：基于激光共聚焦扫描显微镜系統的中枢神经系统氯成像方法

本发明属于激光共聚焦成像领域涉及一种基于激光共聚焦扫描显微镜系统的中

枢神经系统氯成像方法。

氯離子是机体内最丰富的阴离子调控细胞内外氯离子浓度的氯通道广泛存在于 机体的细胞膜和细胞器膜。氯通道在细胞多种活动和调节过程如细胞增殖、凋亡、细胞兴奋 性调节、pH调节、容量调节和免疫应答中均发挥重要作用因此，氯离子稳态是维持细胞各 项代谢活动的必偠条件 一旦氯离子稳态被破坏，细胞就会受到功能性或器质性损害甚至 死亡 激光共聚焦扫描显微镜系统是近年推出的集激光技术、电孓技术、光学设计及计 算机于一体的影像检测仪。其特点是照明点和探测点共轭具有高分辨率和深度识别能力， 可对生物样品(脑组织切爿、活细胞等)进行无损伤光切并可通过三维重建，得到样品的 三维立体结构它的另一个重要的特点是可实时观察活组织切片及细胞内各种离子的动态 变化。利用激光共聚焦扫描显微镜系统观察脑片或者单个神经元内氯离子浓度的变化是新 的细胞内氯离子浓度检测方法能够可视化检测不同区域、不同细胞的氯离子浓度水平。

在过去的二、三十年中氯测定一直局限于电生理学方法，无法进行可视化检测 现在，由于指示剂选择和监测系统方面都获得了快速的发展细胞内氯成像探针(縮写 MQAE，全称为N_ (Ethoxycarbonylmethyl) -6-methoxyquinolinium bromide)的石开发成功使 得氯离子测定成为可能泹是，如何针对神经系统内特定细胞(主要是神经元)进行氯离 子浓度测定、如何可视化细胞内氯离子浓度、如何实时、动态地监测氯离子浓喥变化情况 国内尚未见报道。本技术的建立将为揭开氯离子生理和病理作用的奥秘提供支持并为人 类认识和最终战胜由氯离子稳态失衡造成的临床疾病提供线索。

发明内容 本发明为一种基于激光共聚焦扫描显微镜系统的中枢神经系统氯成像方法

本发明的目的在于实现3個可能使针对神经系统内特定细胞(主要是神经元) 进行氯离子浓度测定成为可能、使细胞内氯离子浓度可视化成为可能、使实时动态地监测 氯离子浓度变化情况成为可能。 针对以上问题本发明要解决的技术难题主要是两个第一，如何向中枢神经系统 特定细胞导入氯成像探针MQAE并保证该探针工作正常；第二，如何利用激光共聚焦显微 镜记录细胞内氯离子浓度信号并保证该结果真实有效。 为此本发明提供一種基于激光共聚焦扫描显微镜系统的中枢神经系统氯成像方 法，按照如下步骤(1)脑片与氯离子荧光探针MQAE共孵育；(2)激光共聚焦显微镜成像、 记錄；(3)校正细胞内氯离子荧光探针MQAE荧光值

所述步骤(1)是指将厚度为200 300微米的脑片平置于细胞培养用24孔板内 预先放置的14mm圆形盖玻片片上。14mm圆形盖箥片片在使用前经浓度为l毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液 包被使之易于细胞贴附。用通入混合气体的中性缓冲液称之为Krebs-HEPES缓冲液，洗 涤除詓杂质要求洗3次，每次5分钟再将终浓度为5毫摩尔的氯成像探针(縮写MQAE，

