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【实验求助】4T1细胞培养方法及条件
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这个帖子发布于4年零161天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
4T1细胞之前没培养过
对培养基 血清啊 什么的有没有特殊要求呢？？培养 及传代过程中比较容易出现的问题 ？希望有经验的朋友们 给予支持与帮助多谢！！
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丁香园准中级站友
ATCC-formulated RPMI-1640 Medium, Catalog No. 30-2001. 详细信息看以下链接
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含10% 胎牛血清的DMEM /F12培养基, 于5% CO2 培养箱中37 ! 培养, 以0. 25% 胰蛋白酶-0. 02% EDTA 消化细胞传代。
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请问楼主现在还在样4T1吗？
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请问楼主现在还在养4T1吗？可否赠予我一支，急求！或者交换也可以，我有很多种乳腺癌细胞还有别的间质细胞！
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jadely 请问楼主现在还在养4T1吗？可否赠予我一支，急求！或者交换也可以，我有很多种乳腺癌细胞还有别的间质细胞！楼主是3年多前的帖子了，一年级也该毕业了...急求建议丁香通
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jadely 请问楼主现在还在养4T1吗？可否赠予我一支，急求！或者交换也可以，我有很多种乳腺癌细胞还有别的间质细胞！我有，你还要吗？
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关于丁香园关注今日：9 | 主题：79854
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【求助】检测细胞间隙连接,划痕染料示踪实验问题！！！
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这个帖子发布于8年零215天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我的方法是将人正常肝细胞(买的细胞株)在六孔板内的盖玻片上，待长满融合后，在六孔板内操作，用PBS洗三次，加0.05% lucifer yellow染料1ML,然后用手术刀片在玻片上划痕,放回培养箱内孵育5-8分钟(3分钟也试过),然后PBS洗2-3次,取出盖玻片在荧光显微镜下观察,细胞未经任何处理,染料传输情况很不理想,我在文献中查到正常细胞应该能传到离划痕4-5层才对,为什么我的做出来没有传输,图我贴上来了,不知是什么问题!!后来我用小鼠原代皮肤成纤维细胞染色，效果仍然如此，
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ilzmx 编辑于
这是我用小鼠成纤维细胞染色的照片
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我曾经做过大鼠肺2型细胞，效果还可以，至少能传递3层。当时用的是荧光素钠，好像分子量比荧光素还要小。是不是分子量小，穿透力就强啊（我很久没碰实验了，也许是错的）
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谢谢楼上，文献中我没查到用荧光素钠的，实验还是没有进展，还有人做过这个实验吗，
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人正常肝细胞的几种cx蛋白检测过没有?这个主要还是研究缝隙连接蛋白的功能的!
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人正常肝细胞的几种cx蛋白检测过没有?这个主要还是研究缝隙连接蛋白的功能的!
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没有检测，但原代成纤维细胞有文献报道是存在间隙连接的。目前实验仍停止，有没有人做过这个实验，我可以前去学习学习。
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请问最后你做出来了吗？我用了荧光黄锂盐染料，同样没做出来，求指教！
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【实验求助】请问有没有战友用过BODIPY(R) 558/568 C12 这个试剂？
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如题，想检测细胞中的lipid，现在有这么个荧光试剂 BODIPY& 558/568 C12 ，链接如下：奈何找遍链接中的manual 都没有看到明确的使用方法，references都看过了但是看不懂……本人做的是细胞生物学&分子生物学，完全无化学背景……只好求助于此，希望能有人指点迷津。现在连细胞要怎么处理，需不需要别的辅助试剂都不清楚，无法下手……上下找遍也没有找到合适发这个话题的版，姑且先发在自己的大本营，版主若是有更合适的去处，请随便挪地儿~~~多谢各位！
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同问，BODIPY& FL (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)货号： D-2183无从下手...
