p38 MAPK信号通道介导的GLP-1对AGEs诱导内皮细胞损伤的干预机制--《广东药学院》2015年硕士论文
p38 MAPK信号通道介导的GLP-1对AGEs诱导内皮细胞损伤的干预机制
【摘要】：背景:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)可并发多种血管并发症,如糖尿病肾病、动脉粥样硬化、中风、心衰等,而后者是其致残致死的重要原因。内皮细胞功能紊乱是DM并发动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发生的早期信号,因此,保护血管内皮细胞功能对治疗及预防糖尿病血管病变具有重要意义。糖基化终末产物(Advanced glycation endproducts,AGEs)的积累与DM多种血管并发症的发生及发展密切相关。研究表明,AGEs可导致多种细胞因子分泌异常及细胞代谢紊乱,进而引起内皮细胞结构改变和功能异常。糖尿病高糖状态下,AGEs生成明显加速,并在血管壁沉积而难以降解,通过与其受体结合后激活氧化应激,诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成明显增加,破坏内皮细胞功能,导致线粒体功能障碍,并促使其凋亡。因此,如何对抗AGEs的血管损伤效应,已成为众多学者关注的问题。p38细胞丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信号通路为MAPK家族的重要成员,该通路作用的发挥主要是通过磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)实现的。研究显示,p38 MAPK信号通路的激活与血管损伤和器官微循环的病理生理改变有着密切关联。如AGEs通过p38 MAPK信号通路介导了肾脏微血管内皮的损伤及血流屏障的影响;抑制p38 MAPK活化可减轻高糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激水平,使ROS生成量降低;高糖干预人冠状动脉一段时间后,可通过增强NADPH氧化酶活性,使ROS产生增加,而高糖及ROS均可激活p38 MAPK信号通路,从而诱导细胞损伤。高糖及ROS均可激活p38MAPK磷酸化而促进细胞凋亡已得到共识,但其具体机制尚不明确。文献报道,一定浓度的AGEs可通过p38 MAPK信号通路介导,使内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(e NOS)表达下调,NO生成减少,从而促进细胞凋亡。胰高血糖素样肽1(Glucagon like Peptide-1,GLP-1)是由肠道内分泌细胞和脑神经细胞分泌的多肽类激素,不仅可通过促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放等发挥良好的降糖效果,还具有心血管系统保护作用,是治疗T2DM非常有前景的新药。近年研究显示,除抗炎作用外,GLP-1还可通过c AMP/PKA、PI3K/Akt、NADPH、p38 MAPK等信号途径发挥抗氧化损伤作用,从而对内皮细胞发挥有效保护作用。研究表明,在高糖诱导的内皮细胞损伤中,GLP-1或其类似物Exendin-4可激活PI3K/Akt,提高NO水平从而促内皮细胞增殖;而其下游信号通道p38MAPK-e NOS也在GLP-1保护高糖诱导的内皮细胞损伤中发挥重要作用。但目前相关研究仍甚少。由此可见,在DM各种代谢紊乱的环境中,激活氧化应激是AGEs诱导血管内皮细胞损伤的关键病理因素。GLP-1在降糖的同时,可拮抗AGEs诱导的氧化应激而保护血管内皮细胞。然而,其具体保护机制尚不明了。本研究以AGEs诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究模型,探讨p38 MAPK-信号通道在GLP-1干预AGEs诱导内皮细胞损伤中的作用机制,从而为疾病的发生及治疗研究展示广阔的前景。目的:本课题以AGEs诱导的HUVECs损伤为研究模型,通过检测GLP-1对p38MAPK信号通道及其下游e NOS蛋白表达的影响,观察GLP-1或p38 MAPK抑制剂干预对血管内皮细胞ROS生成及细胞凋亡的作用,初步探讨p38 MAPK信号通道在GLP-1干预AGEs诱导血管内皮细胞损伤中的作用机制。方法:1.HUVECs的分离、培养及鉴定根据前期经验获取、分离、培养HUVECs,细胞经v WF抗体免疫荧光染色进行鉴定。取第3-5代细胞用于后续实验。2.体外制备、鉴定AGEs1.6 g牛血清白蛋白(BSA)与3.0 g D-葡萄糖溶于10 m L PBS中,避光孵育12周制备AGEs。荧光分光光度计鉴定AGEs。以同样条件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制备的溶液作为本实验的阴性对照组。3.Western blotting法检测p38 MAPK、e NOS磷酸化作用阴性对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组分别检测p38 MAPK磷酸化蛋白及总p38 MAPK蛋白表达;阴性对照组、AGEs组、AGEs+GLP-1组、AGEs+p38 MAPK抑制剂组、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制剂组分别检测e NOS磷酸化蛋白及总e NOS蛋白表达。