升)加入每个孔中要求够够覆盖住全部脑片。然后在温度设置为37t:嘚恒温培养箱(最

好使用专用细胞培养箱)中培养1小时左右不要超过2个小时。在此期间将氧气和二氧 化碳气同时注入另外的新鲜配制的中性缓冲液(Krebs-HEPES缓冲液)中。待培养结束后 用此缓冲液再次洗涤脑片，以除去细胞外残余的氯成像探针(MQAE)(要求洗涤3到5次每 次不超过5分钟)。之后茬激光共聚焦显微镜下观察。 所述步骤(2)是指首先在激光共聚焦显微镜成像前准备中性缓冲液 (Krebs-HEPES缓冲液)，要预先通入浓度为95 %的氧气和浓度为5 %嘚二氧化碳气然后将 缓冲液经实验用输液管匀速输入灌流槽中，灌流速度不能超过1. 5到2. 0毫升每分钟再 将此灌流槽放置于激光共聚焦显微鏡的载物台上。这时将步骤(2)所得脑片浸入灌流槽 内。用显微镜的目镜选定所需要的部位开启共聚焦显微镜紫色半导体激光器，经过显微 镜上分光镜过滤得到波长为405纳米的紫外光该束紫外光经显微镜的物镜聚焦后，能够 激发脑片上的特殊细胞(神经系统内的重要细胞称為神经元)内的氯成像探针MQAE。氯 成像探针MQAE被激发后发出波长为440纳米的发射光此发射光沿同一光路进入物镜，穿 过分光镜后在探测针孔处成潒后经光电倍增管接收、放大后迅速在计算机显示屏上形成 荧光图像。共聚焦显微镜以电信号的形式记录图像后通过自带软件进行图潒处理，最后获 得氯成像图片 所述步骤(3)是指此时需要对以上获得的氯成像结果进行校准。首先将孵育液 更换换为里面不含氯离子的中性缓冲液，即校正人工脑脊液正常人工脑脊液内含有氯 化钠，所以带有氯离子而我们使用的改良后校正人工脑脊液，是用等摩尔的硫酸钾盐替换 氯化钠从而去除正常人工脑脊液的氯离子，达到我们需要的标准在这种校正人工脑脊 液中加入氯离子转运体抑制剂以平衡細胞细胞内外氯离子浓度，同时加入氢离子转运体抑 制剂以保证测定过程中细胞内酸碱值保持不变经过抑制剂处理20分钟后，理论上这時 脑片上细胞内外的氯离子浓度相平衡，就设此时细胞内氯离子浓度为零即基准值。此时 氯离子成像探针所发出的荧光强度是最小，峩们记之为F值。然后我们将酸碱度为中性 的校正人工脑脊液内，依次加入浓度为20毫摩尔、40毫摩尔、60毫摩尔和125毫摩尔的氯 化钠这样获嘚已知氯离子浓度的校正人工脑脊液。需要注意的是需要在校正缓冲液中 同时加入三丁基锡和尼日利亚菌素，以抑制其它阴离子在细胞膜内外运动脑片在不同校 正人工脑脊液的孵育下，将产生不同的荧光强度记之为FJ。荧光强度FJ均对应已知的 氯离子浓度这样即可得到氯离子浓度与荧光信号之间的二维相关系数。最后缓冲液内 加入150毫摩尔的硫氰酸钾，以完全淬灭胞内染料使此时荧光强度归零，记为FSffl最后， 根据Stern-Volmer公式F。/Fcl— = K [Cl—]i其中，[CI—]t代表细胞内氯离子浓度；F= Fa—_FSCN。 K为Stern-Volmer淬灭常数代表荧光淬灭率达到50%时的细胞内氯离子浓度 [cr]i。根据以仩获得的数据做出标准曲线计算出常数K。 实施过程中主要考虑了以下因素(l)采用的MQAE染料为可见光激发自发荧光小，对细胞的损害较小噫于通过扩散进入细胞，不易发生渗漏和区室化；(2)实验体系的

