ReverTra Ace qPCR RT Master Mix，（qPCR专用RT试剂盒，预混一管型）
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简单介绍：
qPCR专用RT试剂盒
最适用于Realtime PCR用cDNA合成的预混型逆转录试剂。
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201)是利用本公司高性能逆转录酶『』开发的Realtime PCR用的逆转录试剂盒，是包含逆转录反应用的所有组分的5×浓度的完全预混型试剂，只需添加模板RNA和水即可迅速地开始反应。另外，由于采用了最适用于Realtime PCR用短链目的片段cDNA合成的反应组成，可在短时间内高效率地制备适用于Realtime PCR的cDNA模板。
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)中添附了具有强力DNA分解活性的gDNA Remover，通过在逆转录反应前处理模板RNA，可简便地制备不含基因组DNA的cDNA。最适用于检测目的基因中存在假基因，或无法在横跨内含子的位置上设计引物，模板RNA中有基因组DNA残留问题等Realtime PCR实验。
【相关产品】Realtime PCR试剂的详细内容请点击。
特征1. 完全预混型试剂
本试剂是在-20℃条件下也不会冻结的完全预混型试剂。只需添加模板RNA和水，即可简便地合成重复性良好的cDNA。
特征2. 逆转录反应(-)对照溶液容易配制
由于添附有同样预混型的no-RT Control，逆转录反应（-）对照溶液也很容易配制。
特征3. 实现了更广的可定量扩增区域（dynamic rang）
由于采用了Oligo dT和Random Primer按最佳比例混合的primer mix，RNA的整个区域可进行均一、高效率的逆转录反应。因此，可对更广的可定量扩增区域进行分析。
特征4. 与Realtime PCR试剂的高适应性
采用了对Realtime PCR的反应体系影响最小的组分，即便向PCR反应液中带入最多20%液量的逆转录反应液，也能显示出很好的线性。最适用于低表达量mRNA的高灵敏度检测。
特征5. 可简便、迅速地去除基因组DNA
按顺序添加去除基因组DNA的试剂和逆转录反应试剂，只需20分钟即可配制不含基因组DNA的cDNA。
&实验例1　与其他公司预混型cDNA合成试剂逆转录反应效率（cDNA合成量）的比较
以HeLa total RNA100ng为模板，按各公司试剂盒的推荐条件进行逆转录反应，再用Realtime PCR对5种目的基因进行定量。
结果可见，用本试剂盒可得到最高合成量。
●cDNA合成
试剂：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No.FSQ-201）及其他公司同类型（预混型）产品
模板：HeLa total RNA 100ng /10μl反应体系
反应条件：各公司试剂盒推荐的条件
●Realtime PCR
试剂：THUNDERBIRD SYBR(R)&qPCR Mix（Code No.QPS-201）
模板：上述cDNA 2μl/20μl反应体系(带入量10%)
目的片段：代表性基因5种
测定用仪器：Applied Biosystems 7900HT
&实验例2　模板RNA量对合成效率的影响（标准曲线直线性的确认）
为评价模板RNA量对逆转录合成效率的影响，以HeLa total RNA 2pg?2μg（8个梯度）为模板进行逆转录反应，再用Realtime PCR对5种目的基因进行定量。结果可见，5种目的基因的标准曲线没有交叉，显示了很好的直线性。由此可见，用本试剂盒可对各种浓度范围的RNA进行同等效率的逆转录。
●cDNA合成
试剂：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No.FSQ-201）
模板：HeLa total RNA 2pg-2μg /20μl反应体系
●Realtime PCR
试剂：THUNDERBIRD SYBR(R)&qPCR Mix（Code No.QPS-201）
模板：上述cDNA2μl/20μl反应体系（带入量10%）
目的片段：代表性House Keeping Gene 5种
测定用仪器：Applied Biosystems 7900HT
&实验例3　gDNA Remover去除基因组DNA效果的确认
为了确认gDNA Remover去除基因组DNA的效果，按以下条件进行了逆转录反应，再以β-Actin为目的片段进行Realtime&PCR。
结果可见，gDNA Remover处理（＋）、逆转录（-）〈下面③〉的条件下无法确认到扩增，说明基因组DNA已被去除。
●cDNA合成
试剂：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Code No.FSQ-301）
