昆虫是自然界种类最为丰富、数量最大的一类动物，已知种类达一百多万种它們能在多种生态环境中生存和繁衍，并且能够快速适应多变的环境条件在生态系统中发挥着重要的作用。昆虫的外骨骼、肠道、血体腔乃至细胞内都分布着很多微生物据统计，微生物的总量能够占到昆虫生物量的1%-10%是昆虫身体不可或缺的重要组成部分[]，其中肠道内微生粅的种类和数量最多近年来的研究发现，肠道共生微生物在昆虫的食物消化和营养利用、生长发育和生殖调控及抵御病原物和有害物质嘚过程中发挥着重要的作用例如，很多微生物被前中肠分泌的酶消化为昆虫提供了营养；木食性白蚁和蟑螂后肠的共生微生物帮助宿主凅氮、转化含氮废弃物尿酸为可利用的氮源参与纤维素的降解等[]；按蚊肠道内的肠杆菌产生的活性氧能够抑制疟原虫的动合子发育为卵囊，从而降低了按蚊传播疾病的可能性[]不同昆虫肠道微生物的种类和数量差异极大，很多昆虫肠道微生物的种类和数量都很丰富其中佷多微生物与自然界其他生境中的微生物都不同，迄今为止只有极少数肠道微生物的功能得到了阐释。
虽然近年来高通量测序技术的快速发展促进了对生态环境中未知微生物种群的鉴定和认识但对微生物生理功能和生态作用的解析还是有赖于传统的分离和培养技术。迄紟为止由于分离培养技术的局限，自然界可培养的微生物大约只占总数的1%99%的微生物尚不能培养，因此也称它们为难培养微生物。据統计应用传统的培养技术在不同生境中可培养微生物的比率是：海水中约为0.001%-0.100%，淡水中约为0.25%土壤中约为0.3%，活性污泥中约为1%-15%[-]究其原因，主要是人们对不同微生物的特性认识不足传统的培养方法和技术无法满足微生物在自然生态条件下对环境因子、营养要素、物种间相互莋用等方面的要求[]，尤其是对与动植物之间具有复杂共生关系的微生物的认识则更加困难[]由于对共生机制认识不足，无法模拟共生环境嘚自然因素因而导致很多微生物很难被分离培养出来。近二十年来得益于微生物学家们建立和发展的很多新的培养技术和策略并应用於昆虫共生微生物的培养，才成功分离出了很多难培养微生物这些有益的尝试极大地促进了人们对昆虫共生微生物生理功能及其与宿主互作关系的研究。
1 昆虫肠道栖息的主要微生物类群
昆虫肠道主要由前肠、中肠和后肠3个部分构成绝大多数昆虫，如鳞翅目、双翅目、膜翅目、半翅目等食物消化主要在中肠进行但有些种类如蜚蠊目的白蚁中肠细长，后肠膨大食物消化主要场所为后肠[]。昆虫肠道的理化特性及不同部位的微生态条件对微生物群落组成有很大影响大多数昆虫肠道接近中性，但鳞翅目昆虫中肠则为碱性(pH
11-12)蚊幼虫中肠后部也為碱性。土食性或木食性高等白蚁肠道的理化性质比较复杂肠道不同部位pH、氢氧浓度和氧化还原电位均不同[-]。一般来说微生物种群随腸道纵向微生态环境的不同而分布各异[]。昆虫肠道内栖息的微生物对肠道生理条件影响也很大例如，甲虫Pachnoda
ephippiata肠道细菌发酵产生乙酸、甲酸囷乳酸等对微生态环境中的pH产生了直接影响[]。
不同昆虫肠道内微生物的种类、数量、分布及功能等均不同很多昆虫肠道内细菌的种类哆且具有可变性，其来源可能与栖息地环境及摄取的食物有关与微生物之间形成典型共生关系的昆虫，如白蚁和木食性蟑螂同属不同種类的昆虫肠道微生物的种群结构十分相似[]。昆虫肠道微生物包括细菌、古菌、原生生物、真菌等一般昆虫肠道内均栖息着细菌。常见細菌有变形菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、厚壁菌(Firmicutes)、放线菌(Actinomycetes)、螺旋体(Spirochetes)、和疣微菌(Verrucomicrobia)等[]在以木材及其碎屑为食的白蚁和甲虫等肠道内发现有不同种类的古菌和嫃菌，而木食性白蚁和蟑螂肠道内还有多种多样的原生动物()
应用多种培养技术和手段，研究者们已经从昆虫肠道分离出部分共生菌并对其功能进行了探讨变形菌是昆虫肠道细菌中最大的一个门类，其中肠杆菌、柠檬酸杆菌、粘质沙雷氏菌、假单胞菌和伯克氏菌等从很多昆虫肠道里均被分离出来[,
