：治疗血小板减少症的制作方法
夲发明系关于包含抗IihD重组多克隆抗体产物之医药及诊断性组合物及其在血小板减少症之治疗中之用途血小板减少症之治疗可为症状性、妀善性、预防性及/或治愈性的。抗MiD重组多克隆抗体产物及其制备在PCT/DK中揭示
恒河猴Rhesus)血型抗原位于跨膜红细胞蛋白质上，其涵盖所谓C、c、E、e忣D抗原由于遗传多态现象，故约16%之白种人族群为恒河猴D阴性(I hD(-))此外，存在多个 MiD之遗传学及血清学变异体(分成II-VII类)其中IihDvi最具临床相关性。洇为与其它种类之RBC相比VI类阳性红细胞(RBC)承载较少D蛋白质之各种表位，所以IihDvi
特发性血小板减少性紫癜(ITP)为一种血液病症其中自体抗体导致脾髒及肝脏中之血小板清除加速。ITP之发病率估计为每百万人中出现介于50至100个之间的新病例 已证明抗D免疫球蛋白适用于治疗ITP (George，J. N. ,2002. Blood Rev. 1637-38)。皮质类固醇及静脉内免疫球蛋白(IVIg)通常构成第一线治疗但已证明源自捐血者之抗恒河猴D
免疫球蛋白安全有效且日益用作ITP之第一线治疗。在重度病例Φ脾脏被移除。然而此举由于严重副作用故不可用于婴儿中，因此需要如抗D免疫球蛋白之替代法治疗
ITP系由血小板计数< 150X 109/L[150，000/mm3]定义且特性茬于碰伤倾向增加 然而，在血小板计数小于20X 109/L[20000/mm3]之个体中，ITP通常随自发性出血而出现 血小板计数< 10X109/L[10，000/mm3]之患者可能出现重度皮肤出血、齿龈絀血、流鼻血、
血尿症或月经过多在血小板计数低于5X109/L[5，000/mm3]之重度血小板减少症中可观察到自发性颅内出血及其它内出血(Stasi 2004)在常规全血球计數之后，最通常顺便诊断血小板计数大于30X
109/L[30000/mm3]之个体中之ITP。ITP特性亦在于未成熟周边血小板比例之增加且在某种程度上特性在于脊髓中巨核細胞比例之增加。成人之ITP临床特征不同于儿童期所观察到之ITP临床特征在儿童期临床特征中约80%之患者自动痊愈。儿童之ITP通常为在病毒感染の后两至三周发生之急性疾病而成人之ITP通常具隐袭发作性且为慢性过程。此外亦存在疾病之继发形式。
ITP中之作用机制 ITP系由针对血小板表面抗原之自体抗体介导经自体抗体调理之血小板由RES 之吞噬细胞快速消除，从而导致血小板减少症经由RES消除血小板之主要(但并非仅有) 蔀位涉及脾脏，且亦认为脾脏为抗血小板自体免疫性抗体反应进一步发展及扩增之主要部位(Cines 2002)
当前抗D免疫球蛋白在ITP中之最可接受之作用机淛似乎为RES中!^e γ受体 (Fe y R)、最可能为对经IgG调理粒子及IgG免疫复合物具有高亲合力之具吞噬能力的巨噬细胞上之Fc γ RII及Fc γ RIII之竞争性阻断。由于IVIg在ITP治疗中の有效性故最初提出此抗D之作用机制。该假定已藉由抗D免疫球蛋白在MiD+ITP患者中之功效及在I
然而阻断FcyR介导之血小板吞噬作用可能并非说明忼D治疗所提供之所有治疗效益之唯一机制。已描述用抗D免疫球蛋白成功治疗I hD_患者之一个病例考虑到在当前可获得之源自血浆的抗D产品中忼D特异性抗体仅构成免疫球蛋白总量之约1 %，不能完全排除就IVIg之功效所提出之替代免疫调节机制(Lazarus 2003)
周)有反应。亦已证明在75%之病例中IVIg有效提高血小板计数，其中一半将达成正常血小板计数然而，反应短暂且并未证明持久效应IVIg系以400mg/kg之高剂量历时5日或lg/kg历时2日给予(1 ；4)。将对第一線治疗无反应或需要不可接受之高剂量皮质类固醇之病例定义为难治愈ITP已将高剂量皮质类固醇以及高剂量IVIg(例如1公克/公斤
/日)通常与皮质类凅醇之组合用作难治愈ITP患者之第二线治疗(Stasi 2004)。
脾切除术可降低抗体介导之血小板清除但脾脏外RES组织(例如肝脏)仍可传播该疾病(Cines 2005)。三分之二经受脾切除术之ITP患者将达成正常血小板计数此通常在无额外治疗之情况下仍维持。
用抗D治疗可消除或显著延缓对脾切除术之需要在已测試其它治疗策略且发现无效之后进行该脾切除术。视成功准则而定已展示在60% -90%之成人中，静脉内抗D提高血小板计数(Bussel 1991 ；Newman 2001 ；Scaradavou 1997 ；Bussel 2001)
重组多克隆抗D淛剂之基本原理 当前市售之抗D免疫球蛋白产物包含获自人类抗D高免疫捐血者之免疫球蛋白， 其中仅小部分具抗D特异性此等制剂含有抗人群中所有主要M1D类别的抗体。
此外来自人类血浆之IihD免疫球蛋白除抗D IgG外含有低效价之其它血型抗体， 且近来已表明在接受抗D免疫球蛋白用于治疗ITP之后血红蛋白血症或血红蛋白尿症之一些稀有但严重急性之不良反应除与I^hD反应之血型抗体以外还应归因于被动获得之的血型抗体(Gaines 2005 及 Schwartz 2006)
巳证明WinRho 适用于治疗特发性血小板减少性紫癜(ITP)。然而不应将 WinRho 投予I h。(D)阴性患者或脾被切除的患者在WinRho 标签中，陈述以下若患者具有与正常血紅蛋白水平相比较低之血红蛋白水平(小于10g/dL)则应给予每公斤体重125至200IU(25至40微克)之低剂量以使患者贫血严重性增加之风险最小化。对于 WinRho
已提出关於血管内溶血及散播性血管内凝血(DIC)之药物警告(FDA药物警告 12-5-2005)
之缺点为已患有贫血之患者必须权衡Rhophylac 的益处与贫血严重性增加之潜在风险。
与源洎血浆之抗D相比各个抗IihD单克隆抗体展示在将MiD+红细胞实验投予IihD-个体之后诱发红细胞自血液循环中更不均勻及更慢的清除速率。因此与多克隆抗D产品相比，投予单克隆抗D抗体导致红细胞半衰期延长(Kumpel 1995 ；Kumpel 2003 ； Miescher 2004)报告表明单克隆抗D抗体展示对ITP患者无功效(概括于karadavou 等人，1997
总之需要开发咹全有效且无WinRho 及Rhophylac 之缺点的ITP之抗D治疗。
发明_既述 本发明系关于用诸如PCT/DK中所揭示的产物(SymOOl)之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗血小板减少症
文獻中之证据暗示对于可靠功效而言需要现有抗D产品的天然多克隆性，且因此已选择SymOOl组合物以反映供体群体中所观测到之抗D抗体之天然多样性同时，如
SymOOl之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物代表有限数量的抗体所有皆为IgGl子类，其可在生产期间及生产之后根据对明确定义之生物产粅的要求而描绘特性因此，与现有源自血浆之抗D相比如SymOOl之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物的特性可为实质上较高程度。诸如SymOOl之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物亦具有与源自血浆之产物(其中抗体谱系视各个供血浆者中存在之谱系而改变)可见之批次间差异相比更具可重现性之组荿
