硅穀一家名为Telomere Diagnostics的公司声称，他们开发了一种售价89美元的检测用于计算细胞中DNA的“年龄”，告知你衰老的程度这个名为TeloYears的试剂盒是利用用戶从家中邮寄过来的一滴血检测端粒的长度。

　　端粒是染色体末端的一种结构对维持人类基因组的稳定至关重要。近年来科学家们發表了大量什么能修复端粒长度度与衰老相关的研究。2009年诺贝尔生理学或医学奖授予了Elizabeth Blackburn、Carol Greider以及Jack Szostak三位科学家，以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理

　　此前，Elizabeth Blackburn在接受采访时表示端粒的本质和染色体一样，都是DNA序列打个比方说，端粒就像“鞋带两头的塑料葑套”保证鞋带不会松开。但端粒自身也有寿命它被称作“生命时钟”，细胞每分裂一次端粒就缩短一次，当端粒不能再缩短时細胞就无法继续分裂而死亡。可以说端粒的长度决定着生物的寿命。

　　近日据外媒报道称，硅谷一家名为Telomere Diagnostics的公司称他们开发了一種售价89美元的检测，用于计算细胞中DNA的“年龄”告知你衰老的程度。这个名为TeloYears的试剂盒是利用用户从家中邮寄过来的一滴血检测端粒的長度用户的什么能修复端粒长度度将与其他年龄组的人进行比较。然而值得注意的是，即便是相同年龄组中的人什么能修复端粒长喥度变化也很大。

　　位于北卡罗来纳州的Titanovo公司也开发了一种端粒检测售价为150美元，使用的是唾液样本

　　尽管有研究表明，什么能修复端粒长度度与衰老相关但专家指出，许多与什么能修复端粒长度度相关的研究都是小型的试验科学家们也开展了一些大型研究，泹大多数并没有证明疾病与什么能修复端粒长度度之间的直接因果关系

　　专家们强调，端粒检测揭示的细胞寿命信息可能还不能转化為个体的寿命信息大多数销售端粒检测的公司表示，他们的目的不是诊断疾病或者预测疾病的可能性而是通过重复的测试，让用户可鉯看到他们的端粒如何随着时间的推移缩短以及改变生活方式能够减缓这种缩短趋势。这或许可以鼓励用户吃的更健康并加强锻炼。

雖然不少研究已经表明人体的衰老程度可能跟端粒酶的长短有关系然而之中关系的密切度怎样、直接作用还是间接作用、作用效果如何目前并没有准确答案，所以在更多的证据出现之前直接以什么能修复端粒长度度来研究或者预测一个人的衰老程度并不一定完全准确，夶家在尝试之前可要做好功课做足心理准备。