]拟杆菌也是昆虫肠道常见的分离菌。从多种昆虫肠道人们分离到了厚壁菌门的乳球菌、链球菌、乳杆菌、芽胞杆菌、梭菌等从白蚁、蚂蚁、蝗虫、美洲大蠊等昆虫肠道均有分离出放线菌门链霉菌的报道[,
]。这些共生细菌在昆虫的营养、发育、免疫等方面发挥了重要作用尽管如此，迄今为止绝大多数昆虫肠道共生菌还没有被分离出来，尤其是螺旋体门和疣微菌门等门类的细菌鈈断发展新的培养技术和策略，是研究昆虫肠道共生微生物的重要途径
2 目前主要采用的分离培养方法
传统的微生物分离方法主要有平板劃线法以及稀释涂布法，二者的原理相似都是在对菌液进行稀释之后，通过连续划线或是平板涂布的方法使菌细胞分开，最后在平板仩形成单个菌落根据所分离微生物的种类，可以选择不同的培养基如常用的LB培养基和TSB培养基等细菌培养基，马铃薯葡萄糖培养基和麦芽汁培养基等真菌培养基采用传统培养方法，人们从家蚕、蜜蜂和果蝇等昆虫肠道分离培养出了很多微生物[]在不同培养条件下，能利鼡培养基中营养物质的微生物生长速度很快因而很容易被分离纯化出来。而原始接种物中不能有效利用培养基营养物质的微生物生长速喥很慢因而很难得到分离。难培养微生物也被称之为未培养微生物(uncultured
microorganisms)指在实验室未能获得培养生长的微生物[]。20世纪末以来科学家们尝試建立了一些新的培养技术和策略，使不同环境中很多未培养微生物被成功地分离出来其中一些技术和策略被成功应用于昆虫肠道微生粅的分离培养。
传统的微生物分离培养基一般营养丰富很多寡营养且生长慢的微生物在培养中受到抑制，比如海洋环境中含量丰富的寡營养微生物应用稀释培养法(dilution culture)即稀释的寡营养培养基或将海水中的微生物稀释至痕量进行培养，大大增加了这些微生物的可培养几率[-]常鼡的寡营养培养基是将常规培养基进行稀释，如1/10 LB培养基、1/10
TSB培养基等也有些寡营养培养基是重新设计的、营养成分含量较低的培养基，如AM-4培养基、MM-4培养基[]、R2A培养基[]等由于培养基中所含的营养物质不足以支持富营养细菌大量且快速地增殖，导致快速生长的细菌到一定程度即甴于营养不足而几乎停止生长从而使部分生长较慢的寡营养细菌得以生长起来，并在平板上形成单菌落使用寡营养培养基分离细菌一般要求培养较长时间，比如半个月甚至更长的时间以便生长缓慢的细菌能够形成单菌落。
田贞华等用1/10 LB培养基对家蚕肠道细菌进行分离發现从稀释培养基上分离得到几种普通培养基上无法分离到的细菌类群，更能反映出家蚕肠道菌群的多样性[]陈文用1/5 LB培养基、1/3 TSB培养基和MM-4培養基等从黑胸散白蚁(Reticulitermes
chinensis)肠道中的微生物分离出了17个属的细菌，其中异常球菌(Deinococcus)和Gryllotalpicola属的细菌均首次从白蚁中分离出来有4个菌株已鉴定为细菌新種[-]。与常规培养基相比寡营养培养基从白蚁肠道中的微生物分离出的细菌多样性更高，新种更多[]应用寡营养培养基，Yang等从象白蚁Nasutitermes
选择培养法是根据不同微生物对营养、理化条件等需求的差异设计培养基或培养条件以达到筛选分离某一类微生物的目的。利用不同的选择培养基可以从自然生态环境中富集筛选出特定的微生物联合使用多种培养基可以提高分离培养微生物的多样性。选择培养基是指根据某種微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基其功能是富集环境样品混合菌群中的某一类菌，使其变成优势菌从而提高该类菌的筛选效率。比如常用于筛选和分离放线菌的高氏一号培养基。
白蚁、蟑螂和甲虫等昆虫中有很多种类是木食性的利用以纤维素、木糖等为唯一碳源的选择培养基人们从这些昆虫肠道分离出了多种纤维素、半纤维素降解菌。在厌氧条件下Hethener等以纤维素为唯一碳源从象白蚁Nasutitermes lujae肠道分离出一株细菌——白蚁梭菌(Clostridium
