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保存至快速回贴2016年媒体融合：现状、问题与对策--人民政协报
2016年媒体融合：现状、问题与对策
2016年，媒体融合发展的趋势特征更加明显。搭乘“互联网+”的快车，传媒业不断探索，深入转型，在内容、技术、渠道、管理等多方面的深度融合，传统媒体与新媒体融合发展的广度拓宽、速度加快、力度增加。“所当乘着势也，不可失去时也。”在信息传播技术变革方兴未艾的今天，媒体只有树立融合发展的理念，强化互联网思维，推动体制创新和业务创新，适应媒体融合发展的趋势，才能赢得主动、赢得优势、赢得未来。■新闻入口与平台成为发展重点2016年，传统媒体的寒冬并没有过去。《今日早报》、《九江晨报》、《外滩画报》等一些报纸杂志均没有躲过市场的考验，相继宣布停刊。一些因网络冲击而遇到发展瓶颈的纸媒虽然停刊，但却选择通过平台转移的方式继续进行新闻内容生产。浙江《今日早报》在其停刊《致读者信》中写道：“我们告别了一张报纸，但我们并没有离开。从明天开始，我们的团队将转赴媒体融合的新战场。”传统媒体与新兴媒体融合的途径之一，是进行传播平台的转移与搭建，通过抢占新闻入口获得用户青睐。而传统媒体在从旧平台到新平台转移的过程中，出现了两种不同的方式：一种是自建平台，另一种是平台入驻。在自建平台上，继日“澎湃新闻”上线后，2015年广东“并读新闻”（4月15日）、北京“无界新闻”（9月16日）、武汉“九派新闻”（9月23日）和重庆“上游新闻”（11月18日）也陆续上线。其中，上海报业集团改革后的第一个成果“澎湃新闻”主打时政与思想，由长江日报报业集团打造的“九派新闻”侧重于全国性舆论，“并读新闻”则在新闻社交互动与盈利方式上进行了创新。传统媒体通过资源整合，搭建新型传播平台的形式开拓融合道路。同时，继打造媒体新闻网站后，一些传统媒体依托本身的经济力、品牌力和影响力通过独立开发媒体APP的形式，进行传播平台转移。比如，人民日报社、新华社、中央电视台等依托政策和技术等资本最早进行了新媒体平台探索，打造了“人民日报”“新华社”“央视新闻”等独立媒体APP。一些地方媒体也纷纷通过媒体APP抢占网络新闻入口，例如“新京报新闻”“华西都市报News”“北京日报”“南都自媒体”“新锐大众”等媒体APP均已上线。媒体客户端一般由传统媒体独立运营，因此在专业新闻内容的提供上具有优势。在入驻平台形式上，目前传统媒体主要的入驻平台有微博、微信和聚合类新闻客户端。入驻“两微一端”已经成为了传统媒体融合发展的标配。传统媒体通过在社交媒体开通账号，不间断地发布信息，集图片、视频、音频等形式于一体，增加用户黏性。依托多对多的裂变式传播机制，媒体信息在微博上的发酵速度快，传播影响力大。截至日，人民日报、中央电视台新闻中心、新京报等传统媒体的新浪官微分别拥有4858万、4583万、2177万的千万级粉丝量。借助高粉丝数与裂变传播，传统媒体在微博领域拥有较为强大的微传播力。根据企鹅智酷发布的《2016年微信影响力报告》数据显示，资讯成为用户关注公众号的第一需求，约3/4的用户表示，获取资讯是关注微信公众号的主要目的。■现有机制难以适应媒体融合发展在媒体融合发展逐渐深化的同时，由于理念、资本、技术、机制等条件的制约和限制，一些经济发展较为落后地区的媒体和地市级传统媒体的融合发展工作进展较为缓慢。国内媒体融合发展现状呈现出发展程度不均衡的特点。