p38 MAPK抑制剂预处理细胞1 h后,加入(或不加)GLP-1 100 n M干预30 min,最后加400 ug/m L AGEs作用24 h(本课题前期研究显示,400 ug/m L AGEs作用24 h后,可显著诱导内皮细胞凋亡;GLP-1采用100 nm浓度下,可显著抑制AGEs诱导的细胞凋亡)。阴性对照组采用与AGEs相同浓度的BSA溶液。(以下部分均按该方法操作,不再赘述。)4.流式细胞仪检测GLP-1及p38 MAPK抑制剂对细胞ROS生成水平及细胞凋亡率的影响。实验分6组:阴性对照组、AGEs组、GLP-1组、AGEs+GLP-1组、AGEs+p38MAPK抑制剂组、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制剂组。细胞接种于6孔板,随机进行分组处理,DCFH-DA荧光探针检测细胞ROS含量,Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡率。5.硝酸还原酶法检测e NOS抑制剂使用前后AGEs及AGEs+GLP-1处理组细胞NO生成水平。6.Annexin V/PI双染色法检测e NOS抑制剂使用前后AGEs及AGEs+GLP-1处理组的细胞凋亡率。统计学处理:数据采用SPSS 17.0进行统计分析,数据以均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,两两比较采用LSD法。P0.050为差异有统计学意义。结果:1.GLP-1对AGEs诱导下HUVECs p38 MAPK磷酸化作用的影响方差分析显示,各组间细胞磷酸化p38 MAPK蛋白表达具有显著差异(F=56.989,P=0.000),而总p38 MAPK蛋白表达无变化(F=0.568,P=0.652)。与BSA对照组比较,AGEs可显著活化内皮细胞p38 MAPK蛋白磷酸化(P=0.001),而GLP-1可拮抗该活化作用(P=0.000)。2.p38 MAPK抑制剂(SB203580)对HUVECs e NOS磷酸化作用的影响予以不同处理后,各组间细胞磷酸化e NOS蛋白表达具有显著统计学差异(F=6.645,P=0.007),但总e NOS水平无统计学差异(F=1.677,P=0.231)。与BSA对照相比较,AGEs可显著降低磷酸化e NOS表达水平(P=0.007),GLP-1及SB203580均可拮抗AGEs对磷酸化e NOS的抑制作用(P=0.004)(P=0.011)。3.AGEs诱导下,GLP-1及p38 MAPK抑制剂对HUVECs ROS生成及细胞凋亡的影响与BSA对照组相比,AGEs处理组ROS生成水平及细胞凋亡率显著增高(P=0.000)(P=0.000),GLP-1单独处理并不影响细胞ROS生成量及细胞凋亡率(P=0.170)(P=0.234);而AGEs组加入GLP-1或SB203580后,细胞ROS水平均显著减弱(P=0.000)(P=0.006),细胞凋亡率显著下降(P=0.000)(P=0.000);予以SB203580预处理后,GLP-1对AGEs诱导ROS生成及细胞凋亡的拮抗作用无改变(P=0.828)(P=0.424)。4.AGEs诱导下,GLP-1及e NOS抑制剂(L-NAME)对HUVECs NO生成水平的影响方差分析后多重比较显示,与BSA阴性对照组相比,AGEs可明显降低NO生成水平(P=0.000),而GLP-1单独处理对细胞NO生成的影响无统计学意义(P=0.055);AGEs组加入GLP-1后,细胞NO含量较单纯AGEs处理组显著升高(P=0.000);而在AGEs+GLP-1组予以L-NAME预处理细胞后,细胞NO含量较AGEs+GLP-1组降低(P=0.011)。5.AGEs诱导下,e NOS抑制剂对GLP-1抗细胞凋亡的影响加入GLP-1与AGEs共孵育后,细胞凋亡率较单纯AGEs组显著降低(P=0.000);而在AGEs+GLP-1共孵育组加入L-NAME后,GLP-1的抗凋亡作用显著减弱(P=0.002)。结论:1.AGEs可激活血管内皮细胞p38 MAPK信号通道,而GLP-1可拮抗该作用。2.GLP-1可通过抑制p38 MAPK信号通道的活化,拮抗AGEs诱导的血管内皮细胞氧化应激反应及细胞凋亡。3.GLP-1可通过抑制p38 MAPK信号通道,激活e NOS信号通道,进而拮抗AGEs诱导的内皮细胞NO生成障碍及细胞凋亡。
【学位授予单位】：广东药学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：R587.2
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如何检测线粒体内的ROS
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活性氧检测试剂盒是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。活性氧检测试剂盒。荧光法检测线粒体产生和释放的反应性氧化物（ROS）[10]。羟基自由基的检测（二羟苄胺DHBAs和水杨酸盐Salicylate）[11] ROS was evaluated by the staining of 2’，7’- dichlorofluorescein diacetate（二氯荧光乙酰乙酸盐）.ROS production was detected by nitroblue tetrazolium （NBT，硝基四氮唑蓝）assay。目前，对于细胞线粒体产生的ROS 测定，所发展的方法有（荧光标记后）激光扫描共聚焦显微术（Takahashi et al.，2002）和荧光探剂DCFDA标记后的荧光分光光度法（Esposti ，2002）等，本实验以lucigenin 或luminol 为探剂，用化学发光技术，对从正常大鼠肝细胞及心肌细胞分离的线粒体的METC 电子漏进行了测定
