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病毒灭活/去除工艺与血液制品病毒安全性
不升级什么也干不了病毒灭活/去除工艺与血液制品病毒安全性血液制品是以健康人血浆为原料，采用分离、纯化技术或生物工程技术制备的有生物活性的制品。在医疗急救及某些特定疾病，特别是与血液有关疾病的预防和治疗中，具有不可替代的作用。由于使用的原料是人血浆，因此血液制品难免具有传播血源性病毒的可能性。上世纪90年代中期，国外报道了因筛选试剂改变和缺乏有效的病毒灭活步骤，导致患者输注静注人免疫球蛋白（IVIg）后发生丙肝病毒(HCV)传播的事件［1］；并且近年来还出现过热处理后的凝血因子类制品也传播人细小病毒B19的事件［2］。与此同时，世界各国目前担心血液制品存在传播克雅病痴呆病变异病毒（CJDv）的危险性。为此，国内外有关机构纷纷制定了确保血液制品病毒安全性的法规［3—5］，其中病毒灭活/去除技术发挥着尤为重要作用［6］。我们从生产的角度，对病毒灭活和去除工艺在血液制品生产中的应用做一综述，以期为国内同行在相关制品的研究和生产方面提供一些理论参考。
1 病毒去除方法
1.1 乙醇沉淀 现有的血浆蛋白分离方法主要是以Cohn EJ教授等人于上世纪40年代开发的低温乙醇法为基础，结合现代层析技术衍生出来的生产工艺。在低温条件下，乙醇既是蛋白沉淀剂，也发挥着去除病毒的作用。Biesert等［7］在验证乙醇对脂包膜病毒［人类免疫缺陷病毒1（HIV1）、辛德毕斯病毒（Sindbis virus）、伪狂犬病病毒(PRV)、柯萨奇病毒（CVB6）］和非脂包膜病毒［脊髓灰质炎病毒（Polio1）和猿猴空泡病毒40（SV40）］的去除效果时，发现该方法对上述病毒的去除能力分别达到＞550、＞636、＞728、＞270、＞380 和＞551 log10。Baxter公司的研究人员选取牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、HIV1及PRV等脂包膜病毒，与HAV、猪细小病毒（PPV）等非脂包膜病毒，做低温乙醇沉淀的病毒验证工作，结果显示不同的组分分离都能实现病毒的去除，并且对非脂包膜病毒也能很好地去除（表1）［8］。此外，低温乙醇在去除传染性海绵状脑病（TSE）和朊病毒（PrPSc）上也发挥明显的作用，Lee等［9］在考察低温乙醇工艺对TSE和PrPSc的去除能力时，发现冷沉淀、冷沉淀+PEG、组分Ⅱ+Ⅲ、组分Ⅲ、组分Ⅳ1、组分Ⅳ1+PEG和组分Ⅳ4各步骤对TSE的去除效果分别达到10、22、60、53、37 log10及≥5.4和4.6 log10，而使PrPSc滴度分别降低1.0、3.0log10及≥4.7、≥4.3、≥4.2、≥4.9和≥4.1 log10。表1 乙醇沉淀去除脂包膜和非脂包膜病毒能力
&&步骤&&&&& & 去除能力（log10）& & & & 脂包膜病毒& & & & 非脂包膜病毒& & & & BVDV& & & & HIV1& & & & PRV& & & & HAV& & & & PPV& & & & &&冷上清/FrⅠ+Ⅱ+Ⅲ&&&&1.2±0.0&&&&5.8±0.0&&&&4.6±0.5&&&&1.9±0.8&&&&1.4±0.1&&&&FrⅠ+Ⅱ+Ⅲ/FrⅣ1&&&&2.8±0.5&&&&0&&&&3.4±0.4&&&&1.9±0.7&&&&1.2±0.3&&&&FrⅣ1/FrⅣ4&&&&&2.4±0.1&&&&≥4.4±0.5&&&&&4.8±0.1&&&&3.8±0.1&&&&2.2±0.3&&&&FrⅣ4/FrⅤ&&&&0.2±0.2&&&&≥5.0±0.5&&&&&4.6±0.0&&&&4.2±0.4&&&&3.4±0.5&&1.2 深层过滤 深层过滤是生物制品生产中常用的方法，通过机械过滤和电荷吸附将病毒去除。