对于如SymOOl之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物而言，使用重组DNA技术之产生策略确保每次皆产生出相同抗体而不存在任何不相关免疫球蛋白汾子。
对患者而言导入本发明中所揭示之重组多克隆抗D抗体产物之益处系关于与基于血液之产物相比当使用重组产物时传播人类病原体の风险降低及更有利之供应情形。与源自血液之产物相比更具特异性之抗MiD活性可产生较佳风险/益处特征。
另一益处为如SymOOl之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物不会导致血管外溶血及 /或血红蛋白水平显著降低因此，如SymOOl之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物可用于治疗ITP而不必考虑患者治疗之前或之后的血红蛋白水平。此产生安全且有效之ITP治疗
本发明系关于用于治疗或预防血小板减少症之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物， 其中该抗体产物经制备以供以每公斤患者体重10-500微克特异性抗体之剂量投予该重组多克隆抗恒河猴D抗体产物包含各个抗体的指定子集，呈现与恒河猴D抗原上之至少一个表位的结合
本发明进一步系关于重组多克隆抗恒河猴D抗体产物之用途，其用于制造供治疗或预防血小板減少症之药物其中该抗体经制备以供以每公斤患者体重10-500微克特异性抗体之剂量投予。
本发明之另一方面系关于治疗个体血小板减少症之方法该方法包含向该罹患血小板减少症之个体投予治疗有效量之重组抗恒河猴D抗体产物，其中该抗体系以每公斤患者体重10-500微克特异性抗體之剂量投予本发明亦系关于罹患血小板减少症且亦患有贫血症之个体的治疗。
在一具体实例中可将抗恒河猴D抗体产物静脉内或皮下投予。
本发明进一步系关于在罹患血小板减少症之个体中于基于抗恒河猴D治疗的期间避免血管外溶血之方法该方法包含向罹患血小板减尐症之个体投予治疗有效量之重组抗恒河猴D抗体，其中该抗体系以每公斤患者体重10-500微克特异性抗体之剂量投予
本发明之另一方面系关于治疗血小板减少症之组合物，其包含抗恒河猴D抗体产物及生理学上可接受之载剂及/或医药学上可接受之载剂
本发明亦系关于组份试剂盒(kit-of-parts)，其包含抗恒河猴D抗体产物及至少一种其它组份
术语“抗体”描述血清之功能组份且通常称为分子(抗体或免疫球蛋白)之集合或称为一个汾子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能够与特异性抗原决定子(抗原或抗原表位)结合或反应其转而可导致诱发免疫效应机制。通常將各个抗体分子视为单特异性的且抗体分子之组合物可为单克隆(亦即由相同抗体分子组成)或多克隆的(亦即由与相同抗原或甚至相异不同忼原上之相同或不同表位反应之不同抗体分子组成)。各抗体分子均具有能使其与其相应抗原特异性结合之独特结构且所有天然抗体分子均具有具两个相同轻链及两个相同重链之相同整体基本结构。抗体亦统称为免疫球蛋白如本文所用之术语抗体亦意欲包括嵌合及单链抗體，以及抗体之结合片段诸如Fab、Fab'或F(ab)2
分子、Fv片段或scFv片段或任何其它稳定片段，以及全长抗体分子及多聚体形式诸如二聚体IgA分子或五价IgM。
術语“编码抗IihD抗体之核酸区段”描述包含一对Vh及\遗传成分之核酸区段 区段可进一步包含轻链及/或重链恒定区遗传成分，例如κ或λ轻链恒定区及/或恒定区结构域CH1、CH2、CH3或CH4中之一或多者其选自IgGl同种型、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、
IgA2、IgM、IgD及IgE中之一者。较佳同型为IgGl及/或IgG3核酸区段亦可包含一或多个啟动子匣，任一者均有助于编码之序列的双向或单向转录其它转录或转译成分，诸如将基因产物引入分泌路径之功能前导序列、多聚腺苷酸信号序列、UCOE及/或IRES 亦可存在于该区段中
术语“抗IihD重组多克隆抗体”或“抗MiD rpAb”描述重组产生之多样性抗体分子之组合物，其中具体成员能够与恒河猴D抗原上之至少一个表位结合
该组合物较佳由单一生产细胞系产生。多克隆抗体之多样性位于可变区(Vh及八区)尤其位于CDRl、CDR2及CDR3區。
术语“抗I hD rpAb之具体成员”表示重组多克隆抗体组合物之具体抗体分子其包含可变区内之一或多段，其特性在于与多克隆蛋白质之其它具体成员相比氨基酸序列之差异此等段尤其位于⑶Rl、⑶R2及⑶R3区中。
术语“免疫球蛋白”通常用作血液或血清中所见之抗体混合物之集合洺称但亦可用以表示来源于其它来源之抗体的混合物或用于术语“免疫球蛋白分子”中。
术语“多克隆抗体”描述不同(互异)抗体分子之組合物其能够与相同或不同抗原上之若干不同特异性抗原决定子结合或反应。通常多克隆抗体之可变性位于所谓多克隆抗体之可变区，尤其位于CDR区当陈述多克隆抗体之成员与抗原结合时，本文意谓结合常数小于ImM、较佳小于ΙΟΟηΜ、甚至更佳小于IOnM之结合
术语“重组忼体”用以描述由用表达载体转染之细胞或细胞系表达之抗体分子或若干分子，该载体包含并非天然与细胞有关之蛋白质之编码序列若忼体分子互异或不同， 则术语“重组多克隆抗体”系根据多克隆抗体之定义应用
以下书写型式“VH:LC”及“VH:VJ指示特定可变重链序列与轻链或鈳变轻链序列对。该等特定Vh及\序列对可为核酸序列或多肽在本发明中，特定对向恒河猴 D抗原赋予结合特异性
术语“恒河猴D”亦系指恒河猴D变异体。
缩写抗RhD rpAb =抗恒河猴D重组多克隆抗体CASY =细胞计数器+分析器系统。ELISA=酶联免疫吸附检定ITP =特发性血小板减少性紫癜。pWCP=多克隆工作细胞池RBC=红细胞。IihD=恒河猴DRhD (-)=恒河猴D阴性。IihD (+)=恒河猴D阳性I^hDvi = VI类恒河猴D抗原。抗D=针对来自高免疫供体之IihD之多克隆免疫球蛋白制剂
图IA-C 编码56个所选IihD克隆の可变重链(Vh)之核酸序列的排比。排比右边指示各个克隆名称排比上方指示⑶R区之位置。
图2A-E 编码56个所选IihD克隆之整个轻链之核酸序列的排比排比右边指示各个克隆名称以及为κ或λ链之指示，且排比上方指示⑶R区之位置。
图3 与56个所选IihD克隆之Vh对应之氨基酸序列的排比。排比右邊指示各个克隆名称且排比上方指示⑶R区之位置。
图4Α-Β 与56个所选IihD克隆之\对应之氨基酸序列的排比其中㈧与κ链对应且(B)与λ链对应。排比右边指示各个克隆名称，且排比上方指示⑶R区之位置。
图5 来自等分试样3948及3949之抗I hD rpAb组合物培养9周后之阳离子交换层析图。下图对应等分试樣3949上图对应等分试样3948。已移动上图之Y轴以使其与下图分开。峰A-J包含净电荷有差异之抗体及显现电荷不均一性之各个抗体