在新闻生产机制上，以传统媒体优先的供稿方式已经不能适应新媒体时效性的需求，传统线性新闻采编生产流程也不能满足网络传播的需要。传统以图文为主的新闻采编方式会导致新媒体平台内容素材过于单一，形式过于死板，无法吸引用户的注意力和阅读兴趣，从而影响平台的传播力和影响力。资源共享机制是新媒体时代新闻生产的核心机制之一，资源共享的不完善导致大量的信息资源浪费，同时对后期编辑进行信息梳理和整合带来困难，造成资源整合不足。在信息传播机制上，以媒体为传播主体，以用户为受众的单向传播方式已经不是新媒体时代信息传播的主旋律。在信息传播流程中，传统信息告知式和层级式的推广方式传播存在速度慢、传播范围窄的缺点，需要优化。信息生产完毕需要进行多终端多途径多媒介的分发，有效的信息分发机制也是影响媒体传播力的一个重要因素。在媒体管理机制上，媒体运营机制和考核机制是其中的两项重点内容。传统媒体运营主要依靠广告进行“二次售卖”获利。然而目前传统媒体受众向新媒体平台转移，传统媒体发行数量、订阅数量、收视率、收听率的下降使广告收益随之下降。在传统媒体广告收入全面减少的媒体生态环境下，以广告为主的单一运营模式不能适应媒体融合发展需要。在考核机制上，以传统媒体工作成果为标准的采编人员绩效、评估、激励等机制也因缺乏新媒体考核标准而具有片面性。习近平总书记指出，媒体竞争关键是人才竞争，媒体优势核心是人才优势。目前，媒体融合面临两方面的人才困境：第一，媒体优秀人才流失加速；第二，新媒体人才处于引进整合发展期。“互联网+”行动计划带动互联网与媒体业结合，媒体业在融合发展中转型升级需要大量的跨媒体和全媒体人才。在互联网和移动互联网时代，数据分析师、UI设计师、舆情分析师、新媒体编辑等兼具高技能和新媒体素养的人才成为市场缺口，单方面具备技术或新闻业务生产能力的从业者，均不能满足新时代媒体的发展需要。■创新管理机制和多元经营模式媒体融合的前提是理念和思维的转变。互联网时代的特点是开放、平等和共享，要求媒体从业者调整工作理念和方式方法，快速融合到网络中，兼具传统媒体专业理念和新媒体思维。媒体融合意味着传统媒体要进行工作重点迁移，在兼顾传统媒体业务的同时，把互联网和移动互联网作为工作的主战场，把新媒体工作当做重点任务部署与完成。只有思想上提高对新媒体地位的重视，才能全面建设、运营和融合好新媒体发展。新传播技术的快速迭代对媒体机制创新提出了更高的要求。媒体在保证专业化发展的前提下，根据市场、政府、用户等多方的需求及时更新和完善运行机制，以适应时代的发展。在新闻生产方面，统一的新闻供稿机制可以实现新闻信息资源及时共享，新媒体平台得以随时更新信息和提前发布。而类似“新媒体中心”“融媒体中心”“中央编辑部”等新媒体部门的建立，则在空间布局上为新闻采编工作的开展提供了便利。一些媒体集团如上报集团、重庆日报、浙江日报等通过运行内部项目孵化机制，对报社集团内部员工从事新媒体创业项目进行了鼓励。媒体需要通过技术融合创新新闻呈现方式，便于用户阅读新闻，进行信息获取和传播。在2016年两会报道中，一些H5页面受到了用户青睐，如人民日报社全媒体平台推出的添加了生活场景的《傅莹邀请您加入群聊啦》和《北京的哥“舌战”五部长》H5页面，得到用户的大量阅读、点赞、评论、转发，产生了良好的传播效果。多屏时代媒体通过矩阵化发展，建立媒体生态系统，形成多产品集群，实现全平台推广，是融合发展的路径选择之一。在融合发展中，媒体可以通过广告、电商、增值服务等多元商业模式和多产业发展拓宽盈利渠道，获取商业价值。