模板：自制的HeLa total RNA 0.5μg /10μl反应体系
条件：用gDNA Remover添加（＋）、或不添加（-）的4×DN Master Mix去除gDNA后，再分别用5×RT Master MixⅡ或5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control进行逆转录反应
●Realtime PCR
试剂：THUNDERBIRD SYBR(R)&qPCR Mix（Code No.QPS-201）
模板：上述cDNA 2μl/20μl反应体系（带入量10%）
目的片段：ACTB（188bp）
测定用仪器：Applied Biosystems 7900HT
&实验例4　与其他公司同类型产品去除基因组DNA效果的比较
向HeLa total RNA中添加过量的人基因组DNA，通过该实验，与其他公司同类型产品比较去除基因组DNA的效果。
结果可见，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover去除基因组DNA的效果最好。
●cDNA合成
试剂：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Code No.FSQ-301）及其他公司同类型试剂盒2种
模板：HeLa total RNA（0, 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng,100ng, 1μg）＋人gDNA 100ng/20μl反应体系
条件：各公司试剂盒的推荐条件
●Realtime PCR
试剂：THUNDERBIRD SYBR(R)&qPCR Mix（Code No.QPS-201）
模板：上述cDNA 2μl/20μl反应体系（带入量10%）
目的片段：ACTB（188bp）
测定用仪器：Applied Biosystems 7900HT
Q1. 推荐反应时间为15分钟，如果延长时间能否提高cDNA的合成量？
A1. tRNA等量很多的RNA全部进行逆转录反应时，延长反应时间可提高收量，但一般情况下推荐37℃15分钟可得到足够的cDNA。
Q2. 哪些RNA可作为模板RNA使用？&&
&A2. Total RNA、mRNA、tRNA、rRNA等各种RNA都可以使用。
Q.3 是否需要RNase H处理？&&
&A3. 由于模板RNA的残留会对PCR产生抑制作用，一般情况下，逆转录反应结束后需通过RNase H对模板RNA进行分解。但本试剂盒采用了本公司新开发的系统，模板RNA在逆转录反应后会被非酶性去除，因此逆转录反应后无需进行RNase H处理。
1）K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:（2003）
2）A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59-66（2002）
3）S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241-246（2002）
4）S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:（2001）
5）Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666-675（2000）
6）S.Lee et al.,Gene,245:253-266（2000）
（点击品名即可下载产品说明书）
品名及内容
?5×RT Master Mix
?5×RT Master Mix no-RT Control
?Nuclease-free Water
?gDNA Remover
&& ?4×DN Master Mix
&& ?5×RT Master Mix II&
?5×RT Master Mix II no-RT Control
?Nuclease-free Water
&相关产品价格表
&品名及内容
　?5×RT Buffer
　?Enzyme Mix
　?Primer Mix
　　(oligo dT＋Random primer）
　?Nuclease-free Water
&高效率Realtime PCR用试剂&
&&[40次份*]
1.67ml x 3支
& [200次份*]
(1.67ml x&3支)×5
& [1000次份*]
(1.67ml x&3支)×10
& [2000次份*]
&￥12,700&
& [40次份*]
1.67ml x 3支
& [200次份*]
(1.67ml x&3支)×5
& [1000次份*]
(1.67ml x&3支)×10
& [2000次份*]
&相关记载&FAQ
「Realtime PCR相关记事」
广州创伟生物科技有限公司　　来源:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期文/彭志平