在低温乙醇工艺中，低pH环境使得病毒易吸附在过滤介质上而达到去除的效果。Trejo等［10］发现IVIg制备过程中深层滤器去除非脂包膜病毒PPV能力受辛酸浓度和pH影响，当辛酸浓度是15、20及26 mmol/L时，PPV滴度分别降低（2.5±0.0）、（3.3±0.3）及（2.9±0.4）log10；而pH为4.95、5.10及5.25时，PPV滴度分别降低（3.1±0.4）、（3.3±0.3）及（2.6±0.1）log10。van Hohen等［11］在研究深层滤器去除PrPSc时，也发现去除效果受pH影响，即成羊瘙痒症脑组织匀浆与Tris缓冲液的混合物进行深层过滤后，PrPSc的传染力只减少≤1.0 log10；此外高盐溶液将降低深层过滤对病毒的去除效果。Foster等［12］研究发现，不同型号深层滤器在IVIg和白蛋白生产中对异常朊蛋白PrPSc的去除能力也存在差异：在白蛋白的生产中，Seitz KS80型滤器处理组分Ⅴ时对PrPSc的去除能力≥4.1 log10，而CUNO Delipid 1型滤器的去除能力只有2.8 log10；在IVIg的制备过程中，组分Ⅰ+Ⅲ上清经Millipore AP20滤器处理后，可去除PrPSc 3.0 log10，而Seitz K200型滤器对组分Ⅱ中PrPSc的去除和降低能力则≥3.4 log10。因此，应根据工艺和处理原料的需要，选择合适的深层过滤设备用于实际生产中。
1.3 色谱 随着分离工艺的发展，层析技术已越来越多地应用到血浆蛋白的分离和提纯中，其中应用最广泛的是离子交换色谱和亲和层析色谱。Adcock等［13,14］研究白蛋白制备中色谱对HAV和HBV的去除效果时发现，DEAESepharose FF、CMSepharose FF和Sephacryl S200 HR 3种树脂对HBV的去除效果分别是＜0.3、0.3和1.5 log10，而对HAV的去除效果分别为5.3、1.5和4.2 log10，可见不同类型色谱在去除病毒能力上存在差异。此外，缓冲液的种类和成分也对色谱去病毒效果有影响。Strauss等［15］的研究表明，随着缓冲液电导率的提高，QSFF离子交换色谱对鼠白血病病毒（XMuLV）、SV40和鼠细小病毒(MMV)清除能力逐渐降低，并且TrisNaCl、Tris醋酸钠和HEPES醋酸钠3种不同的缓冲溶液也对病毒的去除产生较大影响；为此，在实际生产中应对缓冲液的电导率和种类加以考虑。Norling等［16］对新的和多次使用的离子交换色谱进行去除病毒能力的验证，结果显示经过上百次的使用和处理后，3种离子交换色谱还是表现出很好的病毒去除能力；此外离子交换色谱还可达到去除PrPSc的能力（表2）。Foster等［17］发现在纤维蛋白原、凝血酶、凝血因子Ⅷ(FⅧ)、凝血因子Ⅸ(FⅨ)及凝血酶原复合物的制备中，离子交换色谱去除PrPSc能力可分别达到≥3.5、3.0、3.1、3.0和3.0 log10。
& &&&亲和层析色谱是建立在目的蛋白质与固定化配基之间特异性、可逆相互作用基础上的蛋白分离技术，由于对目的蛋白具有高选择性和高收率等特点，亲和色谱在病毒去除上也有很好的潜力。Lawrence等［18］发现FⅧ︰C免疫亲和层析色谱可使EMCV和Sindbis病毒传染性分别降低4.0 log10。Tomokiyo等［19］同样发现抗FⅦ 单克隆抗体免疫亲和色谱具有显著的去除病毒能力，Sindbis和Polio病毒的去除效果分别达到4.4和2.8 log10。由此可见，亲和色谱能较好的保证制品的病毒安全性。表2 新的和多次使用的离子交换色谱对SV40、MVM病毒的去除