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amyjet123 同问，BODIPY& FL (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)货号： D-2183无从下手...握个爪~~木有人理，只能自己先探索一下啦！我试着把这个C12加在细胞的medium里面培养了24小时，用的终浓度是10uM, 发现荧光还蛮强的. 强到每个channel都看得到它………………现在想用它做流式，不知道结果会怎样。
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BODIPY& 558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)这个和你买的那个有什么区别？你是要染细胞内脂滴吗？
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小小小演草 BODIPY(R) 558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)这个和你买的那个有什么区别？你是要染细胞内脂滴吗？吸收和发射波长不同，结构不同，其它的没有什么区别
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提供各种bodipy探针和定制服务，详见
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amyjet123 同问，BODIPY(R) FL (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)货号： D-2183无从下手...你好，这个用什么试剂溶解做母液啊？PBS可以吗
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ctttongji 如题，想检测细胞中的lipid，现在有这么个荧光试剂 BODIPY(R) 558/568 C12 ，链接如下：奈何找遍链接中的manual 都没有看到明确的使用方法，references都看过了但是看不懂……本人做的是细胞生物学&分子生物学，完全无化学背景……只好求助于此，希望能有人指点迷津。现在连细胞要怎么处理，需不需要别的辅助试剂都不清楚，无法下手……上下找遍也没有找到合适发这个话题的版，姑且先发在自己的大本营，版主若是有更合适的去处，请随便挪地儿~~~多谢各位！战友，一年过去了，你这个当时用什么溶剂溶解的啊，1mg一千多，担心给毁了
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【求助】急需JNK、P38的western blot的详细步骤
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这个帖子发布于10年零161天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
因为时间较匆忙，急需一份关于JNK和P38的western blot的详细步骤谢谢！
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1 Western blot试剂1.1
30 %丙烯酰胺丙烯酰胺29 g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1 g加水至100 ml，棕色瓶室温保存。1.2
1.5 mol/L Tris-Cl (pH8.8)Tris碱18.17 g溶于水，用HCl调节pH至8.8，定容至100 ml。4 ℃保存，备用。1.3
1.0 mol/L Tris-Cl (pH6.8)Tris碱12.11 g溶于水，用HCl调节pH至6.8，定容至100 ml。4 ℃保存，备用。1.4
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris碱1.51 g, 甘氨酸9.4 g溶于水，加入10 %SDS 5ml，调节pH值8.3，定容至100 ml。4 ℃保存，备用。1..5
SDS上样缓冲液Tris-HCl
62.5mol/L (pH6.8)SDS
50mol/L (临用前加入)1.6
1 mol/L DTT量取20 ml 0.01 mol/L 乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09 g DTT，0.22 μm过滤分装，−20 ℃储存备用。1.7
脱色液甲醇
225ml蒸馏水
50ml1.8 转移缓冲液（pH 8.5）Tris碱
25mol/L甘氨酸
0.2mol/L甲醇
20%4℃保存，备用。1.9
丽春红S染液（10×贮存液）称取丽春红S 2 g，三氯乙酸30 g，磺基水扬酸30 g，加蒸馏水定容至100 ml，储存备用。用前稀释成1×使用液。1.10
10×TBSTris碱24.2 g，NaCl 80 g，用HCl调节pH值7.6，定容至1 L。用前稀释成1×使用液。4 ℃保存，备用。1.11
抗体稀释缓冲液1×TBS，0.5 %脱脂奶粉，用前加入Tween-20（终浓度为0.1 %）。1.12
封闭液1×TBS，0.5 %脱脂奶粉，现用现配。1.13
洗脱液 TBS/T1×TBS，0.1 % Tween-201.14
抗体洗脱缓冲液（stripping buffer）Tris-HCl
62.5mol/L (pH6.8)SDS
2%β-巯基乙醇