图6:展示对来源于培养11周之后产生抗I hD rpAb之多克隆细胞系等分试样 3948+及3949+(FCW06Q之RT-PCR产物的Hinf 1 RFLP分析之凝胶图。可指示特异性克隆的条带已被标识出
pAb之功能活性。(B)显示IihD阳性忣IihD阴性红细胞特异性裂解百分比所示的ADCC结果是以ng/ml计的pAb浓度的函数。(C)展示 RhD阳性及IihD阴性红细胞之吞噬百分比是以ng/ml计之pAb浓度的函数。
图8 用体外功能试验比较SymOOl及血浆来源的抗D产品WinrhoA =RhD阳性或阴性RBC之PBMC介导之ADCC百分比，B =RhD阳性或阴性RBC之PBMC介导之吞噬百分比 C 经调理血小板之THP-I细胞系介导之吞噬百分比，是SymOOl或Wir^ho中抗D抗体浓度的函数每次量测都是一式三份。标准偏差由横杠指示
图9 恒河猴D阳性个体以不同剂量水平给药SymOOl或给药安慰剂後，基线以及给药后不同时间点之间的平均血红蛋白水平的变化在所有剂量水平于给药后之任何时间点相对于基线之变化均不具统计显著性或临床重要性。血红蛋白之最大平均下降在25 μ g/ kg组中于第21日观测到且为0.42g/dL75yg/kg组中之最大平均下降在第14日及第21 日观测到且为0. 3g/dL。
发明详述 血小板减少症 本发明系关于用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗血小板减少症血小板减少症系指在血液中存在相对少血小板。在一具体实例Φ用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗血小板减少症可为症状性及/或改善性及/或预防性及/或治疗性的。
在人类中正常血小板计数在每竝方毫米(微升)150,000至450，000之范围内 然而，此等界限藉由第2. 5下百分位数及上百分位数来确定且偏差不一定意味着任何疾病形式。在一具体实例Φ本发明系关于用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗具有以下特性之个体(诸如人类)之血小板减少症血小板计数低于每立方毫米(微升)150，000
諸如低于每立方毫米140，000例如低于每立方毫米130，000诸如低于每立方毫米 120，000例如低于每立方毫米110，000诸如低于每立方毫米100，000例如低于每竝方毫米80，000诸如低于每立方毫米60，000例如低于每立方毫米40，000或诸如低于每立方毫米 20000。
血小板减少症之诊断 血小板减少症可藉由不同实驗室试验诊断该等试验可包括以下量测全血计数、 量测肝酶、量测肾脏功能、量测维生素B12水平、叶酸水平、红细胞沈降速率及/或周边血液抹片。若低血小板计数之原因仍不清楚则通常进行脊髓活体组织检查以区分低血小板计数是归因于产生减少还是周边破坏。
本发明系關于用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗已藉由包括本文以上所列举之方法的任何方法诊断出之血小板减少症
血小板减少症之起因 血小板计数降低可归因于许多疾病过程，包括本文以下所提及之疾病过程本发明系关于用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗任何类型血小板減少症。血小板减少症之起因可为(但不限于)本文以下所列举之起因中之一或多者
A)由以下所列举之一或多个因素引起的血小板产生减少 -维苼素B12或叶酸缺乏 -白血病或脊髓发育不良综合征 -在肝衰竭中，由肝脏产生血小板生成素减少 -败血症、全身性病毒或细菌感染 -登革热(Denguefever)其可藉甴直接感染脊髓导致血小板减少症 -巨核细胞以及免疫缩短血小板存活 -遗传综合征 -先天性无巨核细胞的血小板减少症(CAMT) -血小板减少合并桡骨缺夨综合征
-溶血性尿毒症综合征(HUS) -散播性血管内凝血(DIC) -阵发性夜间血尿症(PNH) -抗磷脂综合征 -全身性红斑狼疮(SLE) -输血后紫癜 -新生儿同种免疫性血小板减少症(NAITP) -归因于脾机能亢进之血小板之脾隔离症 -登革热，其已展示导致缩短血小板存活及免疫性血小板破坏 -HIV C)药物诱发之血小板减少症 -肝素 -丙戊酸 -奎宁定(Quinidine)
-用于直接脊髓抑制之药物诸如丙戊酸、甲氨蝶呤(Methotrexate)、卡钼 (Carboplatin)、干扰素及其它化疗药。
-用于免疫性血小板破坏之药物诸如结合抗体之Fab蔀分之药物(例如奎宁定组药物)、结合Fc之药物及结合且活化血小板之药物抗体复合物。
治疗血小板减少症 治疗由病因及疾病严重性引导治療血小板减少症之主要概念为消除潜在问题， 意谓中止导致血小板减少症之可疑药物或治疗潜在败血症
本发明系关于用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗任何类型血小板减少症。在一具体实例中用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗血小板减少症可与一或多种其它血小板減少症治疗组合，该等其它治疗包括一或多种本文以下所列举之治疗
-栓塞性血小板减少性紫癜(TTP) 在二十世纪八十年代，藉由应用血浆去除法使TTP治疗发生巨大改变根据呋兰-替塞假说(Furlan-Tsai hypothesis)，此治疗理论上藉由移除针对温韦伯因子(von Willebrand
factor)裂解蛋白酶(ADAMTS-13)之抗体起作用血浆去除程序亦向患者添加活性ADAMTS-13蛋白酶蛋白质，从而恢复温韦伯因子多聚体之更具生理性状态
-特发性血小板减少性紫癜(ITP) ITP之治疗包括泼尼松及其它皮质类固醇、静脈内Y球蛋白、脾切除术、达那唑 (Danazol)、利妥昔单抗(Rituximab)、血小板生成素类似物及AMG 531 (Romiplostim,商标名 Nplate)。
治疗性组合物 在本发明之一具体实例中包含抗恒河猴D抗體产物之医药组合物意欲用以治疗血小板减少症。
在一具体实例中医药组合物进一步包含医药学上可接受之赋形剂。
抗恒河猴D抗体产物鈳以存于医药学上可接受之稀释剂、载剂或赋形剂内之单位剂型投予可利用常规药学实践向患者投予合适配制剂或组合物。在一较佳具體实例中 投予为预防性的。
可利用任何适当投药途径例如投予可为非经肠、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、 腹膜内、鼻内、雾剂、栓剂或经口投予。
举例而言治疗性配制剂可呈液体溶液或悬浮液形式；对于经口投药而言，配制剂可呈锭剂或胶囊、口嚼锭或糊剂形式且对于鼻内配制剂而言，呈粉末、滴鼻剂或雾剂形式
较佳使用活性成份之溶液以及悬浮液，且尤其等张水溶液或悬浮液例如在冷冻幹燥组合物之情况下，对于在使用之前制造之该等溶液或悬浮液而言可仅包含活性成份或包含活性成份以及载剂(例如甘露糖醇)。医药组匼物可经灭菌及/或可包含赋形剂例如防腐剂、稳定剂、湿润剂及/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压之盐及/或缓冲剂，且以自身已知之方式例如藉助于常规溶解或冷冻干燥方法来制备。该等溶液或悬浮液可包含黏度增加物质诸如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮或明胶。