通过打造内容品牌和媒体形象，延续和重构媒体的公信力和影响力，利用媒体品牌价值获利。同时综合运用技术手段进行运营创新。例如建立用户资料数据库，分析用户新媒体使用习惯和网络习惯，勾勒用户画像，从而保证精准运营。值得一提的是，在实际操作中，采编系统与经营系统的分开与独立是媒体进行商业运作的前提。在资本方面，作为一项复杂的工程，媒体融合发展需要大量的资金作为后盾。因此，在资本运作上，媒体可以通过上市、收购等方式引入资本支持。（唐绪军，中国社会科学院新闻与传播研究所所长，研究员；黄楚新，中国社会科学院新媒体研究中心副主任兼秘书长，研究员；王丹，中国社会科学院研究生院新闻学与传播学系硕士研究生。）无人机数据融合的问题_百度知道
无人机数据融合的问题
还有这里为啥要用双gps定位
我有更好的答案
无人机的未来是很可观的，在克服了信息干扰等复杂的战场环境下作战和为其开发出新的战术以后，无人机会代替有人机成为未来的空中霸主。但直升机的地位很尴尬要看未来的装甲技术，可能的话会代替坦克的作用。两者之家的交战时肯定会有的，大规模不可能，这要看他们的功能。
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<p class="detail" data-data='前几天突然读取很慢，有时候读不出来。(进不了系统了.但在重启一次之后能进了。读不出来，硬盘会出声。有时候进一个系统10分钟。读一个界面硬盘响一次。)在换了一个SATA供电接口和SATA3.0数据线之后能进系统了。能读能玩了，但玩还是那么时不时会卡一下。GTA4 一大堆画面MOD和ENB有时也读不出来，有时玩着玩着直接卡掉。甚至死机。怀疑不是问题就是硬盘问题。电源是红警那系列的500W ,硬盘是西数1TB。都是问题骚年。但是我也怀疑是系统问题。系统5个月没换了。还有就是我怀疑是我超频弄的，小超了一下。还有CPU .还有就是最近想加块希捷的SSHD(ST)是双挂好还是组raid好？RAID 0风险大不大？'>前几天突然硬盘读取很慢，有时候读不出来。(进不了系统了.但在重启一次之后能进了。读不出来，硬盘会出声。有时候进一个系统10分钟。读一个界面硬盘响一次。
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【专题讨论】单抗制备过程中出现的问题
本人单抗制备进行中，碰到几个问题，请教大家：1.Sp2/0在融合前生长反而不好，有死亡现象，是否因为培养过久，传代过多所致？大概养了3周。2.在做融合实验前我采集小鼠血清，请问血清在－20度能存多久？抗体效价是否会下降？3.融合后铺的96孔板换液时枪头需不需要每一孔都换啊？一般是半换液还是全换液呢？如果在融合一周后换，培养上清中不是可能有抗体吗？弃之？4.我前一段时间自配了HT母液，－20度分装冻存，前天拿出来配应用液时发现有一层东西黏附在冻存管周围？请问是怎么回事？还能用吗？还有：我制备的有的饲养细胞板中饲养细胞不多，感觉融合细胞生长状态不好，是否需要补种饲养细胞？wfy2004026 wrote:本人单抗制备进行中，碰到几个问题，请教大家：1.Sp2/0在融合前生长反而不好，有死亡现象，是否因为培养过久，传代过多所致？大概养了3周。2.在做融合实验前我采集小鼠血清，请问血清在－20度能存多久？抗体效价是否会下降？3.融合后铺的96孔板换液时枪头需不需要每一孔都换啊？