敖日格勒, 刘海波
DNA修复基因SNPs与脑胶质瘤易感性研究进展
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敖日格勒, 刘海波. DNA修复基因SNPs与脑胶质瘤易感性研究进展[J]. 国际神经病学神经外科学杂志, ): 370-373.
DNA修复基因SNPs与脑胶质瘤易感性研究进展
敖日格勒1, 刘海波2&&&&
1. 内蒙古医科大学, 呼和浩特市 010059;2. 内蒙古医科大学附属医院神经外科, 呼和浩特市 010059
作者简介: 敖日格勒(1988-), 男, 蒙古族, 2012级内蒙古医科大学在读硕士研究生.研究方向:神经肿瘤.
通讯作者：刘海波, 男, 教授, 硕士生导师, 主任医师, 研究方向:神经肿瘤.
摘要：碱基切除修复(base excision repair,BER)和同源重组(homologous recombination repair,HRR)是DNA损伤修复系统中重要的两个途径.而XRCC1和XRCC3基因影响BER和HRR通路中重要酶和蛋白质的功能,其多态性能够改变DNA修复功能和效率、影响肿瘤易感性.XRCC1基因Arg194Trp 位点及XRCC3 基因Thr241Met位点多态性很可能在胶质瘤发病中起着重要作用.目前研究认为此二基因位点多态性对胶质瘤易感性的影响不一,本文尝试就此进行论述以期对胶质瘤的有效预防提供线索.
DNA修复基因&&&&
单核苷酸多态性&&&&
胶质瘤&&&&
易感性&&&&
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，手术全切较困难，且易复发、预后差。目前治疗方法主要包括手术切除、放射治疗、化学治疗和免疫治疗，但疗效均不甚理想。胶质瘤的发生与其他肿瘤一样是多因素、多基因作用的结果，其中抑癌基因的失活、癌基因的活化以及在DNA复制过程中各种修复基因缺陷与胶质瘤发生有密切关系。而碱基切除修复途径和同源重组修复途径相关基因与肿瘤发生的关系是目前研究的热点。肿瘤发生过程中，各种基因与肿瘤是否存在相互影响、相互作用的关系，他们相互作用的方式和结果是什么仍不明确。本文对此二途径中部分基因的研究进展予以综述。
1 DNA损伤与修复
多种物理或化学的外源性因素及细胞代谢产物的内源性因素均可引起不同形式的DNA损伤。物理因素常见于紫外线和电离辐射引起的DNA损伤。化学因素常指突变剂或致癌剂对DNA的损伤，各种内源性的细胞生理进程也会引起DNA损伤[]。DNA损伤修复系统是机体应对DNA损伤、维持基因完整性的关键机制，包括至少4种通路：碱基切除修复(base excision repair，BER)通路，核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)通路，错配修复(mismatch repair，MMR)通路[]及双链DNA断裂修复(double-strand break repair，DSBR)通路[]等。DNA修复基因对应于不同的修复系统，各基因之间以及各修复通路之间相互协调，对不同类型DNA损伤发挥修复作用，其中任何一个功能基因的表达降低或功能缺陷都将可能影响细胞对DNA损伤的修复效率，从而导致肿瘤的发生。DNA修复基因单核苷酸多态性可能是决定肿瘤易感性的重要因素，与多种肿瘤易感性相关[]。
2 单苷酸多态性(single nuceotide polymorphism，SNP)
单核苷酸多态性是一种遗传变异形式，是指相同或不同物种个体的基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。在种群中的发生率最小为1％的核苷酸变异。它在人类基因组中的分布比较广泛，平均每500~1000个碱基对中至少有1个，目前已发现总数达3700万。随着人类后基因组时代的开始，SNP已作为继限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)之后的第三代遗传标记，被广泛应用于致病基因的定位、药物基因组学及生物多样性分析研究。许多以往的研究也说明了疾病的发生、进展与相关基因SNP有关，研究两者的关系及阐述其根本原因对相关疾病的筛查、诊断、预防及治疗具有很大意义[]。