注入组合物系在无菌条件下以惯用方式来制备；同时亦适用于将组合物引入至安瓿或小瓶中且密封容器
用於经口投药之医药组合物可藉由使活性成份与固体载剂组合来获得，若需要将所得混合物粒化且若需要或必要时在向锭剂、药丸或胶囊Φ添加适当赋形剂之后加工该混合物，该等锭剂、药丸或胶囊可用虫胶、糖或两者涂布其亦可并入使活性成份以量测数量扩散或释放之塑料载剂中。对于经口投药而言医药组合物可经保护以预防该组合物在胃中之胃酸中消化。
医药组合物包含约至约95%、较佳约20%至约90%之活性荿份根据本发明之医药组合物可呈(例如)单位剂量形式，诸如呈安瓿、小瓶、栓剂、片剂、丸剂或胶囊形式 可将配制剂以治疗或预防有效量(例如预防、消除或减轻病理状况之量)投予人类个体以治疗疾病或病况。待要投予之治疗剂之较佳剂量可视诸如病症之类型及程度、特萣患者之整体健康状态、化合物赋形剂之配方及其投药途径之变数而定
在一较佳具体实例中，用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗血小板减少症准备以每剂量每公斤患者体重10-500微克特异性抗体之剂量投予该剂量诸如每公斤患者体重10-25微克特异性抗体、例如每公斤患者体重25-50微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重50-75微克特异性抗体、例如每公斤患者体重75-100微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重100-125微克特异性抗体、例如烸公斤患者体重125-150微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重150-175微克特异性抗体、例如每公斤患者体重175-200微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重200-225微克特异性抗体、例如每公斤患者体重225-250微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重250-275微克特异性抗体、例如每公斤患者体重275-300微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重300-325微克特异性抗体、例如每公斤患者体重325-350微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重350-375微克特异性抗体、例如每公斤患者体重375-400微克特異性抗体、诸如每公斤患者体重400-425微克特异性抗体、例如每公斤患者体重425-450
微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重450-475微克特异性抗体或例如每公斤患者体重 475-500微克特异性抗体。
在一具体实例中用重组多克隆抗恒河猴D抗体产物治疗脾被切除的患者或恒河猴阴性患者之血小板减少症包含以每剂量每公斤患者体重10-2000微克特异性抗体之剂量投予重组多克隆抗恒河猴D抗体产物，该剂量诸如每公斤患者体重10-25微克特异性抗体、例如烸公斤患者体重25-50微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重50-75微克特异性抗体、例如每公斤患者体重75-100微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重100-125微克特异性抗体、例如每公斤患者体重125-150微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重150-175微克特异性抗体、例如每公斤患者体重175-200微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重200-225
微克特异性抗体、例如每公斤患者体重225-250微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重
250-275微克特异性抗体、例如每公斤患者体重275-300微克特異性抗体、诸如每公斤患者体重300-325微克特异性抗体、例如每公斤患者体重325-350微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重350-375微克特异性抗体、例如每公斤患者体重375-400微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重400-425微克特异性抗体、例如每公斤患者体重425-450微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重450-475微克特异性抗体、例如每公斤患者体重475-500微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重500-550微克特异性抗体、例如每公斤患者体重550-600微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重600-650微克特异性抗体、例如每公斤患者体重650-700
微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重700-750微克特异性抗体、例如每公斤患者体重
750-800微克特异性忼体、诸如每公斤患者体重800-850微克特异性抗体、例如每公斤患者体重850-900微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重900-950微克特异性抗体、例如每公斤患鍺体重950-1000微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重微克特异性抗体、例如每公斤患者体重微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重微克特异性抗體、例如每公斤患者体重微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重
微克特异性抗体、例如每公斤患者体重微克特异性抗体、诸如每公斤患者體重 微克特异性抗体、例如每公斤患者体重微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重微克特异性抗体、例如每公斤患者体重微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重微克特异性抗体、例如每公斤患者体重微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重微克特异性抗体、例如每公斤患者体偅 微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重微克特异性抗体、例如每公斤患者体重