一般是半换液还是全换液呢？如果在融合一周后换，培养上清中不是可能有抗体吗？弃之？4.我前一段时间自配了HT母液，－20度分装冻存，前天拿出来配应用液时发现有一层东西黏附在冻存管周围？请问是怎么回事？还能用吗？1.传代过多会引起细胞的反祖或变异现象，由于SP2/0为缺陷株，在不能确定是否对HAT培养基敏感的情况下，可用8－杂氮嘌呤处理。但这不会引起细胞的死亡现象，死亡现象可能是由于细胞本身活力和培养基的原因，建议用与融合后培养的同种培养基，血清浓度达15％以上时，应该传代培养不需3周。这个时间太长。2.半年应该没有问题，最好分装保存。3.枪头可以不每孔一换，但要保证不污染。我们是3天后直接补加，后期依细胞生长状态换液，半换较好些。一般克隆形成依铺板时细胞数量的不同，时间长短也不同。一周内克隆的个体一般不会太大，换液没有问题，若开始分泌抗体，换液后两天即可达到应有的水平，不会影响检测。不过如果克隆已经很明显，则可直接检测该上清。4.没遇到过这类情况，不好说。wfy2004026 wrote:还有：我制备的有的饲养细胞板中饲养细胞不多，感觉融合细胞生长状态不好，是否需要补种饲养细胞？饲养细胞最好在融合前或与融合细胞同时加入，以起到优化生长环境的作用。可以适当的加些饲养细胞试试看，但不可太多。谢谢小蚂哥！我来锦上添花一下：1.－20度保存血清最好是用50％甘油，如果不使用甘油的话最好多冻存几支，反复冻融绝对会影响抗体的效价，一般小鼠眼球采血可得500ul左右血清，而且效价很高的话50ul冻存一支可以用很长时间2.不知道你们有没有那种医院用的电动吸液泵，换液时用很方便，但一般都是半孔换液，不会影响到细胞；只要细胞没有被吸掉，那么抗体总是会有的3.自配的HT是有这种毛病，我们也常遇到，这是HT在4度析出了，可以在实验之前放37度半小时，如果还是不溶（常有），就用吸管吹匀，加入配液后就完全溶解了4.个人认为三天到一周之内补加培液的目的，不是对营养的补充而是对培养环境的改善，因为这段时间内多数非融合细胞因死亡而裂解，孔内大浓度的细胞裂解液对处于分裂初期的融合细胞是具有很大的毒性的，而抗体检测只有当克隆已经达到目测水平时才可以进行，此时恐怕为时过早借LZ贵地请教一下，加入HAT筛选后，SP2/0是不是头两天就可见大规模死亡？细胞碎片对融合细胞的生长会不会有影响？有时候觉得3天基本SP2/0就死完了，板中很多碎片，很担心融合细胞会不会也死了。个人认为HAT的使用浓度可能根据试剂纯度不同是不是有差异，是不是也该根据细胞情况加以调整，你们都是怎么确定调整的？不知大家做筛选时SP2/0一般要等好久才死完，有没有什么方法可以确定？midaizi wrote:借LZ贵地请教一下，加入HAT筛选后，SP2/0是不是头两天就可见大规模死亡？细胞碎片对融合细胞的生长会不会有影响？有时候觉得3天基本SP2/0就死完了，板中很多碎片，很担心融合细胞会不会也死了。个人认为HAT的使用浓度可能根据试剂纯度不同是不是有差异，是不是也该根据细胞情况加以调整，你们都是怎么确定调整的？不知大家做筛选时SP2/0一般要等好久才死完，有没有什么方法可以确定？我的体会是，可以目测的大规模死亡一般在3－5天内。细胞碎片或多或少肯定有些影响，但不会对融合细胞产生根本性的影响，事实上在细胞死亡后，细胞碎片是很多的，而且无法处理。3天细胞死亡应该是很正常的，融合细胞是否死亡只有看运气了。