采纳率：83%
我测的是细胞内活性氧我的操作步骤：将对数期细胞接种于6孔板，细胞贴壁后，加入不同浓度的药物，同时设对照组和空白制剂组。作用24小时后，去除细胞培养液，加入DCFH-DA染液，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，在流式细胞仪上检测荧光强度变化。
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&Probes for Reactive Oxygen Species (ROS) 活性氧检测探针专题
Probes for Reactive Oxygen Species (ROS) 活性氧检测探针专题
时间：&&&&
作者：懋康原创&&&&
文章来源：懋康生物&&&&
Probes for Reactive Oxygen Species (ROS)
活性氧检测探针专题
一、&基本介绍
活性氧类物质（Activated oxygen species, AOS），又称反应性氧类物质（Reactive oxygen species, ROS），体内的各种生理和病理过程都能生成。ROS的生理效应通过与大量易氧化的胞内物质反应来发挥，这些物质包括NADH，NADPH，抗坏血酸，组胺，色氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽，蛋白质和核酸。ROS还能氧化胆固醇和不饱和脂肪酸，引起膜脂质氧化。
懋康生物提供一系列探针，能够生成或检测各种活性氧类物质（ROS），包括单线态氧（1O2），超氧阴离子（oO2–），羟基（HOo）和各种过氧化物（ROOR'）和氢过氧化物（ROOH），见表1 -活性氧检测探针和清除剂汇表。
活性氧类型
活性氧检测探针
活性氧清除剂
Hydrogen peroxide
Dihydrorhodamine 123（二氢罗丹明123）
CellROX Orange reagent
Luminol（鲁米诺）
ROSGreen H2O2 probe&
Sodium pyruvate (10 mM)
DMTU&(10 mM)
Hydroxyl radical
CellROX Green reagent
CellROX Deep Red reagent
Mannitol (20–100 mM)
DMSO (0.28 M)
Hypochlorous acid
Dihydrorhodamine 123（二氢罗丹明123）
Luminol（鲁米诺）
Nitric oxide
CellROX Orange reagent
DAF-FM diacetate
Luminol（鲁米诺）
Carboxy-PTIO (100 uM)
Peroxyl radical
过氧化基（包括过氧烷基和氢过氧自由基，当R=H）
Luminol（鲁米诺）
Trolox (10–100 uM)
α-tocopherol (10–100 uM)
Peroxynitrite anion
过氧亚硝基阴离子
CellROX Orange reagent
Coelenterazine（腔肠素）
Dihydrorhodamine 123（二氢罗丹明123）
Luminol（鲁米诺）
Ebselen&(10–100 uM)
uric acid (100 uM)
Singlet oxygen
Oxygen Sensor Green reagent
trans-1-(2'-methoxyvinyl)pyrene
Sodium azide (1–10 mM)
Superoxide anion
超氧阴离子
CellROX Green reagent
CellROX Orange reagent
CellROX Deep Red reagent
Coelenterazine（腔肠素）
Luminol（鲁米诺）
Dihydroethidium (DHE) 二氢乙锭
Mitosox Red Mitochondrial Superoxide
MnTBAP (100 uM)
Tiron&(10 mM)
二、过氧化氢指示剂（Hydrogen Peroxide Probes）
过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）是一种反应氧代谢副产物，用于许多氧化应激相关态的关键调节剂，参与大量生理活动，比如哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变，肥胖症，许多神经衰退疾病和唐氏综合症。也许H2O2过氧化氢最令人兴奋的生理作用在于近期报道，能转化分子氧为过氧化氢的抗体有助于免疫系统的正常识别和攻击。为此，H2O2过氧化氢的检测能够帮助研究者确定氧化应激是如何调控各种胞内信号通路的？
H2DCFDA(DCFH-DA, DCFH)，英文全名2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，中文全名2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，是一种通用的氧化应激指示剂。具细胞膜渗透性，本身无荧光。一旦进入细胞后，被细胞酯酶水解生成2',7'-二氯二氢荧光素并进一步被氧化生成强荧光的2',7'-二氯荧光素（DHF），可用荧光光谱检测（Ex/Em=504/529nm）。H2DCFDA与胞内氧化应激产生的多种活性氧都有反应，包括过氧化氢（H2O2），过氧基（ROOo）和过氧亚硝基阴离子（ONOO-）。H2DCFDA普遍用来监测细胞氧化还原过程。