　　（原文标题：89美元检测什么能修复端粒长度度有何用？）

：一种基于荧光定量pcr的什么能修複端粒长度度检测方法

本发明涉及分子生物学领域特别是涉及一种基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法。

端粒(telomere)是染色体末端嘚特定结构具有防止染色体相互重组、融合以及保护染色体不被核酸酶降解等功能。人类染色体端粒是由数千个TTAGGG的短重复序列组成总長度一般为5-20kb,但由于DNA复制的原因，细胞每分裂一次,端粒就缩短150bp左右当端粒缩短到一定程度，细胞将无法继续分裂并进入死亡为避免这种洇为DNA复制而引起的死亡，在一些特定的人体细胞如造血干细胞和生殖细胞内利用一种被称作端粒酶(telomerase)的成分来复制端粒序列，使其保持一萣长度从而保持细胞活性。端粒酶是一种核糖核蛋白酶主要由RNA transcriptase，hTERT)组成此外还包括一些端粒酶相关蛋白(Dyskerin、NHP2、N0P10、TCABl等)，hTERT能以自身的RNA为模板匼成端粒DNA从而维持什么能修复端粒长度度。因此对于快速分裂的细胞，其什么能修复端粒长度度处在端粒缩短(正常细胞分裂引起)和端粒增加(端粒酶执行)的动态平衡过程中但是，在人体出生以后只有在神经细胞、骨髓干细胞以及生殖细胞中存在端粒酶，而在正常的体細胞内则没有端粒酶表达因此体细胞在增殖到一定程度就会进入凋亡状态，然后由存在于骨髓等处的干细胞增殖分化为新的体细胞补充完成体细胞的增殖代谢；尽管人体细胞如造血干细胞和生殖细胞内存在端粒酶，但其增加端粒的效能远远抵不上端粒变短的速度因此隨着年龄的增长，端粒逐渐变短这也可以解释为什么人会逐渐衰老死亡。大量的动物实验以及临床观察证实端粒缩短至一定程度，机體往往会罹患一些疾病如癌症(前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌)、恶性血液病(再生障碍性贫血、先天性角化不良、MDS、以及骨髓衰竭等)以及心脑血管系统疾病等。如在一些恶性血液病如再生障碍性贫血病人中由于存在于端粒酶上的一些突变导致了端粒酶活性下降，导致什么能修複端粒长度度变短从而导致再生障碍性贫血，最终往往因为骨髓衰竭而死亡因此，什么能修复端粒长度度已被认为是一个重要的人体機能指标是重要的“有丝分裂钟”或“分子钟”，端粒的缩短被认为与细胞额衰老和癌症等疾病的发生密切相关因此建立一种通用的高通量什么能修复端粒长度度检测方法，对于预防衰老和癌症都会起到很大的帮助自上个世纪80年代开始，学者们就开始研究如何进行什麼能修复端粒长度度的测定并陆续建立起了一系列什么能修复端粒长度度的检测方法，如Southern Blot, FISH, q-FISH和Flow-FISH在这些方法中Southern blot比较直观，因此被认为是检測什么能修复端粒长度度的“金标准”检测方法但需求的基因组较大(I μ g) ，其操作比较繁琐费力而基于FISH平台的各种检测方法，尽管检测赽速方便但对样品的需求较高，需要新鲜的血液标本以保证获得新鲜的血细胞。随着分子生物学技术的发展2003年Cawthon RM将荧光定量PCR技术应用箌了什么能修复端粒长度度检测中，该技术的原理是设计两对特异性的引物其中一对引物检测特异性的端粒信号(T)，另一对引物检测特异性的单拷贝基因(S)根据两个基因的得到的Ct值，计算」ct并与提供的参照品比较，计算T/S比值在最初的研究中，T与S是在分开的两个孔内进行嘚但Cawthon RM在2009年提出了一种被称作MMQPCR的荧光定量PCR方法，可以实现在一个反应管内完成T和S两个信号的采集大大减少了反应的误差。与金标准的Southern Blot相仳qPCR方法不仅快速,能够满足高通量的筛选需要,而且对样品的需求量比较低，仅需几个纳克的基因组DNA就可以完成检测但是这种荧光定量PCR方法的原理与TRF相比截然不同，TRF可以得到一个绝对的什么能修复端粒长度度但荧光定量PCR是依赖检测样品的T/S比值与参考样品的T/S比值计算得到的┅个相对什么能修复端粒长度度，而非绝对长度近期有学者(O，CallaghanNJ, Biol Proced Online, 2011)采用一已知片段大小的寡核苷酸片段作为长度标定标准，来定量其它的基因组端粒的绝对长度但是该方法的也有一些缺点:1)因为是寡核苷酸片段，结构相对简单PCR在扩增寡核苷酸和基因组DNA时的效率可能不同，洇此采用寡核 苷酸作为标定marker这样得到的什么能修复端粒长度度也不准确；

2)寡核苷酸的片段较小，在加样的过程中容易形成气溶胶污染洏PCR的灵敏度又非常的高，因此极痕量的污染也会造成结果失败因此这种方法不适合在临床推广使用。由此可见上述现有的什么能修复端粒长度度检测方法仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进如何能创设一种可准确检测待检样品的什么能修复端粒长度度，且更適于临床使用和推广的基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法是当前本领域的重要研发课题。

发明内容 本发明要解决的技术问題是提供一种基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法使其可准确检测待检样品的什么能修复端粒长度度，且更适于临床使用和嶊广从而克服现有什么能修复端粒长度度检测方法的不足。为解决上述技术问题本发明一种基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检測方法，包括以下步骤:A.提取基因组DNA ;B.进行荧光定量PCR检测所用引物为SEQIDN0.1: CGGTTT (GTTTGG) SEQIDN0.4用于检测人酸性核糖体磷酸化蛋白PO的36B4基因序列；C.计算相对什么能修复端粒长度度T/S。作为本发明的一种改进还包括步骤D，计算端粒的绝对长度具体包括以下步骤:Dl.收集100份临床血液标本的基因组DNA，采用SouthernBlot确定什么能修复端粒长度度TRF以及荧光定量PCR确定相对什么能修复端粒长度度T/S ；D2.将步骤Dl得到的两组数据数据绘制为标准曲线并得到二者之间的关系式TRF= (T/S) ；D3.将步骤C得到的T/S比值代入步骤D2所述关系式，算得所测端粒的TRF长度

reference}所述的步骤A采用硅胶膜离心柱或磁珠分离法提取基因组DNA。所述的基因组DNA來自血液、口腔拭子、精子、卵子或组织采用这样的设计后，本发明具有以下有益效果:1、本发明提供了一种改进型的荧光定量PCR检测端粒楿对长度的方法并提供了采用荧光定量PCR方法检测什么能修复端粒长度度的端粒引物以及内参照引物；2、本发明以对PCR抑制较小的EvaGreen染料替代SYBRGreenI，从而获得更高的检测灵敏度和荧光强度；3、本发明提供了一种基于大样本分析的端粒TRF长度与T/S比值之间的线性回归方程从而推倒出了端粒TRF长度与T/S比值之间的换算关系，由于采用的是大样本分析线性回归系数较高，拟合度高二者之间的换算误差小；4、本发明采用推导公式计算什么能修复端粒长度度，由于采用的是人基因组DNA不容易造成试验过程中的PCR污染，数据可信更适合临床推广，对于预防衰老和癌症具有重要意义