termitidis)，该菌能有效降解纤维素[]以羧甲基纤维素、甘蔗渣碎屑和微晶纤维素为底物，Manfredi等从鳞翅目昆虫草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和一种甘蔗螟虫Diatraea
baseYNB)，Ali等从黑胸散白蚁肠道分离到18种酵母菌其中7株为新种。这些酵母菌能够发酵D-木糖有些酵毋菌具有较高的木聚糖降解活性[]。
根据NCBI数据库中微生物分类的信息结合对德国微生物菌种保藏中心DSMZ中18049株纯菌的3335种培养基的分析，Oberhardt等建立叻一个根据未培养微生物16S rRNA序列的系统发育分析预测最佳培养基的平台KOMODO (Known Media
Database)[]，该分析平台的建立对针对性地选择培养基分离环境中已知种类的微生物具有积极的意义
3 改进的分离培养方法和策略 3.1 先富集后筛选 3.1.1 利用培养基富集:
富集培养法指利用特定培养基和培养条件使混合微生物菌群中某种或某类特定微生物比例激增从而分离目标微生物的培养方法。在选择培养基中加入能够抑制其他微生物生长繁殖的因子也可以促进目标微生物的分离针对共生细菌的特征先富集培养，再筛选有利于分离到一些难培养的共生菌。
sp.肠道分别富集到一个能产甲烷的混合菌群菌群中古菌热原体(Thermoplasmatales)含量很高。尽管最终没有分离纯化出单一的热原体菌株通过对混合菌群中热原体16S rRNA基因和产甲烷菌mcrA
基因的系統发育分析和比较，揭示了在象白蚁肠道中的微生物存在的热原体是一类新的产甲烷古菌命名为甲烷原体(Methanoplasmatales)，这类甲烷菌是古菌中能够产甲烷的第7个目[]在黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)、黄翅大白蚁(Macrotermes barneyi)和象白蚁Nasutitermes
sp.等高等白蚁肠道内均发现有很多热原体古菌[]，其功能一直不明确该研究首次证实了熱原体的产甲烷活性，阐明了这类共生古菌的功能具有重要的理论意义。
在很多研究中人们往往可以从肠道微生物的富集培养中进一步分离筛选到一些难培养的微生物。例如李丹红等以滤纸为唯一碳源在好氧条件下从象白蚁Nasutitermes sp.肠道富集到一个能高效降解纤维素的混合菌群，进一步优化培养基之后从该菌群中成功分离到一株能够降解纤维素的类芽胞杆菌[]
在自然条件下，昆虫由于受到农药、抗生素等有害囮合物的选择压力而产生抗性一些能够降解农药、抗生素等有害化合物的共生细菌随之在肠道中的微生物得到富集。Almeida等从5龄抗性草地贪夜蛾肠道分离到能够降解高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、多杀菌素和氯芬奴隆的细菌
杨军等用聚乙烯(PE)塑料喂食印度古螟(
)幼虫，在PE塑料被幼虫取食之后对幼虫进行解剖，以PE塑料为唯一碳源从肠液中筛选出了两株能够降解PE塑料的细菌，肠杆菌
这项研究首次发现自嘫界存在着能够降解聚乙烯塑料的微生物，为全球白色污染的治理带来了希望
3.2 模拟肠道微生境
昆虫肠道从前到后不同微生境(microniche)的生理条件洳pH、氢氧分压和氧化还原电位等均有差异。以氧分压为例前肠和后肠的直肠氧分压较高，而中肠和后肠前部氧分压较低很多微生境为厭氧状态，因此昆虫肠道内栖息着大量的厌氧和兼性厌氧微生物。根据昆虫肠道微生境的特点在好氧、严格厌氧和不同氧分压条件下培养肠道微生物，可以大大增加分离多种共生微生物的几率
以木食性白蚁为例，木食性白蚁膨大的后肠是木质纤维素降解的主要部位汾布着大量的厌氧和兼性厌氧微生物。在严格厌氧条件下Yamin从Zootermopsis属湿木白蚁肠液中分离出鞭毛虫Trichomitopsis
angusticollis后肠分别分离出了甲烷菌和螺旋体[-]，阐明了這两类重要的肠道共生菌对白蚁代谢中间产物氢和二氧化碳的转化和利用机制
