使用吸管时，从消毒筒(或消毒纸)中取出时要用手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上乳胶皮头，然后再去吸取液体。6.5细胞培养过程中要每隔一日进行常规检查，观察是否有污染，细胞生长是否正常。如果溶液清晰、透亮，细胞贴壁生长并沿壁延伸，说明无污染；如果溶液变黄或浑浊，表明已污染，培养失败。6.6使用CO2培养箱培养时，由于CO2增多，可使液体变黄，这时可更换培养液继续培养。7.思考题7.1细胞原代培养和传代培养有什么区别？培养细胞有何用途？7.2培养细胞为什么会发生形态变异？实验五 细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。二者可分别使用，也可共同使用。钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。原代培养和传代培养的细胞依据其生长状态，可分为贴壁生长细胞与非贴壁生长细胞。 一般说来，来自外周血的细胞，如红细胞、白细胞、白血病细胞等都是非贴壁细胞；而来自其他组织的细胞则多为贴壁细胞。贴壁细胞依照其镜下特征，可分为以下4种类型。① 成纤维型细胞。②上皮型细胞。③游走型细胞。④多形型细胞。本次实验中原代培养的为兔肾成纤维细胞，生长状态良好时为标准的成纤维型细胞。传代培养的HeLa细胞为黑人宫颈癌细胞，为标准的上皮型细胞。3.实验材料3.1器材:手术器械一套，直径9cm培养皿一套，培养瓶4个，吸管3支，离心管2个(以上用品为每只乳兔所用)，C02培养箱，超净工作台，酒精灯，倒置显微镜，HeLa细胞。3.2试剂：0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液，RPMI-1640培养液 (含5%小牛血清)，0.01%PBS，75%乙醇。3.3动物：乳兔4.实验方法4.1细胞的原代培养4.1.1方法① 取材: 用颈椎脱位法处死乳兔，然后把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中，数秒消毒后取出(注意：浸泡时间过长，乙醇从口和肛门侵入体内会影响组织生长)，携入超净台，放在大平皿中。分别用碘酒和乙醇进行一次背部消毒，再用消毒过的剪刀剪开乳兔背部的皮肤和肌肉，取出肾脏，置于另一个无菌培养皿中。②切割: 用灭菌的PBS液将取出的肾脏清洗3次，然后用眼科剪刀和镊子仔细将肾脏外包膜除去，之后将组织反复剪碎，直至剪成0.5～1mm3左右的小块。再用PBS液清洗，直至组织块发白为止。然后移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到离心管的管底，弃去上清液。 ② 消化分离: 吸取0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，加上胶塞，在37℃水浴箱中消化8～10分钟，每隔几分钟轻轻摇动一下离心管，使组织与消化液充分接触。消化结束后静置3分钟，吸去上清。④接种培养：向离心管中加入5～10ml含5%小牛血清的1640培养液，用吸管吹打混匀，移入2个培养瓶中。盖好瓶塞，做好标记，置于C02培养箱中37℃培养。4.1.2结果观察细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5～7天即可形成单层。4.2细胞的传代培养4.2.1方法① 将长成单层的细胞从CO2培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少量消化液 (以液面覆盖住细胞即可)，之后立即弃掉消化液。②静置3～5分钟，加入3～5ml新鲜培养液(在酒精灯上进行操作)，吹打，制成细胞悬液。 ③将细胞悬液吸出2ml左石，加入另一无菌培养瓶中(在酒精灯上进行操作)，并向每个培养瓶中分别加入3ml左右培养液，盖好瓶塞，做好标记，送回二氧化碳培养箱中，37℃继续进行培养。4.2.2结果观察一般情况下，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶的壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，并需要再次传代。5.结果与讨论5.1绘出镜下所见贴壁生长的兔肾细胞及HeLa细胞的形态。5.2讨论在细胞培养的过程中避免污染的关键环节。6.注意事项6.1细胞培养十分重要的事项是整个过程都要注意无菌操作。操作者操作前要洗手，并用75%乙醇消毒或0.2%新洁尔灭泡手。6.2使用的超净工作台在操作前用紫外线照射20～30分钟，并打开吹风机。6.3培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞。打开之前要用75%乙醇瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下。打开瓶口后全部操作过程都要在超净台内完成。操作完毕，加上瓶塞，才能拿到超净台外。6.4使用吸管时，从消毒筒(或消毒纸)中取出时要用手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上乳胶皮头，然后再去吸取液体。6.5细胞培养过程中要每隔一日进行常规检查，观察是否有污染，细胞生长是否正常。如果溶液清晰、透亮，细胞贴壁生长并沿壁延伸，说明无污染；如果溶液变黄或浑浊，表明已污染，培养失败。6.6使用CO2培养箱培养时，由于CO2增多，可使液体变黄，这时可更换培养液继续培养。7.思考题7.1细胞原代培养和传代培养有什么区别？培养细胞有何用途？7.2培养细胞为什么会发生形态变异？