&&树脂&&&&使用次
&&数（次）&&&&处理溶液&&&&& & log10降低值& & & & MMV& & & & SV40& & & & &&QSepharose fast flow&&&&0&&&&无&&&&≥5.12±0.21&&&&≥4.28±0.14&&&& &&&&198&&&&0.5 mol/L NaOH&&&&≥5.06±0.07&&&&≥4.41±0.08&&&& &&&&124&&&&0.1 mol/L HCl&&&&4.15±0.13&&&&3.33±0.33&&&& &&&&84&&&&无&&&&4.45±0.13&&&&3.96±0.08&&&&QCeramic Hyper D&&&&0&&&&无&&&&≥5.22±0.02&&&&≥4.67±0.12&&&& &&&&203&&&&0.5 mol/L NaOH&&&&≥5.17±0.13&&&&≥4.52±0.02&&&&Toyopearl super&&&&0&&&&无&&&&3.49±0.19&&&&4.70±0.30&&&&Q650M&&&&203&&&&0.5 mol/L NaOH&&&&3.67±0.25&&&&≥4.81±0.09&&1.4 纳米膜过滤 纳米膜过滤技术通过膜孔径大小截留的原理，将病毒和目的蛋白分离。Furuya等［20］在进行FⅧ的纳米膜除病毒验证工作时，发现Planova 35 nm滤器对PRV和BVDV的处理能力较好，能使病毒传染性分别降低＞49、＞53 log10，但是对EMC和B19仅分别降低15、10 log10；将35 nm滤器替换成20 nm滤器后，不仅EMC和B19分别降低＞58、49 log10，同时PPV和HAV也分别降低51、34 log10。Kim等［21］在做FⅨ浓缩物的病毒验证工作时发现，Millipore公司生产的Viresolve NFP 20纳米膜过滤使非脂包膜病毒HAV、PPV和EMCV的传染性分别降低≥612、≥428和≥533 log10。van Holten等［22］也发现Viresolve 180型纳米膜滤器能去除PPV、EMC和HAV分别为33、41和＞51 log10。可见该方法通过膜孔径大小对常规病毒灭活方法不能很好处理的细小病毒B19和PPV等具有明显的优势。虽然膜孔径在除病毒时发挥重要作用，但研究表明原料成分、抗原/抗体复合物等对滤器的去除效果存在影响。Yokoyama等［23］发现将含有B19病毒的原料配制成03 mol/L甘氨酸溶液后，再经35 nm纳米膜处理，除B19病毒效果是75 log10，并且对EMC和PPV都能实现同样的效果；向溶液中添加5%白蛋白或免疫球蛋白后，该滤器处理病毒的效果却降低。Kreil等［24］发现在IVIg的制备中，35 nm滤器和15 nm滤器在去除EMC、B19和HAV上效果相当，原因是上述病毒与抗体形成的抗原抗体复合物被35 nm滤器有效截留。也正是上述原因，使得某些小病毒如BPV、Sindbis和SV40由于存在交叉反应抗体的中和作用，不能用于评价纳米膜过滤去除病毒的能力［25］。
2 病毒灭活方面