图1.&H2DCFDA光谱图
ROSGreenTM H2O2 Probe正是克服以上缺陷开发的一款过氧化氢（H2O2）选择性探针。探针本身无荧光，可见光区域内无吸收峰。一旦接触H2O2，瞬间激发荧光增加并伴随可见波长吸收带的生成（Ex/Em= 490/514nm）。因其二元的吸收/发射荧光反应，此探针具有较大的动力学范围。与相似的ROS比如O2–，NO，或OCl-相比，ROSGreenTMH2O2Probe对H2O2呈现出＞100倍（100-fold）的选择性。
产品信息：
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货号 & & & & & & & & &
价格（元）&
100~500T &&
三、羟基自由基指示剂（Hydroxyl Radical&Probes）
细胞膜渗透性的氨基苯基荧光素（APF）和羟苯基荧光素（HPF）是由T. Nagano开发的两种活性氧（Reactive oxygen species, ROS）指示剂，比H2DCFDA（DCFH-DA, DCFH）具更优秀的特异性和稳定性。APF和HPF显示有限的非选择性反应，和相对较高的光诱导氧化抗性。APF和HPF本身无荧光，直到与羟基自由基或过氧亚硝基阴离子反应，还能与次氯酸阴离子反应，产生强绿色荧光（Ex/Em=490/515nm），可用荧光显微镜、高通量成像仪、荧光酶标板或流式细胞仪检测。
图2. APF和HPF的化学结构图
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货号&&&&&&&&&&&&&&&&& &&
名称&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&
规格&&&&&&&&&&&&&
&价格（元）&
MX4804-1MG
Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基荧光素 & &
MX4805-1MG
Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羟苯基荧光素
四、羟基自由基和超氧化物指示剂（Hydroxyl Radical&& Superoxide Probes）
4.1 MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator 线粒体超氧化物指示剂
线粒体超氧化物（Mitochondrial superoxide）是氧化磷酸化的副产物。一条紧密偶联的电子运传递链中约1-3%被消耗的线粒体氧不能完全被还原，这些‘遗漏’的电子能与分子氧快速反应产生超氧阴离子，即线粒体中含量最高的活性氧（ROS）分子。细胞过氧化物生成量的增加在心血管疾病中得到阐释，这些疾病包括高血压、动脉粥样硬化和糖尿病相关的血管损伤，以及神经退化疾病如帕金森疾病，阿尔茨海默病和肌萎缩性[脊髓]侧索硬化（ALS）。
MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针（MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator）是二氢乙啶（dihydroethidum，DHE）的一种阳离子衍生物，特别设计高度特异性检测活细胞线粒体超氧化物。
MitoSOX Red是一种特异性靶向活细胞线粒体的新型荧光探针，具细胞膜渗透性，且能快速和选择性结合线粒体。一旦进入线粒体，被超氧化物氧化，与核酸结合后产生很强的红色荧光。MitoSOX Red能够立即被超氧化物，并不是其他ROS-或RNS（活性氮）生成系统氧化。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase
，SOD）能够预防MitoSOX Red被氧化。
MitoSOX Red可用于在对活细胞线粒体释放的超氧化物的直接检测中区别纯化线粒体的人为误差。另外，MitoSOX Red是一种有价值的工具，用来筛选多种疾病中调节氧化应激的药物。
MitoSOX Red订购信息：
货号&&&&&&&&&
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报价（元）&
小包装供货
是（50 ug）
以上所有产品均为Life（Invitrogen）原装正品，原始包装为10x50 ug（10支50ug单个包装构成）。我司对M36008进行拆开销售，特惠价为650元/支，单支50ug，现货销售，欢迎订购。
4.2 CellROX Oxidative Stress Reagents 氧化应激试剂
氧化应激是由于反应性活性氧物质（ROS）产量和细胞清除ROS的不平衡导致的。ROS与核酸，蛋白质和脂质反应导致细胞和组织损伤，使用选择性或广泛性探针来测定。
CellROX试剂是用来检测细胞广泛存在氧化应激的荧光探针，结果可用传统荧光显微镜、高内涵筛选、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。有些能用福尔马林固定从而可与包括抗体在内的其他荧光试剂轻松进行多重标记【见表2- CellROX试剂的选择指导】。
CellROX Deep Red Reagent
CellROX Orange Reagent
CellROX Green Reagent
