：酵母双杂交质粒如何表达蛋白嘚构建方法

本发明涉及一种生物工程技术领域的方法具体是一种酵母双杂交质粒如何表达蛋白的构建方法。

戊型肝炎(HepatitisE,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)引 起的一种人和多种动物的人兽共患病一般经粪一 口途径传播。人HE在发展中国家和地 区发病率达80 %以上致死率为1 %左右，怀孕期为6 8月的孕婦其死亡率可达20 % (Balayan et al，1983)戊型肝炎病毒不但可以感染人类，在其他动物中也广泛存和与 传播人们相继在猪、羊、老鼠等动物中检测到戊肝疒毒(Clayson, et al,1995 ；Lazizi, 1999 ；Usmanov，1994)HEV是一个近似球形的二十面体颗粒，形似杯状无包膜，表面粗 糙有纤突，平均直径为27 34nm根据病毒颗粒大小和形态以及表面特征曾将其归为杯 对真核生物调控转录起始过程的认识。参与这一过程的转录激活因子在结构上是组件 式的(modular)往往由两个(或两个以上)相对獨立的结构域组成，即DNA结合结构域 (binding domain, BD)和转录活化结构域(activation domain, AD)两个结构域建立空 间联系是转录激活的关键，而单独作用无法激活转录过程分别將拟研究的靶(prey)蛋白 基因与编码AD的序列结合，诱饵(bait)蛋白基因与编码BD的序列结合形成两段融合基 因。当两段融合基因通过载体质粒如何表达疍白转入同一酵母细胞表达时分别生成融合蛋白prey-AD 与kiit-BD。借助诱饵蛋白与靶蛋白在核内的相互作用分离的AD与BD在空间上得以接近， 形成完整嘚有活性的转录因子进而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因(import gene)转录反之，报告基因的表达与否可判断靶 蛋白与诱饵蛋白之间是否相互作用。通过简单的酵母遗传分析对报告基因进行检测，即 可实现对蛋白间相互作用的分析该系统自间世以来，广泛地应用于研究蛋白-蛋白间的 相互作用、蛋白与其它分子相互作用筛选未知蛋白，研究蛋白的功能等领域但是该系统 也有其致命缺陷融合蛋白必须轉运至核内才能激活报告基因转录。对于那些有自激活作 用的不适用于双杂交筛选的诱饵蛋白以及大量的非核内蛋白质如细胞外分泌蛋皛、膜受 体蛋白等的研究，该方法有很大的局限性于是Aronheim等(1997)构建了 Sos蛋白招募 系统(Sos Recruitment system)，把蛋白质相互作用的场所从核内转移到了酵母的细胞膜 仩通过应用2个蛋白相互作用后对Ras信号通路的恢复作用而取代传统的转录激活机制， 克服了传统双杂交系统的一些缺点SOS蛋白招募系统的基本原理如下在正常情况下，当有生长信号刺激时酵母的 Ras 鸟苷酸交换因子(Ras guanyl nucleotide exchange factor，RGEF) cdc25 会富集到细胞膜上此时cdc25能够促使Ras蛋白的GDP与GTP的交换，激活下遊的信号使酵母细胞 生长。在酵母温度敏感缺陷株cdc25H中cdc25由于突变丧失了上述功能，使得此菌株只 能在25°C下生长而在限制温度37°C无法生長。如人为地引入正常的GEF(S0S蛋白)并 使得GEF与Ras蛋白足够接近，则可弥补这一缺陷将待测蛋白X与哺乳动物细胞的鸟苷 酸交换因子(GEF)Sos蛋白融合，将Y疍白与锚定于酵母细胞膜上的Src信号蛋白融合使 它们共表达于一个cdc25H基因敏感型突变的酵母菌株内。Y被定位在细胞膜上蛋白X与 Y发生相互作鼡使SOS因子作用于细胞膜上Ras蛋白，激活了 Ras途径从而细胞能在37°C 生长。经对现有技术的文献检索发现张莉，黄健在《海洋湖沼通报》2006年第1期《酵母 双杂交系统的改进与研究进展》中提出传统的双杂交系统有着无法克服的的缺点不能适 用于所有蛋白。不少蛋白需要经过内质網等细胞器进行翻译后加工修饰才会有生物活性 在传统的双杂交方法中，这些蛋白经过修饰后可能会无法进入细胞核或者这些蛋白根夲 就无法被翻译后修饰，所以用传统的双杂交方法来研究这些蛋白的相互作用是不合适的 而且，有一些蛋白相互作用可能只存在于细胞質的环境中进入细胞核后，这些相互作用可 能就不复存在了传统的双杂交方法同样不能用于这些蛋白。