史学森（通讯作者）
[导读]从腺瘤到结肠癌的演进是一个多基因，多步骤参与的过程，涉及不同基因序列的畸变和基因表达的改变。
彭志平& 刘紫玲& 史学森（通讯作者）
　　【摘& 要】& 目的& 探讨良性结肠腺瘤与结肠腺癌组织中Hsa-miR-21-5p，Hsa-miR-143-3p，Hsa-miR-106a-5p表达水平的差异对临床诊断结肠腺瘤及癌变可能的意义。方法& 利用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测结肠腺瘤、结肠癌患者组织及瘤旁组织中Hsa-miR-143-3p，Hsa-miR-21-5p，Hsa-miR-106a-5p的表达水平，并分析三者的表达对结肠腺瘤或结肠癌的诊断意义。结果& 结肠腺瘤组织中Hsa-miR-21-5p，Hsa-miR-106a-5p的表达水平较瘤旁组织显著增高（p&0.05），Hsa-miR-143-3p的表达水平显著降低（p&0.05）；经病理鉴定癌变的组织中Hsa-miR-21-5p表达水平显著高于良性瘤组织，差异有统计学意义（p&0.05），而Hsa-miR-106a-5p的表达水平与良性瘤组织无统计学差异（p&0.05)，Hsa-miR-143-3p的表达水平低于良性瘤组织，差异有统计学意义。结论& Hsa-miR-21-5p，Hsa-miR-106a-5p，Hsa-miR-143-3p的表达水平对临床诊断结肠腺瘤及是否发生癌变有指导意义。
　　【关键词】& 结肠腺瘤；& 结肠腺癌；& miRNA；& Hsa-miR-21-5p；& Hsa-miR-106a-5p；& Hsa-miR-143-3p
　　The expression and significance Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p, Hsa-miR-143-3p in colorectal adenomas
　　【Abstract】& Objective& Detecting the expression of Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p, Hsa-miR-143-3p in colorectal adenomas and colon adenocarcinoma, to investigate their clinical diagnosis significance in colon adenoma and colon adenocarcinoma. Methods& Fluorescence quantitative real-time PCR (qRT-PCR) assay were used to detect the expressions of Hsa-miR-143-3p, Hsa-miR-21-5p, Hsa-miR-106a-5p in colorectal adenoma tissues and Adenomatous adjacent tissues, further reveal their roles during colon adenoma or colon cancer diagnosis on the basis of corresponding pathological diagnosis. Results& Hsa-miR-21-5p , Hsa-miR-106a-5p expression levels in colorectal adenomas than tumor adjacent tissues was significantly higher (p&0.05), the expression level of Hsa-miR-143-3p significantly lower (p&0.05); the expression Hsa-miR-21-5p was significantly higher than benign tumor tissue, the difference was statistically significant (p&0.05), but Hsa-miR-106a-5p was not (p&0.05), Hsa-miR-143-3p expression level lower than benign tumor tissue, the difference was statistically significant. Conclusion& It is meaningful to detect the expression of Hsa-miR-21-5p,Hsa-miR-106a-5p, Hsa-miR-143-3p for clinical diagnosis of colorectal adenoma and whether cancerous instructive.