100mol/L4 ℃保存，2
Western blot实验：2.1
全细胞蛋白质提取1） 细胞用0.25 %胰酶消化。2） 细胞计数，1000 rpm，离心5 min。弃去培养基，用1×PBS洗涤细胞，每次洗涤后1000 rpm，离心5 min。3） 按细胞计数结果加入不同体积的1×SDS上样缓冲液裂解细胞，将细胞裂解液转移至微量离心管中，存于冰上。4） 将样品置于沸水浴中煮沸10 min，使蛋白质变性，冰上冷却。5） 用超声波细胞粉碎机100 W处理2 min，以降低样品粘稠度。15,000 rmp离心10 min，取上清，−20 ℃储存备用。2.2
聚丙烯酰胺凝胶电泳1） 根据所要分离蛋白质的分子量配制不同浓度的分离胶。下面可分离40－60kd的蛋白质溶液成分&&各种成分所需体积（ml）蒸馏水&&5.930%丙烯酰胺&&
5.01.5mol/L (Tris pH8.8)&&3.910%SDS&&0.15010%过硫酸铵&&0.150TEMED&&0。006合计&&4.9652） 迅速在安装好的玻璃板间隙灌注分离胶，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加1 cm）。用注射器小心地在分离胶上覆盖一层蒸馏水（约2 mm），将凝胶垂直放于室温下等待聚合。3） 分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖的蒸馏水，用蒸馏水洗涤凝胶顶部3次以除去未聚合的丙烯酰胺。尽可能排除凝胶上的液体，再用纸巾边缘吸净残留的液体。4） 配制积层胶：按下面配制5 ml溶液成分&&各种成分所需体积（ml）蒸馏水&&3.40030%丙烯酰胺&&0.8301.0mol/L (Tris pH6.8)&&0.63010%SDS&&0.05010%过硫酸铵&&0.050TEMED&&0.005合计&&4.9655） 立即在积层胶溶液中插入干净的Teflon梳子，小心避免混入气泡，再加入积层胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放于室温下等待聚合。6） 积层胶完全聚合后（约50 min），小心移出Teflon梳子用蒸馏水洗涤加样槽，把凝胶固定于电泳装置上，上下槽均加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。尽量排除凝胶底部与两玻璃板之间的气泡。7） 按预定顺序加样，每孔加10-20 μl，用Hamilton微量加样器加于底部。每加完一个样品在蒸馏水中洗涤加样器。最后在所有不加样品的槽孔中加上等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。8） 在电压60 v（8 v/cm）条件下，当染料前沿进入分离胶后，将电压提高到120 v（15 v/cm），继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约需2 h），关闭电源。1.3.2.3
蛋白质从凝胶转移至滤膜1） 戴手套，剪切6张Whatman 3mm滤纸和一张硝酸纤维素膜，其大小应与凝胶大小完全吻合。把滤纸和硝酸纤维素膜浸于转移缓冲液中，浸泡30 min。 2） 在一块夹板上放一层海棉，上铺3张浸泡过的滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用玻璃试管作滚筒挤出气泡，放置漂洗过的凝胶。3） 把硝酸纤维素滤膜放在凝胶上，要保证精确对齐，再放置3张滤纸，放上层海棉，赶尽气泡，夹紧夹板。4） 将凝胶一侧靠近阴极，滤膜一侧靠近阳极，30 mA电转移30 min后，调节电流至300 mA转移2 h。5） 转移结束后取出凝胶用考马斯亮蓝染色，硝酸纤维素膜用丽春红染色，以检查蛋白转移是否完全。6） 硝酸纤维素膜用去离子水漂洗3次，洗去红色条带。置于25 ml封闭液中，室温摇床上缓慢摇动1 h。7） 取出硝酸纤维素膜，用TBS/T漂洗3次，5 min/次。置于含有10 ml用封闭液稀释的一抗（1:1000）杂交袋中，封口，4 ℃摇床上缓慢摇动过夜。8） 弃去带有一抗的封闭液，用TBS/T漂洗硝酸纤维素膜3次，5 min/次。将膜放入含有10 ml用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的相应二抗（1:2000）的杂交袋内，封口，室温摇床上缓慢摇动1 h。9） 弃去带有一抗的封闭液，用TBS/T漂洗硝酸纤维素膜3次，5 min/次。10） 在暗室中，取等体积的ECL试剂A液、B液混合（按每平方厘米膜0.125 mlECL混合液计算）。用滤纸将膜轻轻吸干，有蛋白质的一面向上放在保鲜膜上。将ECL混合液均匀加到膜上，反应1 min，提起膜，用滤纸轻轻吸干液体。用保鲜膜覆盖硝酸纤维素膜，注意表面要平整，不存有气泡。覆盖X光胶片，曝光。胶片显影4-6 min，自来水冲洗1 min，定影5-10 min，自来水冲洗1 min。观察结果。
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能否解释一下JNK 和 p38是什么东西啊
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哺乳动物中，MAPKs pathway中的经典成员
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步骤差不多，最后一步，膜加上发光液，不发荧光，是什么原因？请大神帮忙
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