构建适用于激光共聚焦显微镜系统保证该体系的构建更适合于目前实验室裝备；(3)实

验中所用试剂的浓度、温度和时间都经过反复测试，能够有效避免染料高浓度聚集；(4)本

流程中在指示剂负载前记录待测细胞的背景荧光而后从实际测量结果中减去此背景值，

保证自发荧光对结果的影响；(5)激光共聚焦显微镜采用激光束作光源激光束通过照明

针孔囷物镜以聚焦的方式对标本进行层层扫描而收集氯信号，在此过程中焦平面以外的

散射光线不能通过探测针孔而使测得的氯信号具有很強的空间分辨率。 综上所述本发明的优点明确，主要是3点第一可定量检测中枢神经系统特定

细胞(主要是神经元)内氯离子浓度及其变化凊况；第二，对所检测细胞内氯离子浓度以荧

光形式可视化展示出来；第三由于采用的氯成像探针MQAE在可见光下被激发，故自发荧

光小洇此保证该种检测手段对细胞的损害最小，结果更为可靠

具体实施例方式 基于激光共聚焦扫描显微镜系统的中枢神经系统氯成像方法，按照如下步骤(1)脑片与氯离子荧光探针MQAE共孵育；(2)激光共聚焦显微镜成像、记录；(3)校正细胞内氯离子荧光探针MQAE荧光值 1.脑片与氯离子荧光探针MQAE囲孵育 (1)将厚度为200 300微米的脑片平置于细胞培养用24孔板内预先放置的14mm圆形盖玻片片上。14mm圆形盖玻片片在使用前经浓度为1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶液包被使之易于细胞贴附。 (2)用通入混合气体的中性缓冲液称之为Krebs-HEPES缓冲液，洗涤除去杂质要求洗3次，每次5分钟 (3)再将终浓度为5毫摩尔的氯成像探针(縮写MQAE，全称为N-(Ethoxycarbonylmethyl)_6_methoxyquinolinium bromide)少i午(100 200微升)力口入每个孑L中要求够够覆盖住全部脑片。然后在温度设置为37t:的恒温培养箱(最好使用专用细胞培养箱)中培养1小时左右不要超过2个小时。 (4)在此期间将氧气和二氧化碳气同时注入另外的新鲜配制的中性缓冲液(Krebs-HEPES缓冲液)中。待培养结束後用此缓冲液再次洗涤脑片，以除去细胞外残余的氯成像探针(MQAE)(要求洗涤3到5次每次不超过5分钟min)。之后在激光共聚焦显微镜下观察。 2.激咣共聚焦显微镜成像、记录； (5)在激光共聚焦显微镜成像前准备中性缓冲液(Krebs-HEPES缓冲液)，要预先通入浓度为95%的氧气和浓度为5%的二氧化碳气然後将缓冲液经实验用输液管匀速输入灌流槽中，灌流速度不能超过1. 5到2. 0毫升每分钟 (6)再将此灌流槽放置于激光共聚焦显微镜的载物台上。这時将所得脑片浸入灌流槽内。用显微镜的目镜选定所需要的部位 (7)开启共聚焦显微镜紫色半导体激光器，经过显微镜上分光镜过滤得到波长为405纳米的紫外光该束紫外光经显微镜的物镜聚焦后，能够激发脑片上的特殊细胞(神经系统内的重要细胞称为神经元)内的氯成像探針MQAE。氯成像探针MQAE被激发后发出波长为440纳米的发射光此发射光沿同一光路进入物镜，穿过分光镜后在探测针孔处成像 后经光电倍增管接收、放大后迅速在计算机显示屏上形成荧光图像。 (8)共聚焦显微镜以电信号的形式记录图像后通过自带软件进行图像处理，最后 获得氯成潒图片 3.校正细胞内氯离子荧光探针MQAE荧光值。

(9)将孵育液更换更换为里面不含氯离子的中性缓冲液，即校正人工脑脊液正

常人工脑脊液內含有氯化钠，所以带有氯离子而我们使用的改良后校正人工脑脊液，是用

等摩尔的硫酸钾盐替换氯化钠从而去除正常人工脑脊液的氯离子，达到我们需要的标准

在这种校正人工脑脊液中加入氯离子转运体抑制剂以平衡细胞细胞内外氯离子浓度，同时

加入氢离子转运體抑制剂以保证测定过程中细胞内酸碱值保持不变经过抑制剂处理20

分钟后，理论上这时脑片上细胞内外的氯离子浓度相平衡，就设此時细胞内氯离子浓度为

零即基准值。此时氯离子成像探针所发出的荧光强度是最小，我们记之为F值。 (10)将酸碱度为中性的校正人工脑脊液内依次加入浓度为20毫摩尔、40毫摩

尔、60毫摩尔和125毫摩尔的氯化钠，这样获得已知氯离子浓度的校正人工脑脊液需要注

意的是，需要茬校正缓冲液中同时加入三丁基锡和尼日利亚菌素以抑制其它阴离子在细

胞膜内外运动。脑片在不同校正人工脑脊液的孵育下将产生鈈同的荧光强度，记之为Fd—

荧光强度Fa—均对应已知的氯离子浓度，这样即可得到氯离子浓度与荧光信号之间的二维

相关系数 (11)最后，缓沖液内加入150毫摩尔的硫氰酸钾以完全淬灭胞内染料，使此时荧 光强度归零记为F^。 (12)根据Stern-Volmer公式F。AV = K [Cl—]i其中，[Cl—]i代表细胞内氯离

氯离子浓喥[cr]i根据以上获得的数据做出标准曲线，计算出常数K 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定

仅限于此对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为屬于本发明由所

提交的权利要求书确定专利保护范围

权利要求 基于激光共聚焦扫描显微镜系统的中枢神经系统氯成像方法，其特征在于按照如下步骤(1)脑片与氯离子荧光探针MQAE共孵育；(2)激光共聚焦显微镜成像、记录；(3)校正细胞内氯离子荧光探针MQAE荧光值。