3 XRCC1和XRCC3基因的的结构、功能及其SNPs
人类X射线交错互补修复基因1(X-ray repair cross-complementing gene 1，XRCCl)是第一个分离到的影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基因，XRCC1基因位于人19号染色体长臂(19q13.2-19q13.3)，其基因组大小约31.9kb，包括17个外显子，共同编码一种633个氨基酸的蛋白质,相对分子量约69.5ku（经查阅大量国内外文献，只提及此蛋白的功能，未见具体名称）。XRCC1基因主要参与碱基切除修复途径，作用于一组DNA损伤修复蛋白，包括ADP核糖聚合酶，DNA连接酶3，DNA聚合酶β，来修复包括氧化应激在内的各种伤害引起的DNA损伤[]。XRCC1基因共有8个单核苷酸多态性位点，目前研究比较多的是在第6、9和10外显子中，导致的改变依次为C26304T （Arg194Trp）、G27466，A（Arg280His）和G28152A（Arg399Gln）[]。
人类X射线交错互补修复基因3(X-ray repair cross-complementing gene3，XRCC3)首先从DNA转染的中国仓鼠卵巢细胞的突变体irslSF株被分离，位于14号染色体长臂(14q32.3)[]，全基因长度为19843bp，位于人类染色体14q32．3，有11个外显子。它主要经同源重组途径参与DNA双链断裂／重组修复[]，也是Rad-51相关蛋白家族的成员。在DNA损伤修复过程中RAD51定位在DSB损伤位点依赖于其与XRCC3的直接作用。XRCC3对以Rad-5l为中心的重组多聚体形成稳定存在是必要的[]，它可使Rad-51聚集于DNA损伤位点，从而稳定Rad-5l修复复合物的形成、参与DNA损伤修复。在XRCC3基因第7外显子上的Thr241Met（rs861539），含羟基的苏氨酸可被含硫的蛋氨酸所取代，从而形成野生型CC、杂合突变型CT、纯和突变型TT等三种基因型。氨基酸的改变会影响酶的功能及其与参与DNA损伤修复的其他相关蛋白的相互作用，从而导致DNA损伤修复能力改变，故其多态性可能与胶质瘤的易感性有关[]。
4 XRCC1和XRCC3基因多态性与肿瘤
许多研究报道这此二基因位点多态性可能和肿瘤易感性有关，有研究表明XRCC1 的Arg194Trp位点多态性与甲状腺肿瘤、白血病、膀胱肿瘤、子宫内膜癌、乳腺癌和结直肠癌易感性有关，XRCC3的Thr241Met位点多态性与胃癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、白血病和肺癌易感性相关。但也有很多无相关性的报道，结论不一致可能与种族、地域等多种因素有关。
XRCC1基因被敲除的胚胎不能存活，Christina等通过PCR基因分型检测XRCC1(+／-)小鼠繁育后代，没有发现XRCC1(-／-)纯合幼仔。Saribasak等发现，XRCC1低表达的小鼠体细胞对甲磺酸甲酯（methyl methanesulfonate，MMS）更加敏感，DNA单双链断裂更多[]。Hai-Bo Liu等[]对来自南方医院及内蒙古医科大学附属医院的197例胶质瘤患者及213例对照进行研究，应用Sequenom Assay Design 3.1 software进行引物的设计，用Sequenom MassARRAY技术平台进行基因分析，再用统计软件Stata 8.0进行处理，检验水准设定为双侧P<0.05，对基因型频率和等位基因频率组间差异分析采用了卡方检验和Hardy-Weinberg平衡原理分析，再进行非条件logistic回归分析，对年龄和性别进行修正后得出结论为：Arg194Trp多态性基因C/C基因型在病例组及对照组分别为66.3%、75.5%,C/T基因型在病例组及对照组分别为23.6%、20.1%，T/T基因型在病例组及对照组分别为10.1%及4.4%。实验结果表示XRCC1 Arg194Trp基因的多态性与胶质瘤易感性有关。得到相同结果的还有Xu []、Zhang [] 、Pan []等。相反，Zhang等[]1440例病例组及2562例对照组进行荟萃分析得出结论为：XRCC1 Arg194Trp基因的多态性与胶质瘤没有明显的相关性。Sun [] 、Adel Fahmideh[]、Zhang []等通过实验得到相同结果。