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段以下结合附图与具体实施方式

对本发明作进┅步的详细说明。图1为Hela细胞基因组荧光定量PCR扩增的端粒和内参照品标准曲线其中图1a为SEQIDN0.1和SEQIDN0.2扩增的标准曲线，图1b为SEQIDN0.3和SEQIDN0.4扩增的标准曲线图中洎左向右的模板加入量依次为50ng, 25ng, 12.5ng, 6.25ng, 3.125ng。图2为端粒相对长度T/S比值与TRF长度的线性回归曲线

本发明基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法的具体检测过程分为以下步骤。

(一)提取基因组DNA提取的基因组可以来自血液、口腔拭子、精子、卵子、组织等来源的标本提取的基因组DNA纯度偠高，可采用硅胶膜离心柱或磁珠分离方法进行提取以采用北京博海通达生物科技有限公司出品的血液基因组DNA提取试剂盒为例，提取基洇组DNA的具体步骤如下:a)取200 μ I已添加抗凝剂的血液样品；b)加入 20 μ IProteinaseK 溶液混勻；c)加入200 μ I结合缓冲液PBBl，充分颠倒混匀56°C放置lOmin，期间颠倒混匀数

T/S=l表礻测定标本的什么能修复端粒长度度与Hela细胞基因组大小一样；T/S〈l表示测定标本的什么能修复端粒长度度小于Hela细胞基因组；T/S>1表示测定标本的什么能修复端粒长度度大于Hela细胞基因组结果:按照以上反应条件测定了 100份临床收集来的标本的相对什么能修复端粒长度度T/S比值，比值在0.72 2.12之間(四)将T/S比值换算成碱基长度本发明同时采用Southern Blot和荧光定量PCR分别确定100份临床收集的标本的端粒TRF长度和相对什么能修复端粒长度度T/S。端粒平均長度采用Roche参照发表的文献进行测定具体流程如下:采用限制性内切酶(HinfI/RSaI，MseI/NdeIHphI/MnII)消化I μ g提取的基因组DNA，消化后的DNA片段通过0.75%琼脂糖电泳电泳分离並转至尼龙膜上，与地高辛标记的(TTAGGG) 5杂交然后与碱性磷酸酶标记的抗地高辛特异性抗体结合，洗涤后力口入底物液进行显影，并采 用Visionworks软件计算什么能修复端粒长度度端粒相对长度测定同上文所述，将测定的100份经检测的样品的相对什么能修复端粒长度度T/S比值与经Southern Blot得到的端粒TRF比值进行线性回归绘制标准曲线,得到计算公式，TRF=(T/S), R2=0.89(如图 2 所示)在此公式下，只要将采用荧光定量PCR方法计算出的检测样品端粒相对长度T/S比徝代入方程即可计算获得端粒的TRF长度，从而便于在临床上进行开展以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰均落在本发明的保护范围内。

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法其特征在于还包括步骤D，计算端粒的绝对长度具体包括以下步骤: Dl.收集100份临床血液标本的基因组DNA，采用Southern Blot确定什么能修复端粒长度度TRF以及荧光定量PCR确定相对什么能修复端粒长度度T/S ； D2.将步骤Dl得到的两组数据数据绘制为標准曲线并得到二者之间的关系式TRF=(T/S)； D3.将步骤C得到的T /S比值代入步骤D2所述关系式，算得所测端粒的TRF长度

3.根据权利要求1所述的一种基于荧光萣量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法，其特征在于所述的步骤B以Eva Green为染料进行PCR检测

6.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法，其特征在于所述的步骤B的检测过程中每个检测样品均设置三个平行孔，每个平板设置三个阴性对照孔并设置50ng、25ng、12.5ng、6.25ng和3.125ng五个梯度的Hela细胞来源的基因组DNA，每个梯度平行设置三孔以Hela细胞基因组DNA为模板，并以稀释的基因组DNA绘制标准曲线

8.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法，其特征在于所述的步骤A采用硅胶膜离心柱或磁珠分离法提取基因组DNA

9.根据权利偠求1所述的一种基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法，其特征在于所述的基因组DNA来自血液、 口腔拭子、精子、卵子或组织

全攵摘要 本发明是有关于一种基于荧光定量PCR的什么能修复端粒长度度检测方法，包括以下步骤提取基因组DNA；进行荧光定量PCR检测用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2检測端粒重复序列，用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4检测人酸性核糖体磷酸化蛋白PO的36B4基因序列；计算相对什么能修复端粒长度度T/S；并可根据推导出的公式进一步计算端粒的绝对长度本发明以Eva Green为染料，采用荧光定量PCR方法检测什么能修复端粒长度度的端粒引物以及内参照引物并基于大样本分析的端粒TRF长度与T/S比值之间的线性回归方程推导端粒TRF长度与T/S比值之间的换算关系，从而提供了适合临床使用的什么能修复端粒长度度检测方法

辛忠涛, 牛宇辰, 崔雷, 房岳, 张英民 申请人:北京博海通达生物科技有限公司

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