21 有机溶剂/去污剂（S/D法）处理 S/D法通过破坏脂包膜病毒的脂膜来达到去除病毒的效果，具有不易使蛋白质变性、高回收率和所需设备相对简单等优点；其典型的病毒灭活条件：03% 磷酸三丁酯（TNBP）在24℃用1% TritonX100处理4h，或用1% Tween80处理≥6 h。Horowitz等［26］对S/D法做了验证，发现该方法可使脂包膜病毒VSV、Sindbis、仙台病毒（SeV）、鸭HBV、HIV1、HIV2、HCV、CMV、HSV1、XMuLV和小鼠异嗜性病毒（Murine xenotropic virus）的滴度分别降低≥92、≥88、≥60、≥73、≥110、≥60、≥50、≥60、≥58、≥60和≥40 logID50。Uemura等［27］比较了S/D法和巴氏法对脂包膜病毒Sindbis和VSV的灭活效果，结果巴氏法对病毒的灭活能力分别是58、57 log10，而S/D法则是59、55 log10，可见S/D法是比较严格的灭活脂包膜病毒的方法。虽然S/D法可有效的灭活脂包膜病毒，但是研究表明其对非脂包膜病毒，如牛痘病毒（vaccinia）、HAV和B19的处理能力较差。Roberts 等［28］比较了03% TNBP在24℃用1% Triton X100处理4h，或用1% Tween80处理≥6 h 2种不同的灭活方式对病毒的处理效果，发现二者都能明显降低脂包膜病毒滴度，但是vaccinia病毒却表现出抗性。Lemon等［29］发现S/D法灭活HAV的能力只有122 log10。这就导致了上世纪90年代用S/D法处理的FⅧ制剂出现传播HAV的情况［30］。
221 巴氏消毒法 该方法能灭活所有脂包膜病毒和大部分非脂包膜病毒，在确保血液制品安全性上具有长期良好的记录。CSL公司在制备FⅧ浓缩物的过程中发现，巴氏法可使脂包膜病毒HIV、VSV、Sindbis、Vaccinia和非脂包膜病毒EMC的滴度分别降低≥70—105、≥679、≥648、≥536和≥71 log10［31］。Chandra等［32］也同样发现巴氏法能有效灭活脂包膜病毒，并能实现非脂包膜病毒EMC和Polio1传染能力降低452、＞73 log10。虽然巴氏法对病毒灭活效果好，但是研究表明不同蛋白溶液和稳定剂对巴氏法灭活效果存在影响［33］。Hattori等［34］发现巴氏法对IVIg制品中的B19能较快地完全灭活，结合珠蛋白中B19完全灭活较慢，而抗凝血酶Ⅲ制剂中B19病毒只能有限的灭活；在稳定剂保护下，巴氏法对猪肠病毒4（porcine enterovirus4，VIR918）的灭活效果不是很稳定，出现传播该病毒的情况。Chandra等［32］发现以蔗糖和醋酸钾为稳定剂的IVIg制剂用巴氏法处理时，脂包膜病毒经6 h可完全灭活，而非脂包膜病毒EMCV和VIR918经10 h处理后仍存在传染性。虽然存在上述问题，但是巴氏法仍是迄今为止最为严格的病毒处理方法，特别是近60年的临床研究表明，它处理的白蛋白是非常安全的，并将在保证血液制品病毒安全性上继续发挥很好的作用。
222 蒸汽处理法 该方法是在等效温度下，通过在开始加热之前加水蒸气而获得高质量的病毒灭活效果，能灭活脂包膜病毒和包括HAV在内的某些非脂包膜病毒，但是对B19效果较差。Barrett等［35］研究蒸汽处理法对不同种类和纯度的凝血因子浓缩物中HAV、HIV和PRV 3种病毒的灭活效果，发现该方法在规定的时间内能有效灭活脂包膜类病毒及非脂包膜病毒HAV（表3）。Baxter公司对其生产的ARTISS纤维蛋白胶做病毒验证时发现，蒸汽处理法使纤维蛋白原和凝血酶中脂包膜病毒HIV1、BVDV和PRV滴度分别降低＞55、＞57、＞67 log10及＞55、＞53、＞67 log10，非脂包膜病毒HAV的滴度降低＞56和＞49 log10，但是该法对MMV的灭活能力只达到12和10 log10［36］。Fryer等［37］在对蒸汽处理后的FⅧ进行B19病毒和新型细小病毒PARV4检测时发现，该制品受到这2种病毒的污染，存在传播细小病毒的可能性。此外还有蒸汽法处理的其它凝血因子浓缩物传播HCV和C1蛋白酶抑制剂传播HGV的报道［38］。表3 不同种类和纯度的凝血因子浓缩物在60℃蒸汽加热10 h
