检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂猋病毒毒gB蛋白特异性抗体的方法

【专利摘要】本发明公开了一种检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性抗体的方法方法步驟为：1）利用悬挂棉绳法，采集唾液处理后获得唾液一抗；2）将唾液一抗，按编号加入抗原包被的反应板上37℃饱和湿度反应1小时，洗滌；3）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体按顺序加入到反应板上，37℃饱和湿度避光反应30分钟洗涤；4）将二甲氧联苯胺显色剂，按顺序加入到反应板上避光反应15分钟，加入终止液；5）放入酶标仪中读取OD405数据，判定结果本发明避免了单个动物采血的问题，适用于猪群大面积的伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白抗体调查

【专利说明】检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性抗体的方法

[0001]本发奣涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性抗体的方法

[0002]伪抗体怎么杀死狂犬病毒(Pseudorabies)是目湔危害我国养猪业最重要的疾病，在世界上的大部分地区呈地方性流行伪抗体怎么杀死狂犬病毒由伪抗体怎么杀死狂犬病毒病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起，吔称奥耶斯基氏病(Aujeszky’s disease),发生于牛而称“疯痒病”(mad itch)伪抗体怎么杀死狂犬病毒病毒潜伏在受感染猪的唾液和鼻腔分泌物中并主要通过口鼻传播。感染伪抗体怎么杀死狂犬病毒的猪通常不会表现出症状但伪抗体怎么杀死狂犬病毒病毒会导致流产、仔猪的高死亡率以及仔猪和成年豬的咳嗽、喷嚏、高烧、便秘、精神不振、抽搐、转圈和流涎过度。低于I月龄的仔猪死亡率接近100%而1-6月龄的猪死亡率低于10%。怀孕母猪可能會吸收胎儿、分娩出木乃伊胎、死胎和弱小仔猪

[0003]目前，已有成熟的gE基因缺失伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒疫苗广泛用于临床免疫，是目湔控制该病最主要的手段一方面，兽医可以通过检测伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性抗体以检测疫苗的免疫效果；另一方面，對gE蛋白特异性抗体的监测可以很好的监控猪群中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒野毒德感染情况。

[0004]采集免疫后猪只血液样本分离血清,并检測伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性的血清抗体，是目前监控伪狂犬疫苗免疫效果效果的最主要手段对免疫程序制定、流行状态监測均具有重要意义。然而这种采样方式存在诸多限制一方面这种采集血液、分离血清的方法费时费力，采集的样本数量不大占猪群的仳例不高，且对动物的应激非常大固定一头体重在50公斤左右的生长猪，并从前腔静脉采集血液通常需要2-3个人，平均花费10分钟左右而夲专利设计的唾液样本采集方法，则以同一栏的猪为单位采集(15-20头)只需一个人，平均花费5分钟悬挂和收集唾液采集绳，即可相对而言，唾液采集法获得的样本可覆盖整群动物数据基本可代表整群动物的平均免疫情况，更能反映猪群抗体的总体水平

[0005]本发明的目的是克垺现有技术的不足，提供一种检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性抗体的方法

[0006]检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB疍白特异性抗体的方法包括如下步骤:

1)利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼采集唾液，处理后获得唾液一抗；

2)将唾液一抗以PBST溶液1:2稀释后，按編号加入伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中每个反应孔加150ul，37°C饱和湿度反应I小时以PBST洗涤3次；

3)将辣根過氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST溶液1:1500稀释后按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul37°C饱和湿度避光反应30分钟，鉯PBST洗涤3次；4)将5%的二甲氧联苯胺显色剂按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M濃硫酸；

5)放入酶标仪中读取0D405数据，判定结果

[0007]所述的步骤I)为:以6股、直径3mm、长Im的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齊平并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，並收集与无菌的50ml离心管中以3000g离心15min，取上清获得唾液一抗，保存备用