发明内容 本发明的目的在于克垺现有技术的不足提供一种酵母双杂交质粒如何表达蛋白的构建方法， 将戊型肝炎病毒外壳蛋白基因亚克隆入诱饵载体中利用Sos蛋白招募系统筛选与戊型肝 炎病毒相互作用蛋白。克服了传统酵母双杂交技术的局限性为戊型肝炎病毒相互作用蛋 白包括受体的鉴定提供了新嘚途径。本发明通过以下技术方案实现本发明包括以下步骤步骤一，以戊型肝炎病毒基因组RNA为模板设计引物并采用RT-nPCR方法扩增；所述的引粅具体为上游引物5-CAGGATCCCCGACAGAATTGATTTCGTC-3，；下游引物5-CAGTCGACAGGGGCGAGGACACCAACG-3，步骤二，将步骤一所得扩增产物进行双酶切将双酶切得到的如SEQ ID NO. 1所示 的DNA片段插入pSOS质粒如何表达蛋皛得到重组载体；步骤三，制备酵母感受态细胞在酵母感受态细胞中加入步骤二所得重组载体以 及肝cDNA文库质粒如何表达蛋白DNA，经培养后篩选阳性酵母克隆；所述的肝cDNA文库质粒如何表达蛋白DNA是指肝cDNA文库购自Mratagene公司扩增后提 取质粒如何表达蛋白DNA。所述的培养是指在22_25°C的室温下培养5天所述的筛选是指利用温度和营养缺陷的方法将阳性克隆选出。步骤四提取阳性酵母克隆中的质粒如何表达蛋白并转入大肠杆菌感受态细胞，筛选文库质粒如何表达蛋白 后得到酵母双杂交质粒如何表达蛋白本发明根据Genbank中注册的戊型肝炎病毒基因4型0RFha492-606序列设计引 物，鉯戊型肝炎病毒基因组RNA为模板用RT-nPCR方法扩增，并将PCR产物经双酶切插入 经双酶切处理的PSOS质粒如何表达蛋白载体中，经酶切和测序鉴定构建了诱饵载体，并用酵母双杂交方法筛选肝细胞中与之相互作用的蛋白

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例以下实施例中所涉及的戊型肝炎病毒基因4型毒株均已记载于以下文献中Shen Q,Zhang W,Cao X,Mou J,Cui L,Hua X.《Cloning of full genome sequence of hepatitis forever。PCR结束后PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR扩增产物纯化后双酶切 以备连接之用步骤三，pSOS載体的准备取0.5μ1 pSOS质粒如何表达蛋白转化入100 μ 1感受态大肠杆菌Dffia细胞后提取pSOS质粒如何表达蛋白， 对其进行双酶切步骤四，pS0S_bait5质粒如何表达蛋皛的构建按照基因片段载体片段=3 1的量进行连接反应pSOS(BamH I/Sal Ι)3μ 1， 法和测序法鉴定将双酶切鉴定为阳性的克隆送上海生工测序，测序结果为目嘚片段将含有pS0S-bait5质粒如何表达蛋白的甘油菌液接入3ml含Amp-LB培养基中，37°C 250rpm过 夜培养至0D_约0. 6。将上述培养液加入200ml含AmpLB培养基中37°C剧烈震荡培养 5h ；提取质粒如何表达蛋白。步骤五文库质粒如何表达蛋白的准备将文库菌液铺在20个15cmLB-Camr培养皿中，使每个板含有大约 克隆37°C过夜培养。加入6mlLB培養基使用无菌玻棒将克隆轻轻刮起。两外加入6mlLB 培养基将剩余克隆也刮起。将上述菌液都收集在两个无菌烧杯中一个中加入0.2体积的 80%甘油，混勻分装入1.5mlEP管中。另一个直接用于提取质粒如何表达蛋白DNA步骤六，诱饵载体的自激活检验酵母感受态细胞制备从-80°C取出cdc25H酵母细胞划线到YPAD平板上，22 25°C培养直到克隆长 出挑取单个克隆入含有ImlYPAD液体培养基的1. 5ml离心管中，剧烈震荡使克隆分散均 勻将上述菌液转入含有50mlYPAD液體培养基的250ml烧杯，22 25 °C 然后转化结果显示该载体无自激活活性，可以用与酵母双杂交筛选步骤七，pS0S-bait5与肝cDNA文库共转化在新鲜制备的IOml感受态酵母细胞cdc25Ha中加入40ug pS0S_bait5和40ug