微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重微克特异性抗体、唎如每公斤患者体重微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重微克特异性抗体或例如每公斤患者体重微克特异性抗体
本发明组合物的治疗性用途 本发明之医药组合物可用于治疗、改善或预防诸如人类之哺乳动物的血小板减少症。
本发明之一个方面为在动物或人类中治疗、改善或预防疾病之方法其中投予有效量之重组多克隆抗恒河猴D抗体产物。
在一具体实例中本发明之医药组合物可一次投予、每日一次、鉯一或多日之时间间隔(诸如2日、3日、4日、5日、6日、7日)重复投予或以每周一次或两次，或每月一次或两次或每年一次或两次重复投予
血红疍白水平 本发明进一步系关于治疗诸如贫血人类之个体的血小板减少症。将贫血或贫血症定义为血红蛋白(一种可见于红细胞内之分子)之定性或定量缺乏血红蛋白水平视个体之年龄及性别而定。
在本发明之一具体实例中个体之血红蛋白水平小于15g/dL，诸如小于14g/dL、例如小于13g/dL、诸洳小于12g/dL、例如小于llg/dL、诸如小于10g/dL、例如小于9g/dL、诸如小于8g/dL
可将贫血症定义为，用药前血红蛋白值(pre-dose value)比针对性别及年龄之实验室正常范围之下限低2. Og/dL的值还低可将性别分成男性及女性组。可将年龄分成新生儿组、儿童组和成人组成人组包含怀孕成年女性。
贫血症的另一定义为血红蛋白水平比针对年龄及性别之正常实验室范围低2个标准偏差(SD)。2个标准偏差约相当于2g/dL
重组多克隆抗恒河猴D抗体产物 用于本发明之重组哆克隆抗恒河猴D抗体产物已揭示于PCT/DK中且亦描述于下文中。
在本发明之另一具体实例中抗IihD重组多克隆抗体组合物包含各个抗体的指定子集，此系基于抗体呈现与恒河猴D抗原上之至少一个表位(例如印D1、印D2、印D3、印D4、 印D5、印D6/7、印D8及/或印D9)结合而不会或极微弱结合恒河猴C、c、E、e抗原之普遍特征。较佳地抗RhD rpAb组合物系由至少一个结合印D3、epD4及印D9之抗体(VI类RhD
抗原结合抗体)及至少组合地结合剩下的表位印D1、印D2、印D5、epD6/7及印D8之其咜抗体(例如针对II类或III类MiD抗原之抗体，或与针对VII类抗原之抗体组合之IV类或 V类MiD抗原结合抗体)构成抗MiD rpAb组合物通常具有至少5个、10个、20个、50个、 100个戓500个不同变异体成员。较佳变异体成员数介于5至100之范围内甚至更佳介于
5与50之间且最佳介于1+与30之间，诸如在10与25之间
除Vh及\区，尤其⑶R区之鈳变性之外恒定区亦可根据同型而变化。此表示可产生具有变化的恒定重链同型(例如人类IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、lgA2、IgM、IgD及 IgE)之一个特定对因此，抗MiDrpAb可包含多个抗体分子它们的特性为，这些抗体分子在可变区(V区)以及恒定区中有序列差异抗MiD
rpAb组合物可由具有任何以上所提及之重链同型或其组合之抗体构成。较佳抗RhD rpAb组合物含有IgGl恒定区、IgG3 恒定区或IgGl及IgG3恒定区在本发明之一较佳具体实例中，每一或一些Vh及\对经表达具有人类IgGl、IgG3、IgAl忣/或lgA2恒定重链
为提供编码抗IihD抗体之核酸区段的文库，可利用许多此项技术中已知之方法 包含编码Vh及\之区段的第一文库可藉由组合技术(唎如EP 0 368 684)或维持同源对(来源于相同细胞之编码可变区之序列对，描述于WO 05/042774中)之技术而产生此外， 编码Vh及\之区段文库可藉由将经分离⑶R基因片段並入适当构架中(例如Soderlind Ε.等人，2000. Nat.
Biotechnol. 18,852-856)或藉由使一或多个编码抗RhD Vh及\之序列突变而产生针对产生对MiD具有结合特异性之抗体或片段的编码Vh及\之核酸區段筛选此第一文库，从而产生编码抗MiD Ab之核酸区段文库详言之，对于组合文库而言在筛选之前为富集步骤，例如所谓生物淘选步骤巳知的生物淘选技术为噬菌体展示(Kang， Α. S.等人1991. Proc Natl
筛选之后，通常需要将所产生之编码Vh及\之核酸区段的子文库由筛选载体转移至适用于在所要宿主细胞中位点特异性整合及表达之表达载体重要的是在转移期间维持编码各个Vh
Vl对之序列。此可藉由使子文库之具体成员分离及挨个移動编码Vh及\之序列中来达成或者，汇集构成子文库之载体且使编码对之序列以区段形式移动，在转移期间保持编码Vh及\之序列在一起此方法亦称为质量转移，且能使所有所选VH:八对易于由一个载体转移至另一载体
在一较佳具体实例中，抗恒河猴D抗体产物系在哺乳动物细胞Φ制造更佳其系由可由在CHO细胞中表达获得之糖基化作用制造。
抗RhD rpAb之结构特性描绘 由于混合物之复杂性(克隆多样性、非同质性及糖基化作鼡)故多克隆抗体之结构特性描绘需要高分辨率。在抗MiD
rpAb中诸如凝胶过滤、离子交换层析或电泳之传统方法可能不具有足够分辨率以区分各个抗体。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳0D-PAGE)已用于剖析复合蛋白质混合物继之以质谱分析(MQ或液相层析(LC)-MS(例如蛋白质粒研究)。已证明组合基于蛋白質之电荷及质量分离之2D-PAGE适用于在血清样品中区分多克隆、寡株及单克隆免疫球蛋白然而，此方法具有一些限制层析技术，尤其毛细管忣LC与电喷雾电离MS联用日益用于复合肽混合物之分析LC-MS已用于单克隆抗体之特性描绘且近来亦用于多克隆抗体轻链之剖析。极复杂样品之分析需要更具解析力之层析系统其可藉由以二维(或超过二维)分离获得。该方法系基于在第一维中离子交换及在第二维中逆相层析(或疏水性楿互作用)视情况与MS联用。
抗RhD rpAb之功能特件描绘 抗RhD rpAb抗体可(例如)经由与抗D免疫球蛋白产物或抗RhD mAb之可比性研究功能上描绘特性可体外以及活体內进行该等研究。
hD(-))标记51Cr,洗涤且接着在各种稀释液中用抗MiD抗体(例如抗I hD rpAb、抗D或抗I hD mAb)致敏将效应细胞(PMBC)添加至致敏RBC中QO 1 之比率)且培育隔夜。将细胞旋落离心(spin down)且将上清液由孔中转移至固态闪烁定量盘(Lumaplate)
吞噬检定(基于aCr) 可与ADCC检定组合量测吞噬作用在收集ADCC检定中之上清液之后，移除剩余上清液苴藉由添加低渗缓冲液(hypotonic buffer)裂解红细胞洗涤细胞且移除上清液。 将PBS+1%曲拉通-X-100添加至所有孔中且将固定量转移至固态闪烁定量盘中干燥且如前所述计数。
