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斜纹夜蛾Spodoptera+litura+Fabricius卵黄原蛋白受体基因的分子特征和功能分析及其对重金属锌、铅胁迫的响应.pdf 189页
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--------------------------Page1------------------------------中山大学博士学位论文斜纹夜蛾SpodopteralituraFabricius卵黄原蛋白/受体基因的分子特征和功能分析及其对重金属锌、铅胁迫的响应姓名：舒迎花申请学位级别：博士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：张古忍--------------------------Page2------------------------------舒迎花中ljJ人学博士论文lituraFabricius卵黄原斜纹夜蛾Spodoptera蛋白／受体基因的分子特征和功能分析及其对重金属锌、铅胁迫的响应学生：舒迎花导师：张古忍教授专业：农业昆虫与害虫防治摘要卵黄发生(Vitellogenesis)是昆虫卵巢成熟的关键，直接影响昆虫的繁殖力。昆虫Vg由雌虫脂肪体合成，分泌到血淋巴中，通过卵黄原蛋白受体(Vitellogenin黄蛋白(Vitellin，Vn)晶体形式积累在卵母细胞中，为胚胎发育提供营养来源。昆虫Vg为雌性特异性蛋白，其发生过程受到激素调控，对重金属等环境雌激素反应敏感。通过检测动物Vg的变化，可以监控和评价环境雌激素污染的程度。因此，害虫Vg和VgR的分子特征和功能研究不仅有助于深入理解害虫生殖的分子机制，为农业生产中探求合理的害虫防治方法提供理论基础，而且可为利用昆虫Vg作为生物标记物监控环境雌激素污染提供理论依据。litura本文以斜纹夜蛾Spodoptera克隆和分析了垤和瞻尺基因的分子特征：运用RNAi技术抑制了瞻和瞻尺基因的表达和调控了此虫生殖；采用饲料重金属胁迫法，研究了锌(Zinc，Zn)和铅(Lead，Pb)对此虫生殖以及Vg的影响。主要结果如下：1．克隆了瞻cDNA和部分VgRcDNA，命名为研瞻(登录号EU095334)和SlVgR(未登录)。彤冶全长5339bp，ORF为5247bp，编码1748个氨基酸；1Willebrand943和vonfactordomain，DUFVg包含三个保守区域(Vitellogenin—NDtypeI--------------------------Page3------------------------------舒迎花lfIth人学博十论文己克隆3342bp，编码1113个氨基酸，属于低密脂蛋白受体(10wdensitylipoproteinreceptor，LDLR)基因家族，包含4个LDLo保守结构。mRNA在雌性脂肪体中特异表达，开始表达的时间是第6天蛹，表2．研Vgbloth达到最高峰，随后逐渐减少；Western达水平随着发育阶段增加，成虫羽化24mRNA表达模式相分析表明血淋巴中的Vg仅在雌虫中出现，分向模式与斟Vg似，但发生时间推后24mRNA仅在雌虫的卵巢中表达，开始表达的时h。SlVgR间是第6天蛹，随着发育阶段增力B，成虫羽化36h表达量达到最高峰，随后急mRNA表达相似，但开始出现时间推迟剧减少；VgR蛋白的分布模式与SlVgRh。了24h，而最高峰提前了12dsRNA是RNAi干扰彤瞻的最佳时期和最佳浓3．第4天蛹注射3烬研Vg度。RNA干涉Vg后，卵巢发育滞后且异常，产卵量显著减少，研嗜表达受抑dsRNA，在成虫后期阶段起到干扰作用，但对蛹期没有制；第6天蛹注射研Vg影响；在斜纹夜蛾发育的蛹和成虫阶段注射5嵋研瞻dsRNA会影响斜纹夜蛾dsRNA后产卵量虫体的发育，导致死亡；第4或6天蛹注射3“g或5肛gSIVgR显著减少，羽化24h雌成虫血淋巴中Vg显著增加；幼虫和刚羽化成虫注射dsRNA不影响斜纹夜蛾卵巢发育、产卵量和Vg。4．高浓度Zn和Pb胁迫影响斜纹夜蛾生殖。750mgZn／kg胁迫下，斜纹夜蛾生殖参数(产卵天数、产卵力、生育力、孵化率和卵的重量)显著下降，分别是对照的66．67％、31．43％、20．95％、48％和64．97％；能引起斜纹夜蛾生殖参数显著减少的最低Pb浓度是25mgPb／kg；200mgPb／kg胁迫后，生殖参数分别是h雌成虫脂肪体中彤嗜蛾瞻mRNA和Vg蛋白水平下降。Zn胁迫后，羽化24mRNA表达和血淋巴中Vg水平随着饲料中Zn浓度增加而显著减少：S／vg开始表达的时间延迟1．2天；雄成虫脂肪体中的研瞻没有表达，血淋巴中也检测不到Vg蛋白；卵中积累的Vn在750mgZn／kg胁迫后显著下降，仅对照的38．7％，而150和300mgZn／kg显著提高Vn的积累，分别是对照的1．87和1．65倍。Pb胁迫后，羽化24h雌成虫脂肪体中彤冶表达和血淋巴中Vg水平随着饲料中Pb浓度增加而减少：S／Vg开始表达的时间提前了2—3天；在12．5和25mgPb／kg处理后雄成虫脂肪体中的彤
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请教反转录cDNA的体系中，Random 6 mers是什么啊？
请教反转录cDNA的体系中，Random 6 mers是什么啊？
tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail），试剂盒中有说明，但因其只结合Poly A尾巴、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物;端，引物序列为5&#39，还有另一个;，当只扩增一种目的基因时;L，特异性差。Total RNA试剂盒中没有标明使用量;端均含有-OH、mRNA。还有一种情况，因此可往两端延伸，但你这里的使用量应该有点大，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。最好自己认真看下试剂盒说明书。包括rRNA。两种引物可据实际情况使用一种，不同点可以自己去看试剂盒说明书;L体系可最大使用500ng的Total RNA，对于较长的mRNA;PrimeScriptTMBuffer中含有dNTP Mixture和Mg2+。这是其中的一个反转录体系、真核生物的rRNA，也可同时使用，根据自己提取的RNA浓度来确定，10&mu.5&mu这个体系是TaKaRa反转录试剂盒中的体系，稍有不同的是第二个PrimeSciptTMRT Enzyme Mix I，特点是产物量大。这个体系是基于采用的Total RNA模板非常良好或已经处理而建立的，试剂盒中为0，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物;端和3&#39，经常不能延伸到5&#39。5&times。（原核生物的RNA。Random 6 mers为随机的6核苷酸引物，因而特异性好;-(P)NNNNNN-3&#39，其5&#39。Oligo dT Primer适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而体系中没有加入RNase Inhibitor
反转录时,体系一样,都按照1000ng反转,42度保温时间长短对反转录结果有影响吗?会不会影响cDN...：
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【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题
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【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题
各位高手请不吝赐教。。感激不尽。。。
我做的RNA反转，现在提到的RNA浓度有1000ng/μl，然后用的TAKARA的反转试剂盒。
是要做荧光定量的，所以想先做个普通的PCR看看引物的效果。。。
请教大家用一个25μl的体系怎么样，怎么配比较好？。
我是新手。。。完全没有概念。。。
加cDNA模板的浓度要求是多少？
谢谢大家⊙﹏⊙b。
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不要超过PCR体系的10%。
逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。
另外，配制PCR体系，每种成分的加样量不要低于1ul，不然实验重复性会非常糟糕了；引物和PCR成分可以事先预混，cDNA可以稀释后再加。
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原帖由 fangxiang 于
11:40 发表
不要超过PCR体系的10%。
逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。
另外，配制PCR体系，每种成分的加样量不要低于1ul，不然实验重复性会非常糟糕了；引物和PCR成分可以事先预混，cDNA可以稀释 ... 谢谢您的指点。。我是不是可以把除了 模板和taq酶之外的其他组分先配成MIX，然后分到每个管中？。。。我师姐说必须要按顺序一个一个的加。。。但是我觉得先混合成MIX没有区别啊
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如果用相同的引物，可以把模板之外的所有成分预混，最好所有PCR成分都预冷，预混后放冰上。
在冰上操作是为了减少非特异性扩增，因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理：各成分绕PCR管加在壁上或者盖子上，最后离心混合，也是为了减少非特异性扩增。但是那样做的话加样误差太大，实验重复性不高。
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原帖由 whitesheep 于
11:40 发表
如果用相同的引物，可以把模板之外的所有成分预混，最好所有PCR成分都预冷，预混后放冰上。
在冰上操作是为了减少非特异性扩增，因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理：各成分绕PCR管加在壁上或者盖子 ... 谢谢你的指点。那混合后能不能涡旋一下？我听有人说有酶的都不能涡旋。。。但是我们一直都是涡旋一下再离心。。。
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Taq 和pfu之类的酶都很强悍的，涡旋一下不会有影响的
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建议不要把引物和buffer还有酶预混，酶在低温也是有活性的，容易形成引物二聚体，而且万一你的引物设计的有问题，那你混好的东西就全浪费了。
1000ng太高了，可以稀释成100ng/ul，然后加1ul就够了，甚至有人告诉我她用30ng也能扩出来，不过我一直用100ng
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原帖由 555444 于
11:41 发表
建议不要把引物和buffer还有酶预混，酶在低温也是有活性的，容易形成引物二聚体，而且万一你的引物设计的有问题，那你混好的东西就全浪费了。
1000ng太高了，可以稀释成100ng/ul，然后加1ul就够了，甚至有人告诉我她用30ng也能扩出 ... 那么除了酶、模板之外其他的成分（buffer,mg,dNTP,水）先混起来做个Mix应该没有问题。对吧。。
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原帖由 @STAR@ 于
11:41 发表
那么除了酶、模板之外其他的成分（buffer,mg,dNTP,水）先混起来做个Mix应该没有问题。对吧。。 恩，不过一定要按比例混匀，每次拿出来P的时候也最好涡旋一下
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原帖由 555444 于
11:42 发表
恩，不过一定要按比例混匀，每次拿出来P的时候也最好涡旋一下 你好，你一直用的100ng/ul 是在做普通PCR时的cDNA的用量吗？