如何验证目的基因扩增和内参基因扩增的扩增效率一致

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-05-01 20:11 标签： qpcr扩增效率
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肥胖小鼠内脏与皮下脂肪Visfatin基因表达
□ 林纬[1] 刘小莺[1] 周文娟[2] 林益川[1] 郑培烝[2] 刘礼斌[1]
[1]福建医科大学附属协和医院内分泌科 ,福州]福建医科大学附属协和医院检验科,福州350001
摘　要:目的观察肥胖对小鼠内脏脂肪和皮下脂肪组织Visfatin基因表达的影响。方法高脂饮食喂养刚断乳雄性c57BL/6小鼠8周,诱导营养性肥胖模型。8周后,筛选肥胖小鼠,普通饲料组作为正常对照,实时荧光定量RT-PCR方法检测Visfatin的基因表达,分别进行Visfatin基因表达与体质指数、内脏脂肪组织含量及体脂指数相关性的分析。结果肥胖组小鼠内脏脂肪组织Visfatin表达明显升高,是对照组的4.76倍（95%可信区间为3.68-6.15,P〈0.01）;腹部皮下脂肪组织Visfatin表达与对照组比较无明显差异（95%可信区间为1.13±1.51,P〉0.05）。结论Visfatin在营养性肥胖c57BL/6小鼠内脏脂肪组织中高表达暗示了它可能在肥胖的发生发展中发挥重要的作用,肥胖可能是导致Visfatin基因表达升高的原因之一。
作者单位：福建医科大学 附属协和医院内分泌科；检验科，福州
350001【摘要】&
观察肥胖对小鼠内脏脂肪和皮下脂肪组织visfatin基因表达的影响。
高脂饮食喂养刚断乳雄性c57bl/6小鼠8周，诱导营养性肥胖模型。8周后，筛选肥胖小鼠,普通饲料组作为正常对照，实时荧光定量rt?pcr方法检测visfatin的基因表达，分别进行visfatin基因表达与体质指数、内脏脂肪组织含量及体脂指数相关性的分析。
肥胖组小鼠内脏脂肪组织visfatin表达明显升高，是对照组的4.76倍（95％可信区间为3.68～6.15,p0.05）。
visfatin在营养性肥胖c57bl/6小鼠内脏脂肪组织中高表达暗示了它可能在肥胖的发生发展中发挥重要的作用，肥胖可能是导致visfatin基因表达升高的原因之一。
【关键词】& 肥胖症 细胞因子类 脂肪组织 疾病模型 动物
　　visfatin是fukuhara等于2005年发现的一种脂肪因子,与先前在淋巴细胞中发现的一种称为前b细胞克隆增强因子（pre?b cell colony?enhancing factor，pbef）的免疫蛋白结构一致，由于其主要由内脏脂肪组织分泌产生，因此将之命名为visfatin，即内脏脂泌素[1]。国外研究表明，visfatin可结合并激活胰岛素受体,模拟胰岛素作用,从而降低血糖；还能够促进脂肪组织的分化、合成及储积[1]。因此，它很可能是与糖尿病和肥胖有关的一个肽类激素。本研究拟通过高脂膳食筛选肥胖的c57bl/6小鼠，通过荧光实时定量rt?pcr方法检测肥胖小鼠内脏和腹部皮下脂肪组织visfatin基因表达的影响。
　　1& 材料与方法
　　1.1& 实验动物及饲料配制& （1）选用健康、雄性、出生21 d左右的c57bl/6小鼠，体质量8.5～10.0 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[许可证号：scxk(沪)]。（2）普通饲料：玉米粉30％，豆饼21.0％，麸皮10.0％，次粉28.0％，鱼粉9.0％，酵母粉1.0％，鱼肝油1％（g/100 g）等。高脂饲料：猪油12.0％，奶粉8.0％，鸡蛋10.0％，花生5.0％，麻油3.0％，以普通饲料补足100 g混成含12％猪油的高脂饲料[2]，食用前2 d配好，低温保存。
　　1.2& 动物模型的制备& 将39只c57bl/6小鼠适应性喂养1周后，按随机数字法随机分为2组：对照组10只，喂普通饲料；实验组19只，喂高脂饲料。自由饮水，每日早晚2次喂食（昼夜比12∶12）,食后不再添加，共饲养8周。每周称体质量1次。8周后，以体质量超过（x对照组体质量＋2 s）作为肥胖标准,筛选出营养性肥胖小鼠10只（10/19）作为肥胖组。
　　1.3& 标本收集及处理& 实验结束后，自由饮水，禁食12 h后以3％戊巴比妥钠，45 mg/kg腹腔注射麻醉。下腔静脉采血，室温静置4 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-70 ℃保存待测。迅速摘取肾脏周围、肠系膜周围、附睾周围以及腹部皮下（肋弓以下―腹股沟以上，两侧以腋中线为界）的脂肪组织，称取湿质量。所取脂肪组织立即装入无rnase的eppendorf管，用液氮速冻，-70 ℃保存备用。