&&制品&&&&病毒&&&&灭活滴度（log10）&&&&最短灭活时间（h）&&&&中等纯度FⅧ&&&&HAV&&&&&33&&&&8&&&& &&&&HIV&&&&&68&&&&10&&&& &&&&PRV&&&&59&&&&10&&&&高等纯度FⅧ&&&&HAV&&&&39&&&&10&&&& &&&&HIV&&&&67&&&&10&&&& &&&&PRV&&&&56&&&&10&&&&中等纯度FⅨ&&&&HAV&&&&&57&&&&6&&&& &&&&HIV&&&&&65&&&&6&&&& &&&&PRV&&&&&71&&&&8&&&&高等纯度FⅨ&&&&HAV&&&&&67&&&&3&&&& &&&&HIV&&&&&79&&&&8&&&& &&&&PRV&&&&&68&&&&8&&223 终端干热法 目前在血浆蛋白分离工艺中，该法作为第2步病毒灭活工艺应用到凝血因子类制品的病毒灭活中。Kim等［39］对FⅧ浓缩剂进行100℃水浴 30 min处理，经验证该方法可使脂包膜病毒HIV、BHV、BVDV的滴度分别降低≥515、613和446 log10，对非脂包膜病毒EMCV、HAV处理效果分别为≥587和≥555 log10，但是对PPV的灭活效果只有190 log10。Roberts等［40］同样发现80℃ 8h的干热处理对HIV1和Sindbis病毒的灭活效果明显，分别达到＞50和40 log10，但是对HAV、BPV和PPV的处理能力仅分别＞28、04和16 log10；随着处理时间延长到72 h，上述3种病毒的滴度分别降低＞54、22和44 log10。可见延长处理时间可以得到较好的灭活效果。Roberts等［41］在后期研究中还发现在相同处理条件下，不同的非脂包膜病毒对热表现出不同的抗性：Polio1病毒经8h干热处理即可实现51 log10的灭活，HAV和BPV在冻干和热处理的共同作用下才可实现＞54和44 log10的灭活，B19病毒只有将处理时间增加到72 h才能取得明显的灭活效果，而PPV即使经过72 h处理其灭活效果也只是22 log10。针对B19和PPV等耐热性病毒不能简单的延长热处理时间，应通过与其它灭活方法相结合来确保制品的安全性。
23 低pH孵放法 作为IVIg特有的病毒灭活方法，该方法不但能减少制品抗补体活性、避免IgG聚合，同时在保证制品病毒安全性上发挥着重要的作用。Octapharma公司在制备多效价静注人免疫球蛋白OCTAGAM时发现，该制品经低pH孵放法处理后脂包膜病毒HIV1、PRV、SBV和非脂包膜病毒MEV的滴度分别降低≥86、≥77、≥89和≥62 log10，制品安全性得到极大提高［42］。Louie等［43］在研究中也发现，IVIg经pH 425，21℃下处理21 d后，可显著灭活BVDV和HCV。后期研究发现低pH孵放法的病毒处理效果受胃蛋白酶量、pH和温度影响较大。Kempf等［44］研究发现低pH孵放法可有效灭活脂包膜病毒HIV、HSV1、CMV、VSV和SFV，并且在胃蛋白酶的作用下加快了对VSV的灭活效果。Bos等［45］在进行IVIg的低pH孵放法的病毒验证工作时发现，pH 405，37℃条件下处理16 h可降低脂包膜病毒HIV、BVDV、PSR和非脂包膜病毒SV40和EMC滴度分别为≥84、≥40l、≥71、48和14 log10；将pH提高到425后，EMC的处理效果提高到≥41 log10。