HAT浓度可以做筛选调整，如果有已经建立的杂交瘤细胞株的话，可以用来做个剃度看看，在什么浓度下对杂交瘤也有影响。另外再用sP2/0做筛选，看看在什么浓度下，SP2/0会死亡。选择浓度应该介于这二者之间。如果没有条件的话，就用1％的浓度应该问题不大的。细胞死亡时间3－5天，或长或短，但一般不超过一周，没有什么好的方法确定，事实上，细胞也不可能完全死完的，比如混在饲养细胞中的纤维状细胞就比较难死，但只要有明显的克隆形成，而且生长正常的话，这些在后期的亚克隆中是可以去掉的。那么融合细胞的初步筛选，即检测阳性抗体孔，一般是在什么时候？校价与母体免疫小鼠的血清校价相比差别大不大？如果血清校价1：1万可以测出的方法，能够检测出阳性孔的上清抗体吗？如果不能，如何确定是没有阳性孔还是抗体太少导致检测不出呐？midaizi wrote:那么融合细胞的初步筛选，即检测阳性抗体孔，一般是在什么时候？校价与母体免疫小鼠的血清校价相比差别大不大？如果血清校价1：1万可以测出的方法，能够检测出阳性孔的上清抗体吗？如果不能，如何确定是没有阳性孔还是抗体太少导致检测不出呐？1、检测阳性抗体孔没有固定的时间，快的话10天左右，慢的话可能要15天左右，根据细胞的长势，分批检测。一般以能够目测到较大的克隆，约占孔1/5左右吧，如果效价高再小点也有可能检出。2、效价与血清差别还是有的，由于细胞数量的有限，效价自然要低，不过按照上清1：1或1：2稀释后来检测还是能够检出来的。3、如果第一次没有检测出来可以2天后再次取样检测，如果连续几次都检测不出来的话，应该就是阴性的克隆，可以丢掉。这样啊，受教了，谢谢waynepionnet
!我也来请教一个问题吧:
我最近复苏一只冻存了5年的骨髓瘤细胞,想扩大培养,再筛一遍.结果刚复苏出来的时候看着细胞还是挺多的,也有贴壁的.可过了两天，细胞就都没了.现在里面细胞已经非常少了,基本上这次是失败了.
想请问一下,这样的条件下，我需要换培养液么?
再问一下,这样的情况下,怎么样的处理会比较好一点?waynepionnet wrote:1.一般以能够目测到较大的克隆，约占孔1/5左右吧，如果效价高再小点也有可能检出。2.按照上清1：1或1：2稀释后来检测还是能够检出来的。请问：1.怎么个目测法啊？是在板底看吗？2.检测培养上清需要稀释吗？用什么稀释？alfred_zhu_cn wrote:我也来请教一个问题吧:我最近复苏一只冻存了5年的骨髓瘤细胞,想扩大培养,再筛一遍.结果刚复苏出来的时候看着细胞还是挺多的,也有贴壁的.可过了两天，细胞就都没了.现在里面细胞已经非常少了,基本上这次是失败了.想请问一下,这样的条件下，我需要换培养液么?再问一下,这样的情况下,怎么样的处理会比较好一点? 1.刚复苏的细胞尽量用小培养瓶培养。2.培养基血清质量非常关键。3.培养骨髓瘤细胞一定要注意传代的时间，若不能及时传代致使细胞生长过度，极易导致你所描述的现象，此时细胞很难再救活，失去培养意义，建议你重新复苏。wfy2004026 wrote:waynepionnet wrote:1.一般以能够目测到较大的克隆，约占孔1/5左右吧，如果效价高再小点也有可能检出。2.按照上清1：1或1：2稀释后来检测还是能够检出来的。请问：1.怎么个目测法啊？是在板底看吗？2.检测培养上清需要稀释吗？用什么稀释？1.在显微镜下观察，估计一下大小就可以了。2.一般每样做两孔，比照一下，50ul/孔，可以适当稀释一下，比如1：2稀释，影响不大，一开始主要是找到阳性克隆就行了，选择较好的几孔克隆。感谢 风雨の人生 :1.刚复苏的细胞尽量用小培养瓶培养。2.培养基血清质量非常关键。3.培养骨髓瘤细胞一定要注意传代的时间，若不能及时传代致使细胞生长过度，极易导致你所描述的现象，此时细胞很难再救活，失去培养意义，建议你重新复苏。