范文七：原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2?m滤膜过滤，4℃保存。(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2?m滤膜过滤，-20℃储存。使用时，取6?l母液加入2ml培养液中，终浓度为3?g?ml-1。（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。(3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。(4) 在离心管中加入2ml的种植液，用口径递减的吹打管轻轻吹打海马碎片数次，将上清液吸出备用，再加入2ml的种植液后，用吸管吹打数次，将上清液吸出备用，如此反复数次，至海马碎片全部被吹打散开。（每次吹打10次，吹打时注意不要吹入空气，吹打尽量轻柔）(5) 吸出的上清液再加入种植液调整其浓度，用200目细胞筛过滤。(6) 将上述滤过的液体混匀后分装入已涂有0.1mg?ml-1多聚赖氨酸的96孔板上，使分散的细胞计数约为0.3x106?ml-1。然后将96孔板放入9%CO2，37℃细胞培养箱中培养。(7) 12h后观察细胞，镜下可见多数细胞贴壁生长。生理盐水冲洗细胞2遍以上以去除细胞碎片然后换上已平衡好的饲养液。(8) 培养36h后加入阿糖胞苷3?g?ml-1以抑制胶质细胞的分裂生长。(9) 加入阿糖胞苷后12h换液。以后每3d半量换液，饲养至7～14d可以进行实验。(10) 或种板40min后，更换饲养液。种板后12h，更换饲养液。然后每3天半量换液。
注：第一种方法细胞纯度高，但对细胞损害较大，需要较高培养技术。培养的细胞适用于MTT等实验。第二种方法细胞纯度较高，对细胞损害较小，细胞状态好。培养的细胞适用于膜片钳
范文八：一.细胞培养的基本原理细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。如心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%;而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95%以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程;用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象;还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。此外，还能节约研究费用。如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。但细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。二.细胞培养的基本设备与用品(1)细胞培养的基本设备细胞培养的基本设备有：CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。(2)常用的实验用品1.玻璃器皿细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶[有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积(平方厘米)表示];培养皿(直径有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格);离心管(5毫升，10毫升);注射器(1毫升，5毫升等);用生理盐水瓶代替的贮存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它还有尖吸管和移液管，载玻片(厚度0.8～1.2毫米)，盖玻片(厚度0.12毫米)，贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管(1.5毫升，2毫升)等。2.塑料品多孔培养板规格有4、6、12、24、96孔等，培养皿直径有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品经消毒灭菌密封包装，供一次性使用，重复使用的需经特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均匀，有的表面经特殊处理，细胞易于生长。3.器械解剖刀、眼科剪和镊(直头和弯头)、中号圆头镊、止血钳等。4.杂用品金属饭盒、试管架、各种规格胶塞、记号笔、搪瓷盘、吸头(吸取液体的胶帽)、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。组织培养中使用最多的是吸管、培养瓶、培养皿及各种瓶塞。实验者手中应有三套器材，瓶塞数要大于瓶数，才能保证实验中的循环使用。三.细胞培养用品的清洗与消毒灭菌(1)清 洗1.常用玻璃器皿清洗◇清洗要领浸泡初次使用的玻璃器皿呈碱性，表面常附有灰尘和一些对细胞有毒的物质，如铝和砷等。空气湿度高时，玻璃器皿表面又易长霉。使用前，新器皿浸泡在5%稀盐酸中过夜，以中和玻璃表面的碱性物质并去除霉斑;然后经简单刷洗，流水冲洗(逐片进行)，蒸馏水浸泡，干燥备用。新玻片处理后，短时间不用时，需将它投入95%的酒精中保存，以防玻片长霉。培养后的玻璃器皿应立即投入清水中浸泡，器皿中残留的细胞、蛋白质一旦干涸，即固着于玻璃表面，极难脱落。
刷洗用过的玻璃器材经自来水冲洗后，浸入水中煮沸，然后将适量洗涤剂(洗洁精或洗衣粉)投入沸水中继续煮沸10分钟，趁热刷洗器皿内外，刷洗后浸入清水中进行冲洗。酸泡刷洗好的玻璃器材干燥后置清洁液中浸泡24小时，清洁液的强氧化作用可清除刷洗不掉的极微量杂质。◇清洗步骤玻璃器材煮沸10分钟→刷洗→流水振荡冲洗15-20遍→50℃烤干→清洁液浸泡24小时→流水振荡后冲洗15-20遍→漓水→蒸馏水浸泡2次(每次24小时)→50℃烤干，待包装。◇清洗注意事项和要求①使用后的实验器材应立即投入清水中。②浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。③刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗，不得残留洗涤剂、清洁液。方法是：每瓶灌2/3容积的自来水，振荡后倒掉，重复15—20次(尖滴管置量杯中冲洗)。④煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂(直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右)。若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂，均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化，pH值上升。