　　1.4& 检测方法& 体长：从c57bl/6小鼠鼻尖到肛门的长度（cm）；体质指数，即lee's指数=体质量（g）&103/体长（cm），脂肪垫总质量（g）＝肾脏周围脂肪组织＋附睾周围脂肪组织；体脂指数=脂肪垫总质量（g）／湿质量（g）。血脂测定：胆固醇(tc)为胆固醇氧化酶法；甘油三酯(tg)为gpo酶法，试剂购自美国beckman公司；高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)均为酶法检测，试剂购自英国randox公司，由美国bckman cx7全自动生化分析仪检测。
　　1.5& visfatin mrna检测& trizol(invitrogen)法提取脂肪组织总rna。依据逆转录试剂盒（a3500,promaga）说明操作，获得cdna后，用无rnase的dnase（promaga）处理，去除可能的基因组dna污染，再进行实时荧光定量pcr扩增。36b4(nm?007475)为内参照基因，其引物（136 bp)：
　　上游：5&?agtgctcgacatcacagagca?3&&&& 下游：5&?gcgcttgtacccattgatga?3&　visfatin（nm?021524）为目的基因，其引物(101bp)：
　　上游：5&?tcattcaaggagatggcgtg?3&
　　下游：5&?accagaaccgaaggagacattc?3&
　　实时荧光定量pcr反应体系：sybr○r green pcr master mix（applied biosystems）10.0 &l，0.2 &mol/l上下游引物各1.0 &l，模板(rt产物1∶2稀释)2.0 &l，总体积为20.0 &l；以ntc（no template control）、nrtc（no reverse?transcript control）为阴性对照。反应条件：95 ℃ 10 min&95 ℃ 30 s&60 ℃ 1 min（signal），60～95 ℃ 20 min（测定熔解曲线），仪器为德国roche公司的light cycle real?time pcr仪，结果由仪器配套的软件分析，采用比较阈值法来测定目的基因的相对表达[3]：
　　目的基因的量＝2-&&ct
　　&&ct=(ct目的基因?ct内参基因)实验组?(ct目的基因?ct内参基因)对照组
　　2-&&ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于内参基因的定量。
　　1.6& 脂肪组织visfatin和36b4扩增反应的效率& 将对照组所提取的总rna逆转录成的cdna，按1∶1、1∶10、1∶100稀释后，同样条件下进行实时定量荧光pcr反应，以cdna稀释倍数的对数为横坐标，目的基因ct值与内参基因ct值的差值为纵坐标，可得一直线，测得斜率为：0.0521（r2＝0.9756），接近0，故可认为内参基因36b4与目的基因visfatin扩增效率接近一致，可采用比较阈值法（图1）。
　　1.7& 统计学处理& 上述实验各样品均重复3次。数据用x&s表示，spss 11.5软件处理数据，采用单因素方差分析，pearson相关分析。
　　2& 结果
　　2.1& 体质量、体质指数、血脂、血糖及内脏脂肪量& 与对照组相比，肥胖组小鼠体质量、体脂指数、血总胆固醇、ldl?c、hdl?c和血糖及内脏脂肪量均升高（p<0.01），但血tg较对照组降低（p<0.05）（表1，2）。
　　图1& 扩增效率曲线示意图（略）
　　fig 1& amplification efficiency curv
　　2.2& 内脏及腹部皮下脂肪组织实时定量pcr结果& 肥胖组小鼠visfatin基因表达明显升高,是对照组的4.76倍（95％可信区间为3.68～6.15, p0.05），无明显升高（表3～4，图2）。
　　2.3& 相关性分析& 内脏脂肪组织visfatin基因表达与体质指数（r=0.584,p=0.011）、内脏脂肪组织含量(r=0.676,p=0.002)及体脂指数(r=0.704,p=0.001)均呈正相关，而腹部皮下脂肪组织visfatin基因表达水平与上述指标均无明显相关性。
　　3& 讨论
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请问荧光定量PCR进行相对定量时,若是目的基因和内参基因扩增效率不一致,为什么会导致结果的不准确?那么怎么平衡扩增效率呢?
Kouichi8521
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相对定量有两种方法.要求扩增效率相同的是ΔΔCt法,因为只有扩增效率相同目的基因与内参基因的Ct值之差才是恒定的值,这是使用这种方法处理数据的前提,所以正式实验之前要进行条件优化,这种方法的优势是不用作标准曲线.如果扩增效率不同就要用另一种双标准曲线法,这种方法需要标准品,稀释不同的浓度梯度,作标准曲线,根据标准曲线得到你的拷贝数在进行数据处理,得到相对值.
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