现在已经渐渐长出来了,还可以.自己觉得可能是换液稍微慢了一点,也许复苏出来的第二天就应该换液,去处死细胞.还觉得,操作时,应尽量轻缓一点,保护贴壁的细胞.请教一个问题：
我也正在做单克隆抗体，我想用ELISA方法对杂交瘤进行筛选，我们实验室有HRP标记的羊抗鼠IgG，如果用来进行单抗的筛选，得到的单抗是不是都是IgG亚类，那么IgM类型不就漏掉了吗？有没有针对所有Ig的酶标抗体，我没有找到，我该如何进行筛选？敬请赐教，谢谢！！对，理论上IgM可能会漏掉，但实际中似乎不完全这样。用你所用的IgG-HRP，也经常有筛到IgM的报道，可能是交叉反应的原因吧。IgM比较讨厌，结构太花哨，一般作检测不大用它，当然如果有特殊目的可能要考虑方法变换。rapidtest说的很有道理，由于同种异类Ig的轻链结构抗原性相似，因而常常会出现交叉反应，即在筛选中如果用抗小鼠IgG H+L的抗体，就有可能筛选到IgM的单抗。请教一个问题：我也正在做单克隆抗体，我想用ELISA方法对杂交瘤进行筛选，我们实验室有HRP标记的羊抗鼠IgG，如果用来进行单抗的筛选，得到的单抗是不是都是IgG亚类，那么IgM类型不就漏掉了吗？有没有针对所有Ig的酶标抗体，我没有找到，我该如何进行筛选？敬请赐教，谢谢！有goat anti mouse Ig(H+L)-HRP, 我们用的是southernbiotech的，效果不错，一直在用。其实有时候，得到IgM类的单抗会影响到以后的应用，交叉反应也多，我们倒不希望是IgM的！筛选时用间接ELISA法，用抗原包被酶标板，加入杂交瘤培养上清，孵育后洗板，加二抗后就可以显色了，注意要做阴性和阳性对照，特别是融合后第一次筛选的时候。我还有几个问题:1.饲养细胞大概多久死啊？我融合后都两周了，饲养细胞还是好好着的。而且，好像还有增殖呢。2.我的克隆怎么长不到1/5孔就已经死了啊？wfy2004026 wrote:我还有几个问题:1.饲养细胞大概多久死啊？我融合后都两周了，饲养细胞还是好好着的。而且，好像还有增殖呢。2.我的克隆怎么长不到1/5孔就已经死了啊？1.事实上饲养细胞不是很纯的，除了巨噬细胞、淋巴细胞，可能会有其它杂细胞，比如组织中纤维细胞等，有些细胞自始至终好像都不会死亡，正如你所说，当后期换为HT或正常培养基后，活下来的细胞可能增殖，所以克隆得及时亚克隆，但这些细胞在克隆后往往会死亡，具体机理我也不是很清楚，大家可来探讨一下。2.1/5只是一个参考值，并不是说一定要长到1/5才能亚克隆，关键还在于自己对克隆的判断，毕竟还是存在个体差异的嘛如果出现克隆后检测是强阳性的，自己不能很好判断细胞长势的话，就直接亚克隆吧，省得夜长梦多。推荐学习，战友整理的关于单克隆抗体制备的帖子，内容很不错。>各位单抗前辈：今年做融合做了5次一次都没融合上，愁死了，帮忙分析一下原因：1。SP2/0细胞在融合前出现很多大的细胞，用8N培养不死，但是对HAT耐受性也非常强，三天也不能把它完全杀死，换用其他批次的细胞，在培养过程中还是会产生。大细胞的产生没有影响其他细胞的生长。这与血清还是抗生素有关吗。（培养基是20%1640+1%双抗）2。