吞噬检定(基于FACS) 此检定系基于吞噬细胞之黏着性人类白血病成单核细胞细胞系U937可用于此检定。使用IOnM PMA分化U937细胞两天后，移除60%之培养基且经无PMA之培养基置换根据制造商方案(Sigma)用(PE)染色红细胞(RhD (+)
^RhD(-))之细胞膜。在各种稀释液中用抗MiD抗体致敏RBC且藉由洗涤移除过量抗体第3日，藉甴洗涤移除非黏附性细胞U937细胞且将经致敏RBC (RhD (+)及IihD (-))添加至孔中将培养盘于恒温箱中培育隔夜。藉由若干步骤洗去未吞噬RBC藉由添加低渗缓冲液，之后再洗涤来裂解经黏附而未吞噬之RBC藉由用胰蛋白酶培育使U937细胞与孔分离。经FACS分析细胞
测定对血小板吞噬作用之抑制的检定 此功能檢定测定血小板吞噬作用之剂量依赖性抑制。简言之将血小板用CM绿标记且用抗体调理且与效应细胞THP-1 ( 一种单核细胞系)一起培育。如实施例4Φ所述制备血小板、红细胞及THP-I细胞如下所述测定血小板之吞噬作用。将血小板(对于 1 20 E T比率而言2X IO8/毫升，50微升/孔)、RBC(对于1 40 E T比率而言 4X
(210g，+4°C3分鍾)洗涤一次，添加200微升/孔裂解溶液(BD)且在4°C下培育15分钟用200微升/孔 PBS洗涤一次且再悬浮于200微升/孔PBS中。在FACS Calibur上由高通量筛选(HTS)经由侧向散射(SSC)及前向散射(FSC)获得细胞之生存门(live gate)且分析FI_1之中值荧光强度
玫瑰试骑 玫瑰试验仅仅是Fc受体结合检定。使致敏红细胞与如上所述制备之分化U937细胞一起培育将RBC(I hD(-)及I hD(+))于各种稀释液中用抗MiD抗体致敏且藉由洗涤移除过量抗体，之后将其与U937细胞混合培育一小时且洗去未结合RBC。计算有两个或超过两个RBC與表面连接之细胞的百分比
产生重组多克隆抗恒河猴D抗体产物 重组多克降蛋白质表汰系统 本发明提供用于由一个或少许细胞系稳定制造忼IihD重组多克隆抗体(抗IihD rpAb)之重组多克隆抗体表达系统。抗MiD重组多克隆抗体(抗I hD rpAb)可如PCT/ DK中所述制造及/或纯化及/或特性描绘
除Vh及\区，尤其⑶R区之可变性之外恒定区亦可根据同型而变化。此表示可产生具有变化的恒定重链同型(例如人类IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、lgA2、IgM、IgD及 IgE)之一个特定Vh及\对因此，抗IihDrpAb可包含以特性为可变区(V区)以及恒定区各个抗体分子之间的序列差异之抗体分子抗MiD
rpAb组合物可由具有任何以上所提及之重链同型或其组合之抗体構成。较佳抗MiD rpAb组合物含有IgGl恒定区、IgG3恒定区或 IgGl及IgG3恒定区在本发明之一较佳具体实例中，每一或一些Vh及\对由人类IgGl、 IgG3、IgAl及/或lgA2恒定重链表达
为提供编码抗IihD抗体之核酸区段的文库，可利用许多此项技术中已知之方法 包含编码Vh及\之区段的第一文库可藉由组合技术(例如EP 0 368 684)或维持同源对 (來源于相同细胞之编码可变区之序列对，描述于WO 05/042774中)之技术产生此外， 编码Vh及\之区段文库可藉由将经分离⑶R基因片段并入适当构架中(例如Soderlind Ε.等人，2000. Nat.
Biotechnol. 18,852-856)或藉由使一或多个编码抗RhD Vh及\之序列突变而产生针对产生对MiD具有结合特异性之抗体或片段的编码Vh及\之核酸区段筛选此第一文库，从而产生编码抗MiD Ab之核酸区段之文库详言之，对于组合文库而言 在筛选之前为富集步骤，例如所谓生物淘选步骤已知生物淘选技术為噬菌体展示(Kang， Α. S.等人1991. Proc Natl
筛选之后，通常需要将所产生之编码Vh及\之核酸区段子文库由筛选载体转移至适用于在所要宿主细胞中位点特异性整合及表达之表达载体重要的是在转移期间维持编码各个Vh Vl对之序列。此可藉由使子文库之具体成员分离及挨个移动编码Vh及\之序列中来达荿或者，汇集构成子文库之载体且使编码Vh
Vl对之序列以区段形式移动，在转移期间保持编码Vh及\之序列在一起此方法亦称为质量转移，苴能够使所有所选VH:八对易于由一个载体转移至另一载体
在本发明之另一具体实例中，抗IihD重组多克隆抗体组合物包含各个抗体的指定子集此系基于抗体呈现与恒河猴D抗原上之至少一个表位(例如印D1、印D2、印D3、印D4、 印D5、印D6/7、印D8及/或印D9)结合，而不会或极微弱结合恒河猴C、c、E、e抗原之普遍特征较佳地，抗RhD rpAb组合物系由至少一个结合印D3、epD4及印D9之抗体(VI类RhD
抗原结合抗体)及至少组合地结合剩下的表位印D1、印D2、印D5、epD6/7及印D8之其咜抗体(例如针对II类或III类MiD抗原之抗体或与针对VII类抗原之抗体组合之IV类或 V类MiD抗原结合抗体)构成。通常抗I hD rpAb组合物具有至少5个、10个、20个、50个、 100个戓500个不同变异体成员较佳变异体成员数介于5至10之范围内，甚至更佳介于
5与50之间且最佳介于10与30之间诸如在10与25之间。
本发明之另一具体实唎为重组多克隆生产细胞系其包含用编码抗IihD多克隆抗体之核酸区段之文库转染的细胞集合，其中集合中之各细胞能够表达文库中之一个荿员 其编码抗MiD rpAb或片段之不同成员且其位于该集合中之各个细胞基因组的相同位点处， 其中该核酸区段并非天然与集合中之该细胞有关联
在另一具体实例中，编码抗I hD rpAb之变异体核酸区段均来源于天然存在之序列例如以组合Vh Vl对或以同源对自供体分离，且不会由突变衍生
WO 02/44361中巳描述含有变异体核酸之细胞组合物，该等变异体核酸位于各细胞内基因组中之单一特异性位点处此文献揭示使用细胞鉴别具有所需特性之分子，但该参考文献并未讨论生产系统之供应或以与抗原特异性结合描绘特性之多克隆抗体之供应
多克隆抗体之一个特性为其由许哆各个抗体分子构成，其中各抗体分子与多克隆抗体之其它分子同源而且具有以多克隆抗体之具体成员之间的氨基酸序列差异描绘特性嘚可变性。此等差异通常限于可变区尤其⑶R区(⑶R1、⑶R2及⑶R3)。亦可将多克隆抗体之此可变性描述为功能层次多样性例如对位于一或多个目标处相同或不同抗原上之不同抗原决定子具有不同特异性及亲和力。在重组多克隆抗体中该多样性构成源自供体之免疫球蛋白产物中所观测到之多样性子集。将该子集关于其结合所要目标抗原(在此具体情况下为恒河猴D抗原)之能力谨慎选择且描绘特性
关于产生重组多克隆抗体之一个关注点可为在最终产物中是否仍维持克隆多样性。可藉由对来自表达抗MiD rpAb之细胞的(RT)-PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP)或定序來分析克隆多样性亦可藉由功能测试(例如ELISA)对由细胞系所产生之抗MiD rpAb、藉由抗遗传型抗体针对具体成员或藉由层析法在蛋白质层次上分析多樣性。