基础研究已证实XRCC3缺失的细胞对辐射、DNA交联剂更敏感，更易发生各种类型的基因损伤。临床研究表明，在因职业因素经常接触射线的人群中，XRCC T241M 多态性与基因损伤程度相关，突变基因M携带者基因损伤程度更严重[]。Wang等[]对年从德克萨斯大学M.D.癌症中心的胶质瘤患者及对照组进行研究(胶质瘤309例，对照组342例)。其病例中有151多形性胶质母细胞瘤，被视为高度恶性，70例星型细胞瘤，还有其他88例低度恶性胶质瘤，而对照组为342名非癌症患者血样本来自M.D.安德森血库。通过对多态性位点经PCR-RFLP检测，分别对各自三种基因型数据进行统计，获得数据为Thr/Thr基因型在病例组及对照组分别为134例(43.4%)、147例(43.0%)，Thr/Met基因型在病例组及对照组分别为138例(44.7%)、147例(43.0%)，Met/Met基因型在病例组及对照组分别为37例(12.0%)及48例(14.0%)。而Thr/Met基因型+Met/Met基因型在病例组及对照组分别为175例(56.6%)、195例(57.0%)。再经Statistical Analysis System software（Version 8）软件进行分析，检验水准设定为双侧P<0.05，对基因型频率和等位基因频率组间差异分析采用了卡方检验和Hardy-Weinberg平衡原理分析，采用univariate 及multivariate logistic回归分析计算基因型多态在病例组和对照组中的差异，并计算出比值比及95%可信区间。研究结果表明XRCC3 Thr241Met基因频率的分布符合H-W平衡，P=0.727，多态性与胶质瘤无明显相关性。还有Feng[]、Rodriguez-Hernandez []等的实验报告结果同上。而Luo等[]在 年间从孙逸仙纪念医院收集297例胶质瘤患者和458例非肿瘤患者进行对比,结果却为XRCC3 Thr241Met基因的多态性可能对胶质瘤易感性产生影响。Liang等人 [, , , ]等也得出实验结论：XRCC3 Thr241Met基因的多态性与胶质瘤易感性有关。
然而一些更深层次问题，如：XRCC1参与的BER途径和XRCC3参与的HRR途径之间是否有协调作用？如果有，是如何进行的？当此二基因参与的途径单独或同时缺失时还有哪种途径承担DNA损伤修复过程等等问题，目前尚未出现相关报告，有待研究。若此类研究得到进一步进展，也许可以根据患者的基因特征设计治疗方案,进行个体化治疗，从而提高疗效,降低不良反应,减少医疗费用。
结语通过上述分析对于DNA损伤修复BER通路中XRCC1及HRR通路中XRCC3基因单核苷酸多态性与胶质瘤易感性的关系，我们可以看到相关的研究还存在很大的分歧，缺乏重复性，统计结果还存在着很大的差异。造成这些分歧的原因可能与不适当的研究设计，如非随机抽样、有限的样本量、未知的混杂因素和修饰因素等有关。另外由于某种基因的多态可能与多种疾病的发生有关，而且基因与基因之间，与人种、生活习惯(吸烟，饮酒)、家族史、环境因素之间可能存在着复杂的关系，所以这些DNA修复相关基因与胶质瘤发生的关系很难从因果关系上得到确认。因此还需要进行大规模，设计完备，质量控制好的实验研究来补充，揭示DNA修复相关基因与胶质瘤发生之间的关系原因，进一步明确多种修复途径之间的相互作用机制，为胶质瘤的有效预防提供线索，从而可对肿瘤高危人群进行筛选，为危险度评价及预警、分子诊断、肿瘤的治疗、预后判断及肿瘤药物的开发等提供线索。
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精子DNA单双链损伤与精子浓度的关系研究