我们这边PEG用的是4000，自己配的。（0。6g高压过的PEG40）PH值在7-7。5左右。另外可能还有一些关键因素，请各位高手指点帮忙，我快不行了，来不及毕业了，郁闷崩溃中啊……异常感谢！1.这种细胞不能用了，如果HAT三天不死就得换，你用96孔板做一个单克隆筛选一下sp2/0，选择形态亮度都不错的细胞扩大培养，一般96孔的环境是最有利于细胞生长的，如果还出现大细胞就更换细胞株吧2.建议你寻找一下其他课题组的同学用不同的培液、血清对你的细胞进行培养，看看有没有出现相同的情况3.用1500的PEG试试很多大的细胞是什么样的，是不是与SP2/0形态相近，但大小不一，出现在什么时期，还是一直都有？如果是在培养过程中出现的话，有可能是SP2/0细胞处于生长分裂阶段，没有关系的。如果是一直都有的话，就按jevens_lee的建议，筛选一下，或换一下细胞。双抗浓度过高，是会影响细胞形态的，但1％应该没有问题。有报道说PEG在8.0左右融合效果好，但没比较过。PEG3000左右都没问题，融合的操作很重要，时间得把握好。因为PEG的分子量大小、浓度与毒力有关，所以融合时间的长短，在什么时候终止，得控制好。其他同意jevens_lee的观点。我用96孔板取过单克隆细胞增殖过,用8N鸟嘌呤培养基培养,但是还没长满96孔板,又出现大细胞,呈单个分布.基本不分裂,形态大,亮.对8N没作用,用HAT杀,也不容易杀死.在其他均一的SP2/0细胞死亡后仍可见.用过3批不同的血清试过,均出现这种状况.细胞批次也选用不同的,在传代过程中也有大细胞生成.据说以前也有但不多,现在10倍镜一个视野可见5-10个.
还有这些天融合有一次有两个融合孔但是没有阳性,后来把PEG很精确的调整到50%,PEG加入时用了60s,再作用2分钟后,然后缓慢加入HAT完全培养基终止.这个PROTOCAL是我们老板给的,会不会有问题啊,但是结果今天第五天几乎没有融合孔.
我准备28号再做融合,所以请大家多帮忙啊!同时非常感谢jevens_lee及waynepionnet的帮助!不要心急，第五天都没有发现融合孔也很正常，建议你不要太早下结论，一周后按原计划更换培液试试，你也可以在融合后第三天就换半孔培液，但要十分小心。你的离心是用多少转的？刚融合的细胞非常脆弱，离心转速不可以超过800rpm。还是建议你更换PEG，一般分子量越大似乎对细胞的毒性越强。离心用的速度是800rpm，好象也没有太大问题。现在用了单克隆孔培养出来的细胞好象没那么多大细胞了，不过还有。我们融合的时候将小鼠腹腔巨嗜细胞加入到HAT培养基里，然后再重悬融合的细胞，铺板的时候每孔100u，以前我们都是到第五天才换液，不知道会不会换液不及时使融合的细胞死掉。因为有师姐说三天内换液会冲散融合细胞，不利于其生长。但是我看见斑上好多前辈都说三天补液或加液，请问我们这种做法会不会导致无融合细胞生长。我们铺板梯度稀释细胞，一开始加入40ml,铺完l块再补加HAT至40ml,依次扑满5快96孔板。第一，二块板总觉密度太大，这会有影响吗？谢谢各位了！离心以前园子里有不大于500g的说法，我们一般用的800rpm，没去计算过g大小。终止的时候用的是基础培养基，不需要用HAT的。换液是一个动态的掌握，主要根据细胞的长势来看，如果细胞张的快而没有及时换液，肯定是有影响的。剃度铺板是没有问题的，如果自己不能很好把握细胞的浓度，用这种方法还是比较合适的。请教：1.