Baxter公司在制备新一代IVIg时，采用pH 405 30—32℃条件进行病毒灭活验证，HIV1、BVDV、WNV和PRV的滴度分别降低＞58、＞55、＞60和＞65 log10，而EMCV和MMV的灭活效果则达到＞63和31 log10［46］。Boschetti等［47］发现B19病毒经2 h的低pH处理后滴度降低＞5 log10。此外，IVIg制品在存放过程中的低pH环境同样具有灭活病毒的效果。
24 辛酸处理法 随着IVIg临床适应证的增加和需求量的扩大，各血液制品生产厂家不断寻求提高IgG回收率的方法。他们发现辛酸盐不仅起到沉淀蛋白的作用，同时还可在低pH条件下有效的灭活病毒。Johnston等［48］发现辛酸法的灭活病毒效果受温度、辛酸盐浓度和pH的影响。以BVDV作为模式病毒时，在10%白蛋白、16 mmol/L辛酸盐、pH 45，＞35℃处理1 h后，BVDV滴度无法检出，而相同条件下，0℃时即使处理12 h也不能达到灭活效果；在l0%白蛋白下考察辛酸浓度对灭活效果的影响，结果表明Sindbis病毒可在辛酸盐浓度＞16 mmol/L时瞬间灭活，而在8 mmol/L下需经10 h处理才能使病毒滴度下降 7 log10；在考察pH对灭活效果影响时发现，在10%白蛋白、16 mmol/L辛酸盐和30℃下，pH 43—47的不同范围对BVDV的灭活速率没有差别。为缩短病毒灭活时间、提高IgG收率和避免使用S/D灭活剂，Korneyeva等［49］将辛酸法和IVIg制备中常用的S/D法进行比较，结果表明辛酸在浓度为≥9、≥12和≥9 mmol/L条件下即可分别将组分Ⅱ+Ⅲ中的HIV1、BVDV和PRV病毒有效灭活；与S/D法相比，16 mmol/L辛酸对组分Ⅱ+Ⅲ中的BVDV灭活效果是S/D法的20—60倍，并且当辛酸浓度提高到19mmol/L时，其对溶液IgG的活性没有影响。在组分Ⅳ1中，40 mmol/L辛酸能快速灭活BVDV。上述数据表明，辛酸法可以替代S/D法成为IVIg和白蛋白制备中的病毒灭活工艺。Bayer公司在制备Gamunex IVIg时，将S/D法替换成辛酸法来确保制品安全性，验证表明辛酸法+深层过滤可降低脂包膜病毒BVDV及非脂包膜病毒Reo、HAV和PPV的滴度分别为27、≥35、≥36和40 log10，随后的辛酸法对脂包膜病毒HIV、PRV和BVDV的灭活效果分别≥45、≥46和≥45 log10。通过辛酸处理，制品安全性不但得到提高，并且IgG回收率高于传统的低温乙醇工艺［50,51］。此外，辛酸盐一直作为白蛋白制品的稳定剂，存在用药的安全性，将其作为新一代IVIg制品的病毒灭活方法具有极大的应用价值。
& &&&单一的病毒灭活/去除方法虽然能较好的起到处理病毒效果，但是无法灭活和去除所有病毒，如细小病毒B19、VIR918、PARV4、SV40和PrPSc；并且由于现有的检测手段不能完全排除血浆中可能存在的未知病毒，因此国内外相关机构规定在生产血浆蛋白类制品的过程中，为减少病毒传播的可能性，除了应有特定的脂包膜病毒灭活工艺外，还应加入特定的针对非脂包膜病毒的灭活工艺，即2种或2种以上的病毒灭活工艺，如S/D+干热法、低pH孵放法+S/D法和S/D法+纳米膜过滤+低pH孵放法等。与此同时，在考察病毒灭活方法对病毒的处理效果时，也应考虑到生产环节中乙醇沉淀、深层过滤、色谱等病毒去除方法在保证制品安全性上发挥的作用。只有将病毒去除和灭活工艺有机结合,从整体上来考察病毒的处理效果，才能真正意义上确保血液制品的病毒安全性。
建议弄个pdf.