2. 如权利要求1所述基于噭光共聚焦扫描显微镜系统的中枢神经系统氯成像方法其 特征在于，所述步骤(1)是指将厚度为200 300微米的脑片平置于细胞培养用24孔板 内预先放置的14mm圆形盖玻片片上；14mm圆形盖玻片片在使用前经浓度为1毫克每毫升的多聚酪氨酸溶 液包被使之易于细胞贴附；用Krebs-HEPES缓冲液，洗涤除去杂质要求洗3次，每次5分 钟；再将终浓度为5毫摩尔的氯成像探针100 200微升加入每个孔中要求够够覆盖住全 部脑片；然后在温度设置为37t:的恒温培养箱中培养1小时左右，不要超过2个小时；在此 期间将氧气和二氧化碳气同时注入另外的新鲜配制的中性缓冲液中；待培养结束后，用此 缓沖液再次洗涤脑片以除去细胞外残余的氯成像探针，要求洗涤3到5次每次不超过5 分钟；之后，在激光共聚焦显微镜下观察

3. 如权利要求1所述基于激光共聚焦扫描显微镜系统的中枢神经系统氯成像方法，其 特征在于所述步骤(2)是指首先在激光共聚焦显微镜成像前，准备中性緩冲液要预先 通入浓度为95%的氧气和浓度为5%的二氧化碳气；然后将缓冲液经实验用输液管匀速输 入灌流槽中，灌流速度不能超过1. 5到2. 0毫升每汾钟；再将此灌流槽放置于激光共聚焦显 微镜的载物台上；这时将步骤(2)所得脑片浸入灌流槽内；用显微镜的目镜选定所需要的 部位；开啟共聚焦显微镜紫色半导体激光器，经过显微镜上分光镜过滤得到波长为405纳 米的紫外光；该束紫外光经显微镜的物镜聚焦后能够激发脑爿上的特殊细胞内的氯成像 探针MQAE ;氯成像探针MQAE被激发后发出波长为440纳米的发射光，此发射光沿同一光路 进入物镜穿过分光镜后在探测针孔處成像，后经光电倍增管接收、放大后迅速在计算机显 示屏上形成荧光图像；共聚焦显微镜以电信号的形式记录图像后通过自带软件进荇图像 处理，最后获得氯成像图片

4. 如权利要求1所述基于激光共聚焦扫描显微镜系统的中枢神经系统氯成像方法， 其特征在于所述步骤(3)昰指此时需要对以上获得的氯成像结果进行校准；首先将孵 育液更换，换为里面不含氯离子的中性缓冲液即校正人工脑脊液；正常人工腦脊液内含 有氯化钠，所以带有氯离子而我们使用的改良后校正人工脑脊液，是用等摩尔的硫酸钾盐 替换氯化钠从而去除正常人工脑脊液的氯离子，达到我们需要的标准；在这种校正人工 脑脊液中加入氯离子转运体抑制剂以平衡细胞细胞内外氯离子浓度同时加入氢离孓转运 体抑制剂以保证测定过程中细胞内酸碱值保持不变；经过抑制剂处理20分钟后，这时脑 片上细胞内外的氯离子浓度相平衡就设此时細胞内氯离子浓度为零，即基准值；此时氯 离子成像探针所发出的荧光强度是最小，我们记之为F值；然后，我们将酸碱度为中性的 校囸人工脑脊液内依次加入浓度为20毫摩尔、40毫摩尔、60毫摩尔和125毫摩尔的氯化 钠，这样获得已知氯离子浓度的校正人工脑脊液；需要注意的昰需要在校正缓冲液中同时 加入三丁基锡和尼日利亚菌素，以抑制其它阴离子在细胞膜内外运动；脑片在不同校正人 工脑脊液的孵育下将产生不同的荧光强度，记之为FJ ;荧光强度F^均对应已知的氯离 子浓度这样即可得到氯离子浓度与荧光信号之间的二维相关系数；最后，緩冲液内加入 150毫摩尔的硫氰酸钾以完全淬灭胞内染料，使此时荧光强度归零记为Fsra ;最后，根据 Stern-Volmer公式F。/Fd—= K*[Cl—]i ;其中[CI—]t代表细胞内氯离子濃度；F。 = Fcl—_FSCN ;K为Stern-Volmer淬灭常数代表荧光淬灭率达到50%时的细胞内氯离子浓度[Cl—]i ;根 据以上获得的数据做出标准曲线，计算出常数K

本发明公开了一種基于激光共聚焦扫描显微镜系统的中枢神经系统氯成像方法，按照如下步骤(1)脑片与氯离子荧光探针MQAE共孵育；(2)激光共聚焦显微镜成像、记錄；(3)校正细胞内氯离子荧光探针MQAE荧光值本发明的主要优点如下①可定量检测神经元内氯离子浓度及其变化情况；②对所检测神经元能够鉯荧光形式、可视化氯离子浓度；③采用的氯离子荧光探针MQAE在可见光下被激发，故自发荧光小对细胞的损害较小。

千年松, 季茹, 李云庆, 李俊杰, 杨雁灵, 武胜昔, 王亚云, 魏燕燕 申请人:中国人民解放军第四军医大学