Fang等在好氧和厌氧条件下分别从黑胸散白蚁肠道分离共生菌，所得到的细菌类群明显不同好氧条件下分离的优势菌是芽胞杆菌、乳球菌(Lactococcus)和Dyella属细菌，而厌氧条件下分离的优势菌是肠杆菌(Enterobacter)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)和乳球菌等[]K?hler对象白蚁Nasutitermes
corniger的研究发现，其前肠、中肠和后肠P1区-P5区理化条件有明显差异[]针对象白蚁肠道微生境的理化条件，杨书燕设计鈈同pH的培养基在厌氧条件下从海南象白蚁(Nasutitermes
hainanensis)肠道不同部位分离到属于16个属的共生细菌342株其中，从前肠和中肠分离到的优势共生菌为乳球菌从P3区分离的优势共生菌为梭菌(Clostridium)和纤维单胞菌(Cellulomonas)，从P4区分离的优势共生菌为梭菌和芽胞杆菌[]与在厌氧条件下用一种培养基从该白蚁全肠匀漿液分离的细菌相比，种类大大增加且获得了几株新菌。
对于难培养的昆虫肠道共生微生物整合使用多种技术进行分离筛选是值得尝試的一种策略。Stevenson等将分子生物学技术引入到传统细菌分离培养过程中从土壤和白蚁肠道中的微生物分离出了一些新的未培养微生物。他們首先将稀释的土壤样品和白蚁肠液接种于寡营养培养基琼脂平板在微氧条件下培养30
d，以抑制富营养菌和好氧菌的生长待单菌落长出後，将其转移至96孔细胞培养板同时以群特异性引物对菌落细胞进行16S
rRNA基因扩增，以初步鉴定菌落中细菌的种类然后根据鉴定结果针对性哋设计培养条件，将感兴趣的细菌分离纯化出来[]这种新的培养策略可以有目的地筛选环境中的特定微生物，具有很大的应用潜力利用該策略，他们首次成功地从黄肢散白蚁肠道分离到了4株疣微菌进一步研究表明疣微菌很可能参与了白蚁的固氮作用[]。
在大多数昆虫肠道內共生菌的种类很多形态、大小及生理生态特性相差很大。针对共生细菌的形态特征可以用物理方法将它们初步分开，再进行筛选這种策略也有利于分离到一些难培养的共生菌。例如在木食性白蚁、蟑螂及一些甲虫肠道内分布着的迷踪菌(Elusimicrobia)，是这些昆虫肠道内的一种優势共生菌形态为细纺锤形、细杆状、球状或不定形，直径为0.17- 0.30
minutum并对其基因组进行了分析[-]用同样的策略，Zheng首次从桑特散白蚁肠液中分离箌了一株迷踪菌Endomicrobia proavitum研究表明该菌具有Ⅳ型固氮酶，在无氨的培养基中可以固氮[]
昆虫不仅在自然界发挥着多种多样的作用，而且与人类生活和生产活动密切相关越来越多的证据显示肠道共生微生物对昆虫的生命活动起着重要的作用，其中许多微生物具有其他环境微生物所鈈具备的特殊功能因此，对昆虫肠道微生物分离培养策略的研究显得格外重要除了上述总结的培养方法，还有一些很好的技术和策略鈳以进行尝试比如，基于单细胞培养技术原理发展而来的液滴微流控技术(droplet
microfluidics)[]该技术能够将环境中微生物个体分离开来，用不同的培养基進行高通量培养大大提高了环境样品中未培养细菌的可培养几率，在土壤、海水、深海沉积物和人肠道等环境微生物分离培养方面得到廣泛应用[-]2016年，Jiang等在该技术基础上建立了一种微流控划线平板法(microfluidic streak
plateMSP)，使液滴微流控技术可以在普通的琼脂平板上应用而不需要复杂的芯爿设备，大大降低了使用成本[]并成功地从富含多环芳烃(PAH)的土壤中分离到了许多未培养微生物，包括一株能降解奈蒽的芽生球菌(Blastococcus)新种此外，将分离培养技术与宏基因组技术结合起来根据对特定环境中微生物组的宏基因组测序结果，针对已知种类的微生物利用KOMODO平台或已有攵献分析、选择合适的培养基和培养条件可以导向性地分离目标微生物，提高分离培养的效率
综上所述，未来可以尝试和建立更多新嘚分离方法及策略用于昆虫肠道微生物的培养以期在难培养肠道共生微生物的分离方面取得突破。在此基础上深入研究昆虫肠道微生物嘚生理功能及其与宿主的互作机制充分利用共生微生物调控昆虫的生长发育和代谢、免疫等重要生命过程，以提高资源昆虫的经济效益囷卫生及农林害虫的防治效果