鲜花鸡蛋&&在 08:59&&送朵鲜花&&并说：我非常同意你的观点，送朵鲜花鼓励一下
学习一下& &
老师，这个是好东西，可否弄个PDF文件上传呀？谢谢
《病毒灭活/去除工艺与血液制品病毒安全性》，好像是这篇文章,有谁能下吗
总结的特别好
Powered by低pH孵放法灭活生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法学研究--《中国中医科学院》2013年博士论文
低pH孵放法灭活生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法学研究
【摘要】：生物制品包括血液制品、基因制品、病毒类疫苗等,为了提高生物制品临床使用的安全性,生产工艺要具有一定的去除或灭活部分病毒的能力,生产过程中应有特定的去除或灭活病毒的方法。重组融合蛋白属于基因制品的一种,目前上市销售的重组融合蛋白类生物制品包括TNF-α、IFN-γ、IL-18、IL-12等,此类蛋白主要以中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary, CHO)作为表达载体。目前,CHO细胞表达抗体药物已经产业化。然而,CHO细胞内本身存在内源性逆转录病毒,这一结论已经得到证实；但这种内源性逆转录病毒对人类不具有致病性。尽管这种内源性逆转录病毒对于人类是非致病性的,但采用CHO细胞作为药用蛋白质的表达载体,其分泌的蛋白质对于人用药的安全性仍然具有的一定潜在风险。因此,各国新药研发相关法规要求对于CHO细胞来源的药用蛋白质,其生产工艺中必须具备病毒去除或灭活工艺,而且,必须对该工艺在实验室进行病毒去除或灭活的验证检验。我国相关生物制品生产厂家及生产品种逐年增多,但实验室验证研究的方法国内目前尚未建立,需在美国进行试验,因而时间长、费用高成为制约国内相关新药研发的关键问题。本课题根据SFDA相关法规和技术要求,建立此类蛋白药物的病毒灭活验证方法,以填补国内空白。
此外,本课题中建立的异嗜性小鼠白血病病毒(X-MulV)致猫神经星形胶质细胞(PG-4)产生病变效应的体外模型,不仅可以用于生物制品中病毒灭活验证检验,亦可用于抗逆转录病毒新药的筛选及药效学评价。
美国FDA及我国SFDA要求：对于CHO细胞来源的重组蛋白在低pH生产工艺的验证性试验中,采用X-MulV作为CHO细胞内源性逆转录病毒的指示病毒(又称作模拟病毒、替代病毒),建立低pH孵放法病毒灭活验证方法。
本课题共分三个部分进行研究：
一、X-MuIV体外培养及活性评价体系的建立
目前国外研究者采用Mus. Dunni细胞对X-MulV进行传代,由于该细胞株在国内即为少见,同时考虑到X-MulV能够在非小鼠细胞系生长的特点,我们选择以CHO细胞作为X-MulV的传代细胞,通过SYBR Green荧光定量聚合酶连反应(SYBR Green real-time PCR assay),以gag基因作为靶基因,定量X-MulV在CHO细胞中生长2-7天的相对表达量,并通过病毒感染性试验(PG-4细胞空斑试验)确定病毒数量显著增加时间点的病毒滴度。
结果显示：分别以培养时间作为横坐标、以指示病毒gag基因RNA的相对表达量作为纵坐标,绘制gag基因RNA相对表达量随时间变化的曲线。曲线显示：gag基因在CHO细胞中生长2-7天的生长曲线符合指数形式,指数方程拟合相关系数R2=0.9125,生长第7天的数量比第2天显著增长(p0.01),是第2天的13.89倍。
经CHO细胞传代培养7天的X-MulV悬液,其在指示细胞PG-4上的病毒滴度为8.78±0.25logioPFU/mL。病毒灭活方法指导原则中规定：作为指示病毒的病毒,其病毒滴度必须达到7.0log1o以上。
因此,以CHO细胞作为X-MulV的传代细胞,经培养7天得到的病毒悬液能够用于病毒灭活验证试验。
二、低pH法灭活生物制品中X-MulV方法的建立
1.缓冲体系的建立：在灭活验证试验中,模拟重组蛋白质的生产工艺,以Tris-碱-柠檬酸缓冲液体系作为样本缓冲液,将样本缓冲液与X-MulV储备液以9：1体积比混匀后,进行病毒灭活验证试验。
2.检测指标：以病毒滴度作为检测指标,当降低的病毒滴度大于4.0log10PFU视为有效灭活。