　　【Key words】& Colorectal adenomas；& Colorectal adenocarcinoma；& miRNA；& Hsa-miR-21-5p；& Hsa-miR-106a-5p；& Hsa-miR-143-3p
　　结肠癌是发病率较高的消化系统恶性肿瘤，其5年生存率很低，结肠腺瘤尤其是进展期结肠腺瘤是结肠癌的主要癌前病变,早发现早诊断是提高患者生存率的关键。从腺瘤到结肠癌的演进是一个多基因，多步骤参与的过程，涉及不同基因序列的畸变和基因表达的改变。miRNAs是一类新的基因调控因子，它在控制细胞的生长、分化、血管形成及凋亡等过程中发挥着非常重要的作用。随着越来越多的miRNAs被发现和研究的深入，已证实miRNAs与恶性肿瘤密切相关，相对于毗邻的正常结肠组织，腺瘤和癌内的miRNA表达代表了早期结肠癌发生的细胞事件。本研究旨在通过检测Hsa-miR-21-5p，Hsa-miR-106a-5p，Hsa-miR-143-3p的表达水平对结肠腺瘤及是否发生癌变的诊断做出指导。
　　标本采集与方法
　　1．标本来源与收集
　　收集5.1包头市中心医院32例胃肠外科行手术治疗的患者结肠腺瘤组织及相对应的距肿瘤病灶边缘2cm瘤旁组织。经病理学鉴定21例患者属于良性结肠腺瘤，11例属于结肠腺癌。其中男17例，女15例，年龄33-67岁，平均发病年龄52岁。所有患者在取材术前均未接受放化疗及其他针对肿瘤的特殊治疗。
　　2．方法
　　2.1结肠腺瘤组织标本：即刻采集新鲜组织后，放于-196℃液氮中速冻，并转存于-80℃低温冰箱中。使用Life technology的mirVana? miRNA Isolation Kit试剂盒从100mg组织中提取总RNA，ThermoND-LITE紫外分光光度计测量总RNA的纯度及浓度，取5uL进行琼脂糖凝胶电泳观察总RNA条带。
　　2.2 cDNA合成及qRT-PCR:
　　cDNA合成：取100ng总RNA，应用NCode?VILO? miRNA cDNA Synthesis Kit（Life technology公司）进行逆转录，20uL体系如下：5&Reaction Mix（含通用逆转录引物）4uL，10&SuperScript?Enzyme Mix 2uL，总RNA 2uL(浓度50ng/uL)，DEPC-treated水12uL。反应条件：37℃60min，95℃5min灭火逆转录酶终止反应。
　　qRT-PCR检测miRNA的表达：使用Life technology公司的SYBER?Select Master Mix，另外试剂盒提供了除上游引物及模板以外的所有反应所需物质，应用StepOnePlus?Real-Time PCR System检测Hsa-miR-21-5p，Hsa-miR-106a-5p，Hsa-miR-143-3p的表达水平，20uL体系如下：SYBER?Select Master Mix（2&）10uL，上游引物下游通用引物各0.4uL，cDNA 模板2uL，RNase-free水7.2uL。PCR反应条件如下：50℃ 2min，95℃ 2min，40个PCR循环（95℃ 15sec变性，60℃ 15sec退火，72℃ 1min延伸）并在此程序后加溶解曲线条件:(95℃ 15sec&60℃ 1min&95℃ 15sec)，使用primer5.0设计特异性上游引物，由invitrogen公司合成。上游引物如下表1。采用2-&D&DCt法计算标本中miRNA的表达。&DCt=Ct（目的基因）-Ct（U6)，&D&DCt=&DCt（瘤组织）-&DCt（瘤旁组织）。瘤旁组织目的基因表达水平为1。同一样本需设立三个平行对照及一个NTC管（无模板对照）。
　　讨& 论
　　结肠癌的发生过程比较缓慢，结肠癌患者的生存和预后取决于肿瘤的检出时间，早期筛查早治疗是提高结肠癌患者5年生存率的关键[1]。miRNAs是一类进化保守、短小的(一般17-25 nt)单链非编码RNA，它在控制细胞的生长、分化、血管形成及凋亡等过程中发挥着非常重要的作用[2]。
　　近年随着 miRNAs 研究的深入，发现大量异常表达的 miRNAs 通过调控靶基因的表达而调节包结肠癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展，研究发现Hsa-miR-21-5p与多种肿瘤的发生发展息息相关[2-6]，本研究中Hsa-miR-21-5p的表达水平在大部分良性结肠腺瘤组织中有升高现象，且结肠腺癌中升高现象更为明显，这种现象是否可以提示结肠腺瘤的癌变可能？因本课题的时间限制以及标本量较小的原因，尚未能对此想法做出验证。实验过程中还发现Hsa-miR-21-5p的检出难度较Hsa-miR-106a-5p与Hsa-miR-143-3p小，有可能成为早期筛查肿瘤的常规检测项目。Hsa-miR-106a-5p的表达水平的检测在消化道肿瘤中居多[7-9]，作用同Hsa-miR-21-5p，多以致癌基因的角色为主，本课题研究中并未发现良性结肠腺瘤与结肠腺癌组织中Hsa-miR-106a-5p的表达存在差异，但与癌旁组织相比，表达水平的增加均有显著差异，研究中起抑癌基因作用的Hsa-miR-143-3p的表达水平在结肠腺癌组织中明显降低，与Vlastimil Kulda,Slaby O等[10-12]的研究结果相似，但我们另外对结肠腺癌与良性结肠腺瘤在Hsa-miR-143-3p的表达水平上做了比较，发现结肠腺癌的表达水平显著低于良性结肠腺瘤，且部分TNM分期为N3，M0，M1期的结肠腺癌患者癌组织中Hsa-miR-143-3p的表达使用qRT-PCR技术检出难度非常大。