亚克隆后第八天仍然没有看见明显的克隆集落形成，是不是表示亚克隆失败？2.亚克隆是在单个细胞的基础上分化出来的，那么克隆集落出现的时间是不是要比融合后长呢？谢谢指教！1、情况不是很妙，在等两天看看吧，如果两周以内没有结果的话，肯定是失败了。2、是要稍长些。yuerhaoren wrote:离心用的速度是800rpm，好象也没有太大问题。现在用了单克隆孔培养出来的细胞好象没那么多大细胞了，不过还有。我们融合的时候将小鼠腹腔巨嗜细胞加入到HAT培养基里，然后再重悬融合的细胞，铺板的时候每孔100u，以前我们都是到第五天才换液，不知道会不会换液不及时使融合的细胞死掉。因为有师姐说三天内换液会冲散融合细胞，不利于其生长。但是我看见斑上好多前辈都说三天补液或加液，请问我们这种做法会不会导致无融合细胞生长。我们铺板梯度稀释细胞，一开始加入40ml,铺完l块再补加HAT至40ml,依次扑满5快96孔板。第一，二块板总觉密度太大，这会有影响吗？谢谢各位了！800rpm肯定没有问题，我做的时候又一次做懵了，离了5分钟之后发现用的离心速度是8000，当时我以为肯定不行了，但是还是长克隆了，所以说离心不是决定性的因素。第五天换液没有问题，因为我们有个同学在苏州做单抗，在换用HT之前他们是不换液的，也就是８天不换液。我没敢用这方法，我是３－５天半量换液的，你们师姐说的有道理，过早是会冲散本就不多的细胞。没有必要梯度稀释细胞，离心后直接稀释到４０ml的离心管中然后每孔上５０ul，一共种８块板子多方便。骨髓瘤大概用３瓶７５的，密度要到９０％左右。还有就是融合过程的问题了，总之是要在混匀的前提下尽量的轻柔。还有就是每个实验室都有自己不同的supplement，这个也很重要哦。以上仅供参考。小弟初来贵地，看了大家的帖子后，对我受益不少。不过实验出现的问题还是有几个没有明白：1.我的融合没有成功，但几天后包括饲养细胞也看不见了，这正常吗？2.融合后,融合细胞是用HAT培养基还是完全培养基吹匀加到96孔板里?（200ul是五天后换液还是如"战友整理的关于单克隆抗体制备的帖子"提到的24HR后就加?3.苔酚蓝染色我没有观察到细胞,请问具体的操作是怎么样的?4.PEG准备时所说的1640是什么？(DMEM可以吗?)5.融合时PEG的加入方法有很多种,具体怎么比较好一些?1.肯定不正常，如果所有细胞都死亡了，可能就不是融合的问题了，应该在培养基或血清上找原因，可以做个SP2/0培养实验，看看是否正常。2.融合后的细胞就是用HAT培养基来悬浮，铺板后就进入筛选培养阶段。换液可能因个人操作习惯确有不同，我们一般都是3天后先补加50ul，然后再换液。3.这一步做与不作其实问题不大，我们一般都是不作的。4.PEG一般用基础培养基来稀释，有资料报道用DMEM的，不过偶没做过验证实验。5.我觉得这个很难界定哪一种方法最好，因为这可能因实验室的PEG的分子量、浓度选择不同，在操作中有一定差异，所以需要自己的摸索。一般就是在控制PEG的毒力和起到融合效果之间找到一个平衡点。提供我们的融合方法:50%PEG3000 1ml，匀速滴加1min，边加边旋转，气温低时需在37C水浴，加完后，1min内加10ml基础培养基稀释，其后1-2min中加10ml培养基终止反应，在于37C水浴静置10min后，取出离心。操作过程中注意均匀。
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