文章导读：研究对象为120例男性不育患者，年龄25~40岁之间，根据世界卫生标准进行精液常规检测分析精子的浓度、活力等，利用双尾彗星试验分析精子DNA单双链损伤指数。结果：120例男性不育患者根据精子浓度分为三个研究组，即组1（精子浓度＜10×106mL-1)、 组2（精子浓度＜20×106mL-1）和组3（精子浓度＞20×106mL-1)，每组40例。三组之间年龄、精子活力及精子畸形率没有统计学差异；组1精子DNA损伤指数（DFI）为(59.48±15.21)%，单链损伤指数(SSB-DFI)为（25.86±11.86)%，SSB占所有损伤精子的比率(SSB-DFI/DFI)为(43.31±13.72)%，双链损伤指数(DSB-DFI)为（31.93±10.21)%，DSB占所有损伤精子的比率(DSB-DFI/DFI)为(53.85±10.27)%；组2精子DNA损伤指数（DFI）为(34.02±1.77)%，单链损伤指数(SSB-DFI)为（26.71±3.45)%，SSB占所有损伤精子的比率(SSB-DFI/DFI)为(78.59±9.78)%，双链损伤指数(DSB-DFI)为（8.37±3.04)%，DSB占所有损伤精子的比率(DSB-DFI/DFI)为(21.40±9.79)%；组3精子DNA损伤指数（DFI）为(20.77±2.43)%，单链损伤指数(SSB-DFI)为（20.44±2.39)%，SSB占所有损伤精子的比率(SSB-DFI/DFI)为(98.44±2.87)%，双链损伤指数(DSB-DFI)为（1.32±0.61)%，DSB占所有损伤精子的比率(DSB-DFI/DFI)为(1.55±2.87)%。三组间SSB-DFI无显著差异（P＞0.05），SSB-DFI/DFI在组1、组2和组3间随精子浓度升高而逐渐升高（P＜0.05），DSB-DFI随精子浓度升高而逐渐下降（P＜0.05），DSB-DFI/DFI随精子浓度升高而逐渐下降（P＜0.05）。精子SSB- DFI及SSB-DFI/DFI与其他精液常规参数均无相关关系(P＞0.05)，精子DSB-DFI 及DSB-DFI/DFI与精子浓度呈负相关(P＜0.05)。
　　男性不育是指夫妻双方同居1年以上，性生活正常未采取任何避孕措施，因男方原因而导致的不育。男性不育是亟待解决的医学难题，精液常规分析是评价男性精液质量的重要检查，主要分析了精子的浓度、活力及精子畸形率，其中精子浓度低是临床常见的导致不育的原因。据文献报道，有生育能力的男性精子较不育男性DNA双链损伤的明显偏低，且多数是DNA 的单链受损，双链损伤可能才是男性不育的真正原因。本研究通过双尾彗星试验鉴别精子DNA单双链损伤，探讨精子DNA损伤类型与精液浓度的关系。
　　1 资料与方法
　　1.1 临床资料
　　收集2015年1月至2015年12月来宁波市中医院男性科就诊的不育患者341例，年龄25~45(27.9±6.7)岁，病程3～14(4.3±2.1)年，身体健康，夫妻性生活正常，未采取任何避孕措施，女方均经妇科检查、输卵管通畅实验以及B超、内分泌测定等排除女方不孕因素，排除存在感染及其他系统性疾病。依据精子浓度从中挑选120例作为研究对象，分三个研究组：即组1(精子浓度&10×106/mL)、 组2(精子浓度&20×106/mL)和组3(精子浓度&20×106/mL)，每组40例。上述各组在年龄结构、身体基础等方面采用One-Way ANOVA检验比较均无差异，所有对象均签署知情同意书并经医院伦理委员会同意。
　　1.2 标本采集
　　研究对象采精前禁欲1周，洁净双手，用手淫法采取一次性全部排出的精液，将精液置于无菌容器中，在放置到37℃恒温箱中液化。待液化完全后，进行精液常规检测。
　　1.3 试剂和仪器
　　WLJY-9000型伟力彩色精子质量分析系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司);OlympusBX41型荧光显微镜;电泳槽;普通熔点琼脂糖凝胶;低熔点琼脂糖凝胶;去离子水;PBS缓冲液;裂解液1(0.4mol/LTris-HCl，0.8mol/LDTT，1%SDS，pH7.5);裂解液2(0.4mol/L Tris-HCl，2mol/L NaCl，1%SDS，0.05% EDTA，pH7.5);TBE缓冲液(TBE：0.09mol/L Tris，0.002mol/L EDTA-Na2，pH7.5);碱性电泳缓冲液(1mmol/L EDTA-Na2，300mmol/L NaOH，pH13);70%乙醇;90%乙醇;100%乙醇;中和缓冲液(0.4mol/L Tris-HCl，pH7.5);荧光染料SYBRGreenⅠ。
　　1.4 方法
　　1.4.1 精液常规分析