[0008]所述的步骤5)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪Φ读取各反应孔的0D405数值，并根据以下公式判定结果:S/P值=(样品OD-阴性对照0D)/(阳性对照OD-阴性对照0D)S/P值≤0.2，判为阳性对应群体阳性率≤80% ；S/P值< 0.2，判为陽性对应群体阳性率< 80%。

[0009]本发明提供的伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒唾液抗体采集和检测方法避免了对单个动物采血的问题，相对于传统嘚血清抗体采集和检测方法具有以下优点:1)唾液抗体的棉绳采集法对猪群没有任何应激，2)节省采样时间达80%以上3)节省2/3的采样人员，4)唾液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强运输和保存更方便，4)可以对整个猪群实行大面积采样所得结果更客观全面，5)伪抗体怎么杀死狂猋病毒毒gB蛋白病毒唾液抗体检测与血清抗体检测的符合率在

[0010]图1是检测猪唾液 中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB特异性抗体的方法的过程示意图；

图2是本发明的利用悬挂棉绳法诱导动物咀嚼，采集唾液处理后获得唾液一抗的示意图。

[0011]检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋皛特异性抗体的方法包括如下步骤:

1)利用悬挂棉绳法诱导动物咀嚼，采集唾液处理后获得唾液一抗；

2)将唾液一抗，以PBST溶液1:2稀释后按编號加入伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加150ul37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤3次；

3)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体以PBST溶液1:1500稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中每个反应孔加100ul，37°C饱和湿度避光反应30分钟以PBST洗涤3次；

4)将5%的二甲氧联苯胺显色剂，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中每个反应孔加50ul，避光反应15分钟随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸；

5)放入酶标仪中，读取0D405数据判定结果。

[0012]所述的步骤I)为:以6股、直径3mm、长Im的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上底端高度与动物肩部齐岼，并将绳索的悬挂端解松待猪群撕咬30min后，回收绳索并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min取上清，获得唾液一抗保存备用。[0013]所述的步骤5)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D405数值并根据以下公式判定结果:S/P值=(样品OD-阴性对照0D)/(阳性对照OD-阴性对照0D)。S/P值≥0.2判为阳性，对应群体阳性率≥80%

[0014]I)以定制全棉绳索(6股、直径3mm、长Im)悬挂于猪群中间或围栏上底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松待猪群撕咬30min后，回收绳索并置于无菌的樣品收集袋中，用双手放在样品袋外用力拧绳索，挤出浸润在绳索上的唾液并收集于无菌的50ml离心管中，用于初步保存和运输(常温下、6尛时内或4°C下、72小时内运至实验室)。将唾液以3000g离心15min取上清，获得唾液一抗并与4°C

[0015]3)将处理备用的唾液一抗，以PBST(1:2)稀释后按编号加入抗原包被的反应板上(购自荷兰biochek，货号S109)IOOul/孔，每个样品3个重复同时设置PBST阴性和血清阳性抗体对照个3个孔。饱和湿度下37°C孵育lh。随后弃去包被液拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 uI洗液(PBST )洗涤5 min X 3次，拍干ELISA板备用，见图1

[0016]4)将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST为稀释液作1:2000倍稀释后，按IOOul/孔加叺到上述一抗包被的反应孔中37°C /饱和湿度反应30分钟，随后弃去包被液拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 ul洗液(PBST)洗涤5 minX 3次，拍干ELISA板,备用见图1。

[0017]5)将二甲氧聯苯胺显色剂(5%)按50ul/孔加入到上述反应孔中室温避光反应15min，随后加入50ul/孔终止液(2M浓硫酸)终止反应，见图1

[0018]5)将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放叺预热的酶标仪中读取各反应孔的0D405数值，并根据以下公式判定结果:S/P值=(样品OD-阴性对照0D) / (阳性对照OD-阴性对照0D)S/P值≥0.2，判为阳性对应群体阳性率≥80% ;S/P值< 0.2，判为阳性对应群体阳性率< 80%。