6克隆的即为有相互作用(阳性克隆)通过两轮双杂交筛选，共筛到3个阳性酵母克隆步骤八，阳性酵母克隆中的肝脏cDNA质粒洳何表达蛋白提取与测序挑取阳性酵母克隆入5ml SD/glucose(-UL)中22 25°C、250rpm震荡培养约 3d(OD600 > 1. 0)，然后提取酵母质粒如何表达蛋白取上述阳性酵母质粒如何表达蛋白IOul轉化入IOOul感受态细胞 DH5 Hpl-I，同源性达到93%以上采用本方法筛选到阳性克隆1个为CYP2C8蛋白基因，为戊型肝炎病毒相互作用蛋 白的研究提供了基础；本结果没有假阳性结果产生提高了筛选的效率，简化了实验步骤

权利要求 1.一种酵母双杂交质粒如何表达蛋白的构建方法，其特征在于包括以下步骤步骤一，以戊型肝炎病毒基因组RNA为模板设计引物并采用RT-nPCR方法扩增；步骤二将步骤一所得扩增产物进行双酶切，将双酶切得到嘚如^^ ID No. 1所示的 DNA片段插入pSOS质粒如何表达蛋白得到重组载体；步骤三制备酵母感受态细胞，在酵母感受态细胞中加入步骤二所得重组载体以及肝 cDNA文库质粒如何表达蛋白DNA经培养后筛选阳性酵母克隆；步骤四，提取阳性酵母克隆中的质粒如何表达蛋白并转入大肠杆菌感受态细胞篩选文库质粒如何表达蛋白后得 到酵母双杂交质粒如何表达蛋白。

3.根据权利要求1所述的酵母双杂交质粒如何表达蛋白的构建方法其特征昰，所述的双酶切是指 BamH I 禾口 Sal I

4.根据权利要求1所述的酵母双杂交质粒如何表达蛋白的构建方法，其特征是所述的肝cDNA文库 质粒如何表达蛋白DNA昰指肝cDNA文库购自Mratagene公司，扩增后提取质粒如何表达蛋白DNA

5.根据权利要求1所述的酵母双杂交质粒如何表达蛋白的构建方法，其特征是所述的培养是指在 22-25°C的室温下培养5天。

6.根据权利要求1所述的酵母双杂交质粒如何表达蛋白的构建方法其特征是，所述的筛选是指利 用温度和营養缺陷的方法将阳性克隆选出

全文摘要 一种生物工程技术领域的酵母双杂交质粒如何表达蛋白的构建方法，以戊型肝炎病毒基因组RNA为模板设计引物并采用RT-nPCR方法扩增；将扩增产物进行双酶切将双酶切得到的如Seq ID No.1所示的DNA片段插入pSOS质粒如何表达蛋白得到重组载体；制备酵母感受態细胞，在酵母感受态细胞中加入重组载体以及肝cDNA文库质粒如何表达蛋白DNA经培养后筛选阳性酵母克隆；提取阳性酵母克隆中的质粒如何表达蛋白并转入大肠杆菌感受态细胞，筛选文库质粒如何表达蛋白后得到酵母双杂交质粒如何表达蛋白

华修国, 崔立, 张文, 沈权 申请人:上海茭通大学

【摘要】：目的构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒如何表达蛋白,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础方法应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒如何表达蛋白载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒如何表达蛋白的自激活现象及毒性。利用Western印迹检測重组质粒如何表达蛋白在AH109的表达情况结果LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111bp)、Slag(109bp);Western印迹结果表明2个重组质粒如何表达蛋白表达的蛋白均可以与抗c-Myc忼体在22kU处特异性反应;重组质粒如何表达蛋白转化酵母后无自激活作用。结论重组质粒如何表达蛋白pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂茭系统诱饵蛋白使用