⑤软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂，会改变培养液pH值和毒害细胞。⑥清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落入灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。⑦使用后的胶塞与玻璃器材同时煮洗时，胶塞要放在煮锅的底部。⑧浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水Ⅰ盆”、“蒸馏水Ⅱ盆”。⑨器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，省时又保证清洗质量。⑩用超声波仪清洗器材时，清洗要求同上。2.橡胶制品的清洗新购置的橡胶制品(胶塞、胶管、橡皮乳头)的洗涤方法如下：0.5摩尔/升NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→0.5摩尔/升HCl煮沸15分钟→流水冲洗→自来水煮沸2次→蒸馏水煮沸20分钟→50℃烤干备用。这样处理可完全除净胶塞上的硫磺等有毒物质。用过的胶塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因胶塞使用面常沾有洗涤剂，流水冲不净，故胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，用刷逐个刷洗。在使用过程中，胶塞不能与培养液接触，以防未洗净的胶塞污染培养液和细胞。3.G6除菌滤器的清洗新G6除菌滤器置玻璃洗液中浸泡24小时，流水缓慢冲洗，至pH值为5.5左右，然后用4倍的蒸馏水缓慢冲洗，再用重蒸馏水缓慢冲洗，烤干，包装消毒备用。用过的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意：滤器千万不能干涸)过夜，流水缓慢冲洗24小时或更长时间，至滤面基本疏通时，50℃烤干，滤器再置清洁液中浸泡24小时，或装满清洁液自然过滤。流水冲洗及其后的处理同新G6除菌滤器。4.正压除菌滤器的清洗新的或使用后的正压滤器经稀洗涤剂刷洗一流水冲洗15分钟→漓水→去离子水浸泡24小时→三蒸水浸泡24小时→干燥备用。5.塑料制品的清洗塑料制品质地软且耐腐蚀能力强，但不耐热，易出现划痕。其清洗程序为：器皿用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布、棉签和50℃稀洗液刷洗→流水冲洗(人工冲洗15—20遍)→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗→蒸馏水浸泡两次(每次24小时)→晾干备用。6.清洗液的配制清洁液新配制的清洁液为棕红色，遇有机溶剂或水分增多时变成绿色，表明失效。先在搪瓷盆中加入蒸馏水，加热溶解重铬酸钾，再将盆置流 动自来水中，待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。玻璃滤器洗液取10克硝酸钠和28.6毫升浓硫酸，放入盛有470毫升蒸馏水的玻璃缸内混匀备用。小鼠肝细胞的原代培养实验目的：探究小鼠肝细胞分离和原代培养的方法。1 材料与方法1.1 动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。1.2 试剂 D-hank's液；消化液Ⅰ：含1g/L胰蛋白酶、10g/L聚乙烯吡咯烷酮
(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3g/L EDTA；消化液Ⅱ：含2g/L胶原酶Ⅳ及10g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml、 50mmol/L HEPES、30g/L谷氨酰胺；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5μg/ml 、转铁蛋白5μg/ml 、促甲状腺素释放因子10－6mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20μg/ml、氢化可的松10－6mol/L。1.3 鼠肝组织块培养1）取小鼠20只断头放血处死，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃ D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12min，再加入数滴血请终止消化。5）将消化好的肝组织块用注射器栓轻轻研磨至糊状，用双层纱布去除组织屑，再经200尼龙网过滤后1000r/min离心5分钟去上清。再用无血清培养液洗三次去除胰酶，加入20%胎牛血清的培养液重悬，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数大于85%1.4 鼠肝细胞原代培养将活力在85%以上的肝细胞调整到5?10/ml左右，转移至25cm培养瓶中，37℃、5%CO2条件下培养。24h首次换液，以后每两天换液，并以20%胎牛血清继续培养。1.5 肝细胞形态观察及其功能测定原代培养前三天尽量不晃动培养瓶，以后每天观察细胞生长情况，每次换液前收集培养上清放-20℃保存，送本院检验科测定蛋白含量。1.6 电镜检测待细胞生长成单层后倾去培养液刮取单层细胞加入25ml/l戊二醛固定后按常规方法制片，电镜（opton EM 10C，德国）观察细胞结构2 预计结果原代组织块培养一般三天后组织块周围有生长晕出现，并逐渐向周围扩散，单层细胞三天后已贴壁生长。光镜下可见培养的肝细胞呈三角形圆形或类圆形，排列整齐，细胞界限清晰，胞浆丰富透亮。细胞有单核或双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。 5