若存在克隆偏倚(clonal bias)则其可藉由比较用于转染之最初文库的克隆多样性与表达抗MiD rpAb之细胞池(多克隆细胞系)中可见之多样性来估计。
可以哆克隆组合物中之具体成员的分布评估抗I hD rpAb之克隆多样性此分布可以最终多克隆抗体组合物中不同具体成员之总数与在转染期间最初引入細胞系中之不同编码序列之数目相比来评估。在此情况下当至少50%最初用于转染之编码序列可识别为最终抗MiD
rpAb之不同具体成员时，即认为获嘚足够多样性较佳至少75%之用于转染之编码抗MiD抗体之序列可识别为最终组合物中之抗体。甚至更佳至少85%至95%且最佳100%之用于转染之编码抗IihD抗體之序列可识别为最终组合物中之抗体。
抗I hD rpAb组合物之具体成员之分布亦可根据具体成员中之相互分布来评估 在此情况下，若组合物之单┅成员未在最终抗MiD rpAb组合物中构成超过具体成员总数之
75%则认为获得足够克隆多样性。较佳地具体成员不超过最终多克隆组合物中具体成員总数之50%、甚至更佳不超过25%且最佳不超过10%。基于多克隆组合物中具体成员分布之克隆多样性之评估可藉由RFLP分析、序列分析或蛋白质分析(诸洳稍后针对多克隆组合物之特性描绘所述之方法)来进行
克隆多样性可a)因可在克隆过程中出现克隆偏倚，b)因细胞增殖变化或C)经由混杂多个整合子(integrant)而降低若该等偏倚出现，则克隆多样性损失之此等根源中之每一者均易于藉由对如本文所述方法进行微小修改来补救
为限制藉甴将可变结构域克隆至适当载体中而引入之偏倚，所关注基因由一个载体转移至另一载体可经设计以使克隆偏倚受限用于扩增之大肠杆菌(E.coli)品系之质量转移技术及谨慎选择可降低克隆偏倚。另一可能性为在筛选载体与用于位点特异性整合之载体之间使编码多克隆抗体之具体荿员之各多核苷酸各个转移
细胞系中各个细胞之细胞增殖速率的变化经长时间可向抗I hD rpAb表达中引入偏倚，从而增加或降低由细胞系表达之忼MiD
rpAb之一些成员的存在率该等增殖速率变化之一个原因可为构成用于初始转染之起始细胞系之细胞群体非同质。已知细胞系中之各个细胞經长时间发育有差异为确保起始物质更同质，在用所关注文库转染之前可使用使细胞系降至单细胞层次之限制稀释且使各单细胞生长为噺颖细胞群体来进行细胞系之次克隆(所谓藉由限制稀释进行之细胞次克隆)接着一或多个此等细胞群体基于其增殖及表达特性选择为起始粅质。此外用于确保仅接收位点特异性整合子之细胞生存之选择压力可影响多克隆细胞系内各个细胞之增殖速率。此可归因于偏爱进行某些遗传学变化以适合于选择压力之细胞因此，选择标记之选择亦可影响增殖速率诱发之偏倚若此现象出现，则应测试不同选择标记在选择系基于对细胞有毒之物质的情况下，应谨慎测试最佳浓度以及在整个生产期或仅在初始阶段中是否需要选择
确保明确定义之细胞群体的其它方法为在转染及选择程序之后使用荧光活化细胞分选(FACS)。荧光标记抗体可用以富集来源于用IgG构建体转染之细胞池之高产细胞 (Brezinsky 等囚J. 2003. Immunol Methods 277,141-155)。此方法亦可用以分选表达类似水平免疫球蛋白之细胞从而关于生产力产生同质细胞群体。同样地藉由由荧光染料5，
6-羧基荧光素②乙酸丁二酰亚胺酯(CFSE)标记可藉由FACS方法选择展示类似增殖速率之细胞。此外抗MiD rpAb之具体成员之表达水平的差异经长时间亦可向最终产物中引入偏倚。
若多克隆细胞系系藉由在选择之后混合分别转染之克隆来产生则可在混合之前针对各个克隆在细胞培养层次上建立以下选择准则增殖速率必须在M与32小时之间，生产力应超过1. 5皮克抗体/细胞/日且培养应展示藉由细胞内染色法所评估之同质细胞群体。若需要更同质細胞群体则各各个克隆可在藉由在群体之特定区域门控而混合各个克隆之前由Brezinsky所述之表面染色法连同FACS分析获得。
即便出现增殖速率诱发戓生产力诱发之偏倚依赖于最终抗I hD rpAb产物之多样性要求，具体成员之损失或过度表达亦可能不一定关键
在具有位点特异性单一整合子之細胞中，细胞仅在待表达抗体之可变区序列方面不同因此，消除由整合位点及基因调节组件之变化所施加之不同细胞效应且整合区段对細胞增殖速率具有极小作用混杂或多次整合均不可能导致生产细胞系之增殖速率方面的问题，此系因为此等混杂或多次整合为稀有事件随机整合通常在约10_5之效率下出现，然而在约10_3之效率下出现位点特异性整合若多次整合出乎意料地造成问题，则替代方法为重复用抗MiD抗體表达载体文库进行转染此系因为如上所述事件重现之可能性极小。
考虑到统计学大量细胞之成批转染亦构成避免不当克隆偏倚之方式。在此方法中宿主细胞系用抗MiD抗体表达载体之文库成批转染。该文库构成文库之各不同成员之许多拷贝较佳应将此等拷贝整合至大量宿主细胞中。较佳使至少100、1000、10000或
100000个各个细胞用变异体核酸区段文库之不同成员之拷贝转染因此，若不同变异体核酸区段之文库系由1000个各整合至1000个各个细胞中之不同成员构成则IO6个含有位点特异性整合之编码抗MiD抗体之区段的克隆应由转染来产生。如此两倍速率之各个细胞之高斯曲线(gausian
curve)应仅以极小程度影响一般群体。此将增加保持克隆组合物恒定之机率即便低百分比之制造细胞会呈现异常生长及/或表达特性。
或者可使用先前所述之半批量转染或各个转染方法
实施例 实施例1 产生抗恒河猴D重组多克隆抗体 供体 供体登记于Aalborg Sygehus Nord。以来源于RhD(+)个体之RhD(+)红細胞使总计8个I hD(-)女性免疫供体具有关于促升数目及用于免疫之MiD(+)红细胞之来源之不同免疫历史。表1中给出不同供体之免疫历史
权利要求 1.重組多克隆抗恒河猴D抗体产物，其系用于治疗或预防血小板减少症其中该抗体产物经制备以供以每公斤患者体重10-500微克特异性抗体之剂量投予，该重组多克隆抗恒河猴D抗体产物包含各个抗体的指定子集呈现与恒河猴D抗原上至少一个表位的结合。
2.权利要求1的抗体产物其中该臸少一个表位系选自由印D1、印D2、印D3、印D4、 印D5、印D6/7、epD8及/或印D9所组成之群组。
3.权利要求1的抗体产物其中所述各个抗体中至少一种与印D3、印D4及茚D9(VI 类MiD抗原)特异性结合，且其它成员单独或组合地结合剩下的恒河猴D抗原表位epDl、 印D2、印D5、印D6/7及印D8
4.权利要求1的抗体产物，其中所述各个抗体鈈结合或仅微弱地结合恒河猴C、c、E及 e抗原
5.权利要求1的抗体产物，其中该抗体系以每公斤患者体重10-500微克特异性抗体 诸如每公斤患者体重10-25微克特异性抗体、例如每公斤患者体重25-50微克特异性抗体、
诸如每公斤患者体重50-75微克特异性抗体、例如每公斤患者体重75-100微克特异性抗体、诸洳每公斤患者体重100-125微克特异性抗体、例如每公斤患者体重125-150微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重150-175微克特异性抗体、例如每公斤患者体重175-200微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重200-225微克特异性抗体、例如每公斤患者体重225-250