　　参考WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)要求，将液化后的精液用计算机辅助系统进行精液常规分析，测定精液量、pH、精子浓度、精子活力、精子前向运动百分比等。
　　1.4.2 双尾彗星实验
　　实验原理：双尾彗星实验又称单细胞凝胶电泳(SCGE)，据文献报道，细胞核基质中附着有DNA超螺旋结构，细胞和液化的琼脂糖凝胶混匀后被铺在载玻片上，将玻片浸入细胞裂解液使其细胞膜、核膜、蛋白质等成分进入裂解扩散到溶液中，DNA双螺旋结构仍保留。当DNA未被损伤时，经电泳后大分子DNA保存于核基质，经荧光染料染色后观测，图像为圆形的荧光团。在中性电泳中(pH=7.5)若有DNA双链已发生断裂，凝胶内的DNA碎片会在电泳时向阳极迁移，呈现X轴彗星拖尾。DNA双螺旋在碱性溶液中(pH=13)可解旋双链裂变为单链，玻片旋转90°置于碱性电泳液中，电泳时若DNA有单链损伤其碎片会向阳极迁移，单链碎片产生越多或其分子量越小在电场力作用下拖尾就越长，荧光染色后呈现Y轴彗星拖尾。因此，通过测定试验中拖尾的方向和尾长就可以判定精子DNA的单双链损伤类型。实验方法：依据文献，首先制备细胞凝胶(普通熔点琼脂糖与去离子水按1∶10000混匀后溶解)，将溶解的凝胶铺于未用的载波片上，晾干备用。液化后的精液用PBS缓冲液将精子浓度稀释至1×106/mL，吸取30μL精子稀释液和50μL液化状态的低熔点琼脂糖凝胶混匀，取30μL混合物铺于载波片上并加好盖玻片冻存入冰箱，冰箱温度调节为4℃。5min后将其取出并取下盖玻片再先后放入裂解液1和裂解液2中分别避光裂解30min，再用去离子水清洗5min。把玻片置入预冷的TBE电泳缓冲液避光静置解旋20min。先将电泳槽中倒入预冷的4℃TBE电泳缓冲液，并将电泳时的电压设置为25V，电流设置为25mA，电泳时间为20min，然后将玻片竖向放入并进行电泳。中性电泳后再将玻片在避光条件下浸入4℃碱性电泳缓冲液中10min，将电泳槽中倒入碱性电泳缓冲液并设置好电泳条件，电压25V，电流300mA，电泳时间20min，再将玻片旋转90°放入电泳槽内进行电泳。电泳后将玻片放入中和缓冲液，将其置于4℃冰箱5min。之后玻片浸入100%乙醇中5min，使其脱水干燥。将SYB GreenⅠ和TBE按3∶10000的比例混合配置后放入37℃水浴箱中10min，使染料充分溶解。之后用其对玻片进行染色，在把玻片置于避光环境下30min，用荧光显微镜(10×40)观测计数200个精子，再用CASP软件分析统计精子DNA单双链损伤的个数并计算出各自的损伤百分比，每个标本计数两次取平均值。结果判断与计算：依据文献报道，根据彗星托尾长度分为：无损伤(尾长小于10μm)、单链(SSB)损伤(彗星托尾位于Y轴，尾长大于10μm)、双链(DSB)损伤(彗星托尾位于X轴，尾长大于10μm)。精子DNA损伤指数等同于DNA碎片化指数(DFI)计算方法为DFI(%)=DNA损伤精子数/被观察精子总数×100%。DNA单链损伤指数用SSB-DFI表示，计算方法为SSB-DFI(%)=SSB精子数/被观察精子总数×100%。DNA双链损伤指数用DSB-DFI表示，计算方法为DSB-DFI(%)=DSB精子数/被观察精子总数×100%。DNA双链损伤精子占DNA损伤精子的比率用DSB-DFI/DFI表示，计算方法为DSB-DFI/DFI(%)=DSB-DFI/总DFI×100%，DNA单链损伤精子占DNA损伤精子的比率用SSB-DFI/DFI表示，计算方法为SSB-DFI/DFI(%)=SSB-DFI/总DFI×100%。
　　1.5 统计学分析
　　采用SPSS19.0软件进行数据分析。精子浓度、前向运动百分比、畸形率、存活率及精子DNA碎片化指数均符合正态分布，以用(x±s)表示;用t检验和Person相关分析对数据进行分析。
　　2 结果
　　2.1 三组之间各参数比较
　　三组研究对象的年龄、精子前向运动百分比、精子畸形率及SSB-DFI无统计学差异。三组间SSB-DFI/DFI水平比较，组1低于组2(P&0.05)，组2低于组3(P&0.05);就DSB-DFI和DSB-DFI/DFI相比较，组3低于组2(P&0.05)，组2低于组1(P&0.05);各组间DFI值比较，组1高于组2(P&0.05)，组2高于组3(P&0.05)，各组间均有显著差异。