范文九：利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。培养中应该注意以下事项：①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法 似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意 取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮 下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出．②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可 能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污 染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时 可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后 续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验， 重新培养．③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其 表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特 别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内 完成．④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应 太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要 减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好 在开始3 d内不换液． ⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％， 培养瓶为开放式 ．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情 况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同 时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据自己实验室 的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口， 其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以 保持适宜的酸碱度．⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其 中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应 尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞 ．因此，应在各个 阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他 污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的 浪费．
范文十：一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1 材料与方法1.1 动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。1.2 试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。1.3 鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃ D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块， 再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化 液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。1.4 鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃ 50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者：1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃ D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块， 再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化 液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离；5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用；6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块；7）再次离心5min，弃上清；8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清；9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数；10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。1.5 肝细胞形态观察及其功能测定原代培养前3 d尽量不晃动培养瓶，以后每天观察细胞生长情况，每次换液前收集培养上清放－20℃保存，送本院检验科测定白蛋白含量。1.6 电镜检测待细胞生长成单层后倾去培养液刮取单层细胞加入25 ml/L戊二醛固定后按常规 方法制片，电镜(Opton EM10C,德国)观察细胞结构。2 结果2.1 细胞生长情况观察原代组织块培养一般3 d后组织块周围有生长晕出现，且逐渐向周围扩展，单层细胞3 d后已贴壁生长。光镜下可见培养的肝细胞呈三角形、圆形或类圆形，排列整齐，细胞界限清晰，胞浆丰富透亮。细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。