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DNA甲基化异常与肿瘤
DNA甲基化是真核生物基因表达调控的一种方式.在哺乳动物,DNA甲基化发生在二核苷酸胞嘧啶(CpG)的第5位碳原子上,即5-甲基胞嘧啶(5-mc)[1].人类的CpG以两种形式存在,一种是分散于DNA中,另一种是CpG结构高度聚集的CpG岛.在正常组织里,70%～90%的散在的CpG是被甲基修饰的,而CpG岛则是非甲基化的[2].近年来的研究表明,DNA甲基化异常参与了肿瘤的发生、发展.
DNA甲基化是真核生物基因表达调控的一种方式.在哺乳动物,DNA甲基化发生在二核苷酸胞嘧啶(CpG)的第5位碳原子上,即5-甲基胞嘧啶(5-mc)[1].人类的CpG以两种形式存在,一种是分散于DNA中,另一种是CpG结构高度聚集的CpG岛.在正常组织里,70%～90%的散在的CpG是被甲基修饰的,而CpG岛则是非甲基化的[2].近年来的研究表明,DNA甲...&&
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基因甲基化检测、甲基化PCR 的原理是什么
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一种全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技术DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基.CG二核苷酸是最主要的甲基化位点,它在基因组中呈不均匀分布,存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域,在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％.一般说来,DNA的甲基化会抑制基因的表达.DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用.CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一,而在基因组的某些区段,CpG保持或高于正常概率,这些区段被称作CpG岛.CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域,约有60％以上基因的启动子含有CpG岛.CpG甲基化的研究在肿瘤的研究中有着非常主要的地位.通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达,从而引起相应基因沉默,去甲基化又可恢复其表达.DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达,在肿瘤发生时,肿瘤细胞全基因组低甲基化是一个重要特征.肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60% ,同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等.但是目前研究手段的局限,限制了DNA甲基化的广泛研究.近年来,研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法,但由于甲基化多态性区域存在的密度很高,所以对于延伸反应其引物的位置很难设计.Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术,能够快速地检测甲基化的频率,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测,为甲基化研究提供了新的途径.从原理上来看,Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法,它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应,促使荧光素发光并进行检测.这项技术曾经被用作单核苷酸多态性（SNP）的基因型和单倍型的检测,以及细菌和病毒的鉴定和分型研究.这项技术的一个主要特点是在Pyrogarm™软件上显示的峰值高度来自于序列分析的原始数据,通过峰值的高度可以精确的检测混合DNA模板中等位基因的频率.目前甲基化研究方面,很多甲基化定量分析的报道采用亚硫酸氢盐处理甲基化样本,并用混合的PCR产物 作为校正.其主要原理是：亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而在适当的实验条件下甲基化的胞嘧啶保持不变.因而,用它处理样本后,再进行PCR扩增,甲基化的位点可以被当作一个C/T的SNP来处理,它的基因频率为0－100％.在此,我们给大家介绍一个研究人员使用Pyrosequencing技术分析并精确定量DNA甲基化水平的例子.研究者在一个Pyrosequencing反应中同时检测了6个甲基化位点.这种方法同样可以用于石蜡包埋的组织,并且具有较高的重复性和精确性.实验选择谷胱甘肽-S-转移酶π（GSTP1）转录启动位点的CpG岛进行检测.这些位点在正常前列腺组织中是非甲基化的,而在肿瘤样本中高甲基化.通过PCR扩增一个包含17个甲基化多态位点140bp的片段,并用4个测序引物研究其中15个位点（Table 1）.使用在线的SNP测序引物设计软件（Pyrosequencing AB）设计测序引物,其中一些甲基化多态性位点用最可能的碱基所代替,以减少计算的数量.再通过人工检测测序引物可能存在的错配.此外,同时在PSQ 96MA DNA分析仪上运行空白对照,扣除由测序引物、生物素标记的引物或是模板引起的背景.PCR引物设计完全与模板相匹配,不覆盖任何甲基化多态性区域.使用10ng亚硫酸氢盐转化的DNA样本或是10 fmol纯化的PCR产物,10 pmol 正向（5’-GTGATTTAGTATTGG-3’）和反向（5’-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3’）引物扩增GSTP1转录启动位点的基因片段,扩增片段长度为144bp.反应体系为60 mM Tris-SO4,pH 8.9,18 mM (NH4)2SO4,1 mM MgSO4,200 μM dNTPs,以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶,终体积为50μL.PCR循环设置：首先在95℃下变性4分钟,然后在95℃ 30S,50℃ 45S以及72℃ 20S条件下重复50个循环,最后一步延伸步骤在72℃下4分钟,中止反应.PCR反应在Eppendorf的Mastercycler 96 哺乳动物基因组中,DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化.DNA甲基化是一种基因外修饰,不改变DNA的一级结构; 他在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用.全基因组低甲基化,维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象.DNA高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制.
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甲基化基因检测与肿瘤早期发现-课件（PPT-精）肿瘤,检测,基因,PPT,甲基化,早期发现,甲基化检测,后基因,化检测,和癌症
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3秒自动关闭窗口3月31日，由NGS创新开发者协会主办，基云惠康、华点云、贝壳社、基因慧等联合承办的2017年第四届NGS创新开发者大会在杭州梦想小镇举行，大会旨在为基因测序技术开发者提供技术方案、成功案例的分享平台和与技术大咖的交流平台。作为国内最具影响力的基因测序领域行业会议，国内外基因测序领域的知名专家学者、优秀创业者、新颖开发者，以及关注基因测序技术创新发展的前沿媒体、顶尖投资人和典型用户代表，共计400余人汇聚一堂，分享行业前沿视点，解读检测技术发展之策。
上海鹍远基因CTO刘蕊博士为大家带来了关于基于DNA甲基化的高灵敏度肿瘤液体活检的相关内容的分享。
2009年高远教授与张鹍教授合作，共同开发了首个大规模DNA甲基化靶向测序技术，相关研究成果发表在《Nature Biotechnology》期刊，并入选为过去5年内最重要的五篇文章之一。而随着DNA甲基化靶向测序技术的研发和优化甲基化检测技术不断的发展，已经出现了Whole-genome bisulphite sequencinq、Restriction enzyme-enriched sequencing techniques、Affinity-enrichment-based sequencing techniques、DNA methylation arrays、Locus-specific DNA methylation analysis等技术。而欧洲 BluePrint就曾做过一次甲基化检测技术的对比，就覆盖度和量化两个参数评估，刘博主要讲解了RainDance，Infinium和BSPP三个方法。
肿瘤致病机制包括体细胞遗传和表观遗传异常，二者相辅相成。而由于肿瘤的复杂性，很多疑难肿瘤很难被溯源和早其诊断。而DNA 甲基化检测技术发展至今，已经可以基于肿瘤组织的甲基化检测用于肿瘤分型，鉴别诊断，预 后，以及用药指导，甲基化异常还可以改变药物代谢基因活力，影响药物敏感度以 及用药剂量。
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