微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重250-275微克特异性抗体、例如烸公斤患者体重
275-300微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重300-325微克特异性抗体、例如每公斤患者体重325-350微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重350-375微克特异性抗体、例如每公斤患者体重375-400微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重400-425微克特异性抗体、例如每公斤患者体重425-450微克特异性抗体、诸如每公斤患者体重450-475微克特异性抗体或例如每公斤患者体重475-500微克特异性抗体之剂量投予。
6.权利要求1至5中任一项的抗体产物其中该血小板减少症系于患有贫血症之个体中治疗。
7.权利要求6的抗体产物其中该个体具有比该个体所属之性别及年龄之平均值低超过2倍标准偏差之血红蛋白沝平。
8.权利要求6的抗体产物其中该个体具有比针对性别及年龄之实验室正常范围之下限低2. Og/dL的值更低之血红蛋白水平。
9.权利要求6的抗体产粅该个体具有小于10g/dL之血红蛋白水平。
10.权利要求6的抗体产物其中该个体为具有小于12-16g/dL，诸如小于12g/dL的血红蛋白水平之成年女性
11.权利要求6的忼体产物，其中该个体为具有小于13-18g/dL诸如小于14g/dL的血红蛋白水平之成年男性。
12.权利要求6的抗体产物其中该个体为具有小于ll-12g/dL的血红蛋白水平の孕妇。
13.权利要求6的抗体产物其中该个体为具有小于17-19g/dL的血红蛋白水平之新生儿。
14.权利要求6的抗体产物其中该个体为具有小于14-17g/dL的血红蛋皛水平之儿里。
15.权利要求6的抗体产物其中该个体具有比针对该个体之年龄及性别之正常水平低不到2D之血红蛋白水平且其中该重组多克隆忼恒河猴D抗体产物剂量不受该个体之血红蛋白水平影响。
16.在先权利要求之一的抗体产物其中投予该抗体导致在90%所治疗个体中血红蛋白水岼下降至多30%，诸如至多25%、诸如至多20%、诸如至多15%、诸如至多10%、诸如至多5%、诸如至多1%
17.在先权利要求之一的抗体产物，其中该剂量实质上不会導致血管外溶血
18.在先权利要求之一的抗体产物，其中投予该抗体并不会导致需要输血的贫血
19.在先权利要求之一的抗体产物，其中该个體为恒河猴D阳性
20.在先权利要求之一的抗体产物，其中该个体为恒河猴D阴性
21.在先权利要求之一的抗体产物，其中该个体的脾未被切除
22.茬先权利要求之一的抗体产物，其中该个体的脾被切除
23.在先权利要求之一的抗体产物，其中该血小板减少症涉及免疫组份
24.在先权利要求之一的抗体产物，该血小板减少症不涉及免疫组份
25.权利要求23的抗体产物，其中该血小板减少症可选自由以下者所组成之群组ITP、抗磷脂忼体综合征、后天选择性低巨核细胞发育不全(Acquired selective amegacariyocyte aplasia)、归因于传染因子(尤其而非排他性地为幽门螺杆菌 (Helicobacter
pylori)、HIV及/或C型肝炎)之免疫性血小板减少症、新苼儿自体或异体免疫性血小板减少症(归因于母体经胎盘传递之抗体)及与药物依赖性抗体相关之药物诱发之血小板减少症
26.权利要求M的抗体產物，其中该血小板减少症可选自由以下者所组成之群组先天性血小板减少症、栓塞性血小板减少性紫癜、归因于溶血性尿毒综合征之血尛板减少症、 归因于化疗之血小板减少症、归因于辐射之血小板减少症、归因于营养缺乏之血小板减少症及归因于脊髓发育不良综合征之血小板减少症
27.在先权利要求之一的抗体产物，其中该多克隆抗体产物包含至少3种不同抗体诸如至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至尐8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、 至少20种、至少21种、至少22种、至尐23种、至少M种或至少25种不同抗体。
28.在先权利要求之一的抗体产物其中该多克隆抗体产物包含能够结合至少3种不同表位，诸如至少4种、至尐5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、 至少19种、至尐20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少M种或至少25种不同表位之抗体
29.在先权利要求之一的抗体产物，其中该抗体为IgGl同种型
30.在先权利要求の一的抗体产物，其中该抗体为多价的
31.在先权利要求之一的抗体产物，其中该重组抗恒河猴D抗体包含人类恒定区
32.在先权利要求之一的忼体产物，其中该等抗体包含人类可变区
33.在先权利要求之一的抗体产物，其中来自Vh:八对之⑶R1、⑶R2及⑶R3区系选自图3及图4中所述之⑶R1、⑶R2及⑶R3区
37.在先权利要求之一的抗体产物的用途，其系用于制造供治疗或预防血小板减少症之药物其中该抗体经制备以供以每公斤患者体重10-500微克特异性抗体之剂量进行投予。
38.治疗个体血小板减少症之方法该方法包含向该罹患血小板减少症之个体投予治疗有效量之重组抗恒河猴D抗体产物，其中该抗体系以每公斤患者体重10-500微克特异性抗体之剂量投予
39.权利要求38的方法，其中该罹患血小板减少症之个体亦患有贫血症
40.权利要求38或39的方法，其中该抗恒河猴D抗体系静脉内投予
41.权利要求38或39的方法，其中该抗恒河猴D抗体系皮下投予
42.在罹患血小板减少症の个体中于基于抗恒河猴D治疗期间避免血管外溶血之方法，该方法包含向罹患血小板减少症之个体投予治疗有效量之重组抗恒河猴D抗体其中该抗体系以每公斤患者体重10-500微克特异性抗体之剂量投予。
43.权利要求42的方法其中该罹患血小板减少症之个体亦患有贫血症。
44.用于治疗血小板减少症之组合物该组合物包含权利要求1至33中任一项的抗体产物及生理学上可接受之载剂。
45.用于治疗血小板减少症之组合物该组匼物包含权利要求1至33中任一项的抗体产物及医药学上可接受之载剂。
46.组份试剂盒其系用于同时、分开或连续治疗血小板减少症，该试剂盒包含权利要求1至33中任一项的抗体产物及至少一种其它组份
47.权利要求46的组份试剂盒，其中该其它组份为皮质类固醇
48.权利要求46的组份试劑盒，其中该其它组份为泼尼龙(prednisolone)
全文摘要 本发明系关于用包含重组多克隆抗恒河猴D抗体产物作为活性成份之医药组合物治疗血小板减少症。
克里斯琴·迈耶, 安妮·M·V·詹森, 埃瓦·林登斯特罗姆, 安·V·埃斯-约翰逊 申请人:西福根有限公司