CellROX探针本身是还原态，无荧光，一旦氧化后发亮绿色、橘色或深红色荧光。CellROX具细胞膜渗透性，能轻松加载进入活细胞。
Common filter set
Ex/Em (nm)
Live cell–compatible
Labeling in complete medium
Formaldehyde-fixable
Detergent-resistant
Photostability
Signal-to-noise ratio
CellROX实例图片：
图3. Angiotensin II Induced Oxidative Stress Measured with CellROX(TM) Green Reagent in Human Aortic Smooth Muscle Cells.
Angiotensin –II induced oxidative stress in human smooth muscle cells (HASM) measured with CellROX(TM) Orange Reagent. HASM cells were plated on glass bottom 35 mm MatTek dishes. The cells were treated with or without 500 nM angiotensin-II for 4 hr at 37° C. The cells were then stained with 5 uM CellROX(TM) Green Reagent and Hoechst 33342 by adding the probes to complete media and incubating at 37° C for 30 min. The cells were washed with PBS and imaged on a Zeiss Axiovert inverted microscope using a 40x objective. Angiotensin-II treatment leads to increased oxidative stress.
CellROX订购信息：
货号&&&&&&& &&&&&
产品名称&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
规格&&&&&&&&&&&&&&&
报价（元）&&&&&&
小包装供货&&&&&&
CellROX Deep Red Reagent 深红色
否（50 ul）
CellROX Orange Reagent 橙色
否（50 ul）
CellROX Green Reagent 绿色
是（50 ul）
以上所有产品均为Life（Invitrogen）原装正品，原始包装为10x50 ug（10支50ug单个包装构成）。我司对C10444进行拆开销售，特惠价为1845元/支，单支50ul，现货销售，欢迎订购。
五、一氧化氮指示剂（Nitric acid NO Probes）
一氧化氮（NO）自由基是一种重要的细胞信号分子，参与许多生理和病理过程。作为一种重要的生物调节剂，因此是神经科学、生理学和免疫学的基本组成成分。是一种强效的血管舒张剂，只有几秒钟的短暂半衰期。低水平的NO生成能保护器官，比如缺氧损伤的肝脏。
DAF-FM DA是一种细胞膜渗透性的一氧化氮（NO）荧光探针，Ex/Em=495/515nm。DAF-FM DA主动扩散穿透细胞膜，一旦进入细胞，胞内酯酶使其去乙酰化生成DAF-FM。DAF-FM本身荧光很弱，其荧光量子产率~0.005，但与NO反应后荧光增强约160倍，光量子达到~0.81。与最早的NO探针-DAF-2相比，DAF-FM具有以下几个优势：1）DAF-FM与NO形成的加合物的光谱不依赖pH（＞5.5）；2）DAF-FM与NO形成的加合物的光稳定性明显强于DAF-2/NO加合物；3）DAF-FM的NO检测下限~3nM，比DAF-2灵敏度高（~5nM）。
图4. DAF-FM光谱图
产品信息：
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货号&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
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规格 & & & & &&
价格（元）&
MX4702-1MG
DAF-FM DA一氧化氮（NO）荧光探针
DAF-FM DA (5mM in DMSO) 一氧化氮（NO）荧光探针 &
DAF-2 DA一氧化氮（NO）荧光探针
六、其他指示剂
品牌&&&&&&&&
货号&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
名称&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
规格&&&&&&&&&&
价格（元）&
MX4455-1MG
Dihydrorhodamine 123 (DHR 123) 二氢罗丹明123
DAF-2 DA 一氧化氮（NO）荧光探针
Coelenterazine Native 天然腔肠素
七、 注意事项&
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
&— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。&本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。