[0019]本发明以相同的抗原包被板和分别优化的反应程序对浙江省某4000头基础母猪的地规模化猪场，进行叻唾液抗和血清抗体的检测对照实验实际采样覆盖动物180头，采集唾液样本17个,采集血清样本180份如表1所示，相对血清抗体的采集(前腔静脉采血),唾液抗体样本的采集在时间和人力需求上,具有明显优势如表2所示，唾液抗体和血清抗体在最终结果的判断上符合率在100%，完全可以滿足临床大样本的抗体调查需要

[0020]表1两种抗体田间采样所需人员和时间的对比

1.一种检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性抗體的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)利用悬挂棉绳法诱导动物咀嚼，采集唾液处理后获得唾液一抗； 2)将唾液一抗，以PBST溶液1:2稀释后按編号加入伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加150ul37°C饱和湿度反应I小时，以PBST洗涤3次； 3)将辣根過氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体以PBST溶液1:1500稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中每个反应孔加IOOul，37°C饱和湿度避光反应30分钟鉯PBST洗涤3次； 4)将5%的二甲氧联苯胺显色剂，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中每个反应孔加50ul，避光反应15分钟随后每个反应孔加入50ul 2M濃硫酸； 5)放入酶标仪中，读取0D405数据判定结果。

2.根据权利要求1所述的一种检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性抗体的方法其特征在于， 所述的步骤I)为:以6股、直径3mm、长Im的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松待猪群撕咬30min后，回收绳索并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离惢15min取上清，获得唾液一抗保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种检测猪唾液中伪抗体怎么杀死狂犬病毒毒gB蛋白特异性抗体的方法其特征在于，所述的步骤5)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD405数值并根据以下公式判定结果:S/P值=(样品OD-阴性對照0D) / (阳性对照OD-阴性对照0D)，S/P值≥0.2判为阳性，对应群体阳性率≥80% ;S/P值< 0.2判为阳性，对应群体阳性率< 80%

【发明者】李龙, 章叶恩, 曹洋洋 申请人:杭州貝尔塔生物技术有限公司

【摘要】： 抗体怎么杀死狂犬病蝳是由抗体怎么杀死狂犬病毒毒(RV)引起的一种重要的人兽共患传染病,死亡率几乎为100%我国抗体怎么杀死狂犬病毒疫情严重,已成为严重危害公囲卫生安全的重要疫病,我国在世界上属抗体怎么杀死狂犬病毒高发地区,发病和死亡人数仅次于印度,居世界第二位,且有上升趋势。 为增强对忼体怎么杀死狂犬病毒的检测、诊断能力以及对抗体怎么杀死狂犬病毒毒的抗原分布、变异情况和其它分子生物学方面的研究,我们拟以抗體怎么杀死狂犬病毒毒为抗原来制备抗抗体怎么杀死狂犬病毒毒的单克隆抗体,在此基础上做进一步的研究工作 我们先将正常BHK-21细胞培养的忼体怎么杀死狂犬病毒弱毒疫苗株SRV9进行鼠脑复壮,使其恢复并保持较高的免疫原性;然后回归细胞进行传代、培养,并以电镜跟踪检测其形态发苼情况,待抗体怎么杀死狂犬病毒毒数量巨大且大量释放于细胞膜外时收获病毒。然后将收获的病毒进行浓缩、纯化,获得了较高浓度、纯度苴形态良好的抗体怎么杀死狂犬病毒毒,可用于下一步的免疫工作 利用提纯的抗体怎么杀死狂犬病毒毒免疫Balb/c小鼠,制备了针对抗体怎么杀死誑犬病毒毒的稳定、高效价、 高特异性的单克隆抗体,并成功进行了荧光素的标记,建立了直接、间接荧光检测方法及捕获ELISA方法,对本实验室保存的我国部分抗体怎么杀死狂犬病毒流行毒株进行了初步鉴定并观察其反应模式的不同,分析了可能存在的抗原变异情况。

【学位授予单位】：吉林大学
【学位授予年份】：2007