　　2.2 精子DNA单双链损伤指数与精子浓度之间的相关性分析
　　Pearson相关分析表明，研究对象的SSB-DFI与SSB-DFI/DFI和精子浓度之间没有相关性(P均&0.05);DSB-DFI与DSB-DFI/DFI和精子浓度之间存在负相关(r分别为-0.847和-0.924，P均&0.01)。DFI与精子浓度呈负相关(r为-0.781，P&0.01)。
　　3 讨论
　　精液常规分析可以客观评价精液质量，是目前临床上评价男性生育能力的客观指标。精液分析主要评价的男性精液的浓度、活力及畸形率。精液的浓度客观反映了男性精子生成的能力，而且精子数量过少是临床常见问题。目前精液的常规分析只能得到精子的表观数据，精子数量及活力等变化受多种因素影响不能决定性的反应男性不育的根本原因。从精子DNA水平上来探讨精子质量下降的真正原因是目前研究的热点。精子DNA完整性有多种检测方法，有染色质扩散试验(SCD)、荧光原位杂交技术(FISH)等。以上这些试验都只能检测精子DNA的碎片化指数，不能区分精子DNA的损伤是单链损伤还是双链损伤。有学者认为，精子DNA的单链损伤可以通过自身修复而不对生育造成较大影响，而精子DNA的双链损伤却不能进行自身修复，因而精子DNA的双链损伤才是男性不育的真正原因。前期已有学者对双尾彗星试验进行了改良，并建立了精子DNA损伤的9种类型。为更深一步研究精子DNA单双链损伤与精子浓度及生成的关系，本实验继续对该试验进行了改良与优化，通过观察不同精子浓度精液中DNA的单双链损伤类型及指数，发现了不同浓度精液中SSB-DFI无统计学意义(P&0.05)，而DSB-DFI在不同精子浓度的三组研究对象却有显著意义，组1明显高于组2和组3，组2高于组1，DSB-DFI随着精子浓度下降而逐渐升高，并且我们还发现随着精子浓度的下降DSB-DFI/DFI也逐渐升高，精子浓度正常或较高的精液中DNA损伤类型绝大部分为单链损伤。将精子浓度与DSB-DFI及DSB-DFI/DFI进行相关性分析表明，DSB-DFI和DSB-DFI/DFI与精子浓度存在负相关。DNA的复制是半保留的，只要其双螺旋结构存在，就可以进行自身修复而不会引起碱基对及密码子的丢失，而当DNA双链损伤时却难以修复。此前有研究报道，DFI值与精子浓度及存活率呈相关性，而又有学者认为精子DFI与精子存活率呈相关性，但与精子浓度并无相关。本研究发现在不育男性中，不同精子浓度的精液其DFI值也有显著差异，研究对象中组1明显高于组2和组3，而组2又高于组3,精子浓度与DFI存在负相关，当DFI越高时其精子浓度也就越低，DFI与精子活力也呈负相关。各种研究选取的研究对象及方法的差异可能是导致结果差异性较大的原因。因此，真正影响精子浓度的是精子DNA的双链损伤。精子生成受基因位点的调控，Sun等研究发现了USP9Y基因一个碱基的缺失会减少精子的生成;Kleiman等发现了当EIF1AY基因缺失时，精子发生会出现障碍,偶发无精子症。基因芯片测序是常用的基因测序手段，但由于基因芯片仅包含已报道的常见遗传变异，会造成潜在功能的低频及罕见突变被漏检。秦玉峰等对非梗阻型无精症进行高通量测序，发现了6个与精子生成障碍相关的遗传变异位点，SIRPA基因上的chr20.1902132和chr20.1902301位点，SIRPG基因rs1048055和rs2281807，SOX基因的rs和rs。不仅基因位点的变异和缺失会引起生精障碍，基因表达水平的变化也是重要原因之一。贺小进等对TEX15调控精子发生的机制进行研究发现，miR-183与TEX15基因存在靶向关系，可以下调TEX15基因的稳定性从而影响其转录后表达，TEX15下调会直接导致减数分裂过程遗传重组异常，最终引起精子发生障碍。精子的生成受多个基因位点的调控，DNA双链损伤所致的基因位点缺失、变异及表达水平变化，可能是导致精子浓度下降的真正原因。精子DNA单双链损伤的研究逐步进行，大多数学者认为其参考价值要优于精子核DNA碎片化指数。但双尾彗星试验由于操作要求较高，缺乏质量控制，其结果依靠主观判读，因而临床应用有阻力，其方法仍待优化和简练。
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