3.灭活参数考察：包括pH值、灭活温度、灭活时间以及蛋白质浓度对灭活效果的影响。灭活试验中设置不同因素、不同水平参数如下：灭活pH值：3.00、3.50、4.00以及5.00；灭活温度：4℃、10℃、20℃以及25℃；灭活时间：2h、4h、6h、8h以及10h；蛋白质浓度(以卵清白蛋白作为模拟蛋白,OVA):0mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL、8.0mg/mL、9.0mg/mL以及10.0mg/mL。将不同因素、不同水平按照排列组合的方式组合后,分别进行病毒灭活验证试验。
对所有得到的残余病毒滴度进行统计学分析,通过正交分析主成分分析得出：不同因素对病毒滴度的影响大小依次是：pH温度时间；pH值和温度对病毒滴度有显著的影响(p0.01),时间不具有显著性影响(p=0.264)；通过正交分析交互作用分析得出：温度和时间之间的交互作用对病毒滴度具有显著性影响(p=0.016)；通过正交分析筛选出的最优灭活条件为：pH3.50、4℃、4h。多元线性回归分析显示：pH值能够显著影响病毒滴度(p0.01),温度能够影响病毒滴度,但影响不具有显著性(p=0.081),时间对病毒滴度没有影响(p=0.941)。结合上述分析结果,同时考虑到实际灭活工艺在常温条件下进行；因此,在考察蛋白质浓度对病毒滴度的影响时,在pH3.50、4h一致的前提下,同时考察4℃和25℃的灭活效度。经灭活后,蛋白质浓度从0mg/mL～10.0mg/mL范围内,4℃组和25℃组病毒滴度降低分别大于4.1log10PFU和4.7log10PFU;且25℃组样本病毒降低滴度基本大于5.0log10PFU。
在此基础上,进行pH值、温度及时间因素允许范围的考察。通过病毒感染性试验,当灭活温度为25℃、孵育4h时,pH值在3.60-3.90范围内,X-MulV病毒滴度降低均大于5.0log10PFU;当pH为3.60、孵育4h时,温度在23℃、24℃、25℃、26℃以及27℃范围时,X-MulV病毒滴度降低均大于5.0log10PFU;当pH值为3.60、孵育温度为25℃时,灭活0～180min不能有效灭活X-MulV,灭活240min能够有效灭活X-MulV。通过参数允许变化范围的考察,结合相关文献报道：pH3.50时,生物制品会有少量损失。我们将最优灭活条件设为：pH3.60、25℃及4h。
4.逆转录酶活性检测：为了进一步评价灭活效度,采用产物增强的逆转录酶反应法(简称为PERT法)考察X-MulV灭活前后逆转录酶活性的变化。结果显示：以MMLV作为已知浓度的标准逆转录酶,通过逆转录酶浓度-CT值标准曲线,计算样本中逆转录酶的含量。经SYBR Green荧光定量PCR反应检测逆转录酶活性,经pH3.50、4h灭活后,逆转录酶含量比未灭活样本降低两个数量级,具有显著性差异(p0.01),且4℃组与25℃组之间没有显著性差异(p0.05)。
5.低pH对生物制品活性的影响：选择L929细胞株作为靶细胞,采用MTT比色法检测rhTNF-α的对L929细胞的杀伤活性。将rhTNF-α经pH3.60、25℃孵育4h后,其杀伤L929细胞活性与中性rhTNF-α相比,未发生变化。
6.低pH对病毒包膜基因的影响：利用传统聚合酶链式反应,考察X-MulV在有效灭活前后,包膜基因env3’末端位点片段的扩增情况。X-MulV经pH3.60、25℃灭活4h后,env3’末端305bp片段未扩增出,而阳性对照中该片段条带清晰,且亮度高。
三、试验方法的实际应用
采用pH3.60、25℃、4h的灭活条件对百奥泰(广州)生物科技有限公司提供的注射用rhTNF-a融合蛋白进行X-MulV的灭活验证,结果显示病毒滴度降低4.0loglo以上,说明此条件能够有效灭活指示病毒X-MulV,符合国际规定的病毒滴度降低大于4.0log1o的要求。
通过以上研究,我们得出结论：
1.以CHO细胞作为X-MulV的传代载体,培养7天,获得的X-MulV病毒悬液,在PG-4细胞中的病毒滴度能够达到7.0log10PFU以上,符合生物制品病毒灭活指导原则关于指示病毒的要求；
2.采用pH3.60、25℃、4h灭活CHO细胞来源的人重组融合TNF-a蛋白药物中指示病毒X-MulV,能够实现有效灭活,其病毒滴度降低大于4.0log10PFU,说明通过本研究建立的验证性试验方法可行；
3.此灭活条件对所检测样品的生物学活性无影响；
4.低pH影响包膜基因env3’末端位点,X-MulV能够被有效灭活可能与该位点有关。
【学位授予单位】：中国中医科学院【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：R450;R733.7
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