　　综上，在结肠腺癌组织中的Hsa-miR-21-5p，Hsa-miR-143-3p表达水平与良性结肠腺瘤差异有统计学意义，可作为区分良恶性的指标。结肠癌组织中Hsa-miR-106a-5p的表达水平显著高于癌旁组织，虽与良性结肠腺瘤无法区分，亦可作为结肠癌患者的辅助检查项目。相信随着研究的深入高新科技的普及，会有很多差异表达的miRNA用于肿瘤的早期诊断与预后分析。
　　参考文献
　　[1]&张观坡，柏愚，李兆申．结直肠癌早期诊断的分子生物学研究进展[J]．国际消化病杂志，）：247-250．
　　[2]&Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers[J]. Nat Rev Cancer, ): 857-866.
　　[3]&娄艳辉．miRNA-21调节抑癌基因PTEN参与卵巢癌发病的机制研究[D]．济南：山东大学，2010．
　　[4]&Hwang JH, Voortman J, Giovannetti E, et al. Identification of microRNA-21 as a biomarker for chemoresistance and clinical outcome following adjuvant therapy in resectable pancreatic cancer[J]. PLoS One, ): e10630.
　　[5]&Karakatsanis A, Papaconstantinou I, Gazouli M, et al. Expression of microRNAs, miR-21, miR-31, miR-122, miR-145, miR-146a, miR-200c, miR-221, miR-222, and miR-223 in patients with hepatocellular carcinoma or intrahepatic cholangiocarcinoma and its prognostic significance[J]. Mol Carcinog, ): 297-303.
　　[6]&Wang N, Zhang CQ, He JH, et al. MiR-21 down-regulation suppresses cell growth, invasion and induces cell apoptosis by targeting FASL, TIMP3, and RECK genes in esophageal carcinoma[J]. Dig Dis Sci, ): .
　　[7]&Yuan R, Wang G, Zhi Q, et al. Up-regulated circulating miR-106a by DNA methylation promised a potential diagnostic and prognostic marker for gastric cancer[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2015。
　　[8]&Yue B, Sun B, Liu C, et al. Long non-coding RNA Fer-1-like protein 4 suppresses oncogenesis and exhibits prognostic value by associating with miR-106a-5p in colon cancer[J]. Cancer Sci, ): .
　　[9]&Wang R, Li Y, Hou Y, et al. The PDGF-D/miR-106a/twist1 pathway orchestrates epithelial-mesenchymal transition in gemcitabine resistance hepatoma cells[J]. Oncotarget, ): .
　　[10]&Huang Z, Huang D, Ni S, et al. Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J]. Int J Cancer, ): 118-126.
　　[11]&Kulda V, Pesta M, Topolcan O, et al. Relevance of miR-21 and miR-143 expression in tissue samples of colorectal carcinoma and its liver metastases[J]. Cancer Genet Cytogenet, ): 154-160.
　　[12]&Slaby O, Svoboda M, Fabian P, et al. Altered expression of miR-21, miR-31, miR-143 and miR-145 is related to clinicopathologic features of colorectal cancer[J]. Oncology, /6): 397-402.RNA,cDNA,RT-PCR_百度文库
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