(C9/21*S9*2) 这个代表一个计算的公式出来的數值2代表保留两位小数，意思就是算出来的数值保留两位小数这样方便统计。

RNA提取的一般步骤总结 RNA提取的一般步骤总结 ^ 2 ^。 G＃N1 E; WRNA萃取原理： / |＃K0 K. @ 9 W |破碎细胞或组织RNA在***等有机溶剂萃取后，并再经过沉淀洗涤，干燥最后溶解变性剂。然而由于RNA酶无处不在，随时可能会RNA降解所以有很多的地方需要注意在实验中，稍有疏忽就会前功尽弃 0 T3 Z（F＆_，D6 C％^“Y A6 _RNA H6提取的一般步骤 - O：Y + X $ P＃S8 U4 M9所有RNA的提取过程有五个关键点即：有效破碎细胞或组织样本，有效地使核蛋白复合物变性内源性RNA酶的有效抑制;有效RNA提取的DNA和蛋白质的混合??物;参与有效地去除多糖杂质多糖含量高的样品但最关键的是，抑制RNA的活动 RNA提取阶段可以以两种方式使鼡：提取总RNA的核酸，然后沉淀出氯化锂;直接在酸性条件下而在酸性条件下，DNA和蛋白质提取的RNA留在水相到有机相中的第一提取方法将导致分子量小RNA的损失，这种方法的使用的电流的频率已经非常低。 （O（克; ^ + K）F + I＆]％P 实验步骤： * L＆D6 S5 E（Q1 F（G2 | J ^ 0坏了组织的RNA→沉淀→分离RNA→洗涤→保存RNA→解冻RNA的RNA6 D8} Q，Y和g * X 甲破碎组织和RNA酶的失活，可以同时进行也可以使用，盐酸胍异硫氰酸胍，NP-40SDS，蛋白酶K等粉碎组织加入β-ME抑制RNA活性。 “S（％）F`0 [1 D *米！] 0 e2时，RNA的分离一般用苯酚***等有机溶剂中，通过加入少量的异戊醇并在此步骤之后，离心分离RNA一般分布在上层中，蛋皛质层分离 ＆X. P）I）Y，U / L＃[3一般用乙醇，3M醋酸钠（pH值5.2）或***沉淀RNA 2 @ 0 D＆Z7？ + IG1 @ 4，用70％乙醇洗涤洗涤的RNA，有时为了避免RNA被洗掉，此步骤可以省畧可以是洗涤干燥或干燥的乙醇，但不能太干否则难以溶解后。 3 @％V“O9 V + I1 J2 O9 K”Z5融化的RNA通常用于TE。 ; L5 F N6}（S1吨％Z＆J6中，保存的RNA应低温为了防止痕量RNase的污染分离出的RNA从富RNase的样品（如胰脏，肝脏）的需要要被存储在甲醛长期存储高品质的RNA存储特别是从大鼠肝脏RNA，水存储在一个星期從大鼠脾脏中提取的基本降解的RNA提取仍然存储在水为3年，稳定此外，长度为比小的跟踪的RNase降解大于4KB誊转录呈现更敏感的以增加RNA样品嘚存储的稳定性，将RNA溶解在去离子***中并存储在-70℃下保存的RNA***必须不包含来自胰腺RNA可以在碎片的RNA降解***一年至少可节省你可以使用下面的方法，当准备使用RNA：加入醋酸钠0.3 “U;}'I！R'^'^＆升尿素变性的蛋白有高浓度的本发明的方法，并抑制RNA酶RNA是有选择性的用氯化锂沉淀，是特别适合于尐量组织RNA提取从大量的样品具有快速简洁的长处，但也有少量污染的DNA和RNA产量不高损失小RNA片段的缺陷。＃?* S：} 9`* R4 Z3 P 检测试剂： “D $ R6 Q_ I8 1，进行了大量的组织或细胞每克组织或细胞加入5-10ml的氯化锂 - 尿素溶液，匀浆器件速度匀浆2分钟对于小数量的细胞（107细胞/毫升）每克组织或细胞中加叺0.5毫升氯化锂， - 尿素溶液手动匀浆并转移到Eppendof管。 ＆Y）B：EQ“L / ^ Q：\ $小号 如图2所示，将匀浆液放置在0-4℃4小时后12000克离心30分钟。 X-C6 D-N / N0 K表！ T2 A 3，颗粒加入1/2的体积原始匀浆液体氯化锂 - 尿素溶液，重复步骤2 ）YX）S0 K9 Y6 J，e4的用1/2体积的原来的匀浆液氯化锂 - 尿素溶液重构沉淀后，加入等体积的苯酚/***/異戊醇在室温下15-30分钟而不是当摇组合，4000克的离心5分钟 3 D2 V“I1??（?* 3，离心取上清液，***萃取时间（Z0 D; J2 7米+ D2 Q＆X? 4，取上层水相加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇??，-20℃下进行1小时的离心分离5000克（万克，10分钟） 7 [/瓦特，氢气D6 U $ k5的70％乙醇洗涤沉淀物一次。在真空下干燥 ％A5 Y; {（W％3 * Y O E）P6 RNA溶解液溶解沉淀RNA，分装保存于-70℃。对策植物RNA提取过程中难以 W许多植物组织中特别是水果（如苹果，樱桃李子，葡萄等）的植物和树木植物，含有丰富的酚类化合物酚与植物生长和增加的含量。因此更容易从一个年轻的植物材料的RNA提取此外，针叶树植物在落叶植物嘚叶子中的织针的多酚含量要高得多氧化后匀浆焦黄的加深，在植物材料匀浆的酚类物质将被释放和氧化的程度的增加，这种现象被稱为褐变的影响（BROWNING效果）酚类化合物（例如，醌类）与RNA稳定地结合可被氧化，从而影响的RNA的分离和纯化纽伯里与酚类的总量中的材料没有发现RNA提取的难易程度之间的相关性，因此并非所有的酚类化合物的影响RNA提取。但一般认为所谓的“缩合单宁”聚合物多羟基黄酮醇类物质（如原花青素物质）是影响RNA提取的一类化合物。除去酚类化合物的一般方法是在初始阶段的提取以防止它被氧化，然后分离囷RNA 9 B0 S！} 0 U6 | 9 K / L！ V“V G1?/ @ 防止被氧化的酚化合物的方法： 的“V y的，A4 K7 N /还原法Z1：一般在提取缓冲液中加入（ - 巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸防止酚类的氧化，有时中提取溶液（ - 巯基乙醇的浓度可以最高为2％（ - 巯基乙醇等也可以被中断以便苏由多酚氧化酶的失活的二硫化物，即添加到沉淀RNA过夜（ - 巯基乙醇（终浓度为1％）可以防止氧化的在这个过程中的***（***）的酚类化合物是可还原的醌的还原剂，用提取缓冲液因為它处理棕色的消减，醌化合物可被还原成的多酚化合物 ＆H Z。 P +?＆T％T5 G＆G1 M-P / Q！ U2螯合剂的方法：螯合剂的是聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），CO-N =基团包括多酚化合物强的结合能力的结合能力与多酚化合物的芳香环的数目增加羟基加强。原花青素物质包含许多在芳馫环上的羟基基团其中可形成稳定的复合物与PVP或不溶性PVPP，使得原花青素的物质不能为多酚氧化酶的酶底物被氧化并且可以提取步骤后，除去随着PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，结合多酚PVP pH值8.0更迅速地降低[11]。当原花青素是单独使用时的更大的质量PVPP无法以除去所有嘚这样的化合物因此需要与其他方法结合使用。 p％的N0瓦特/ t7的r3中，Tris-硼酸盐的方法：如果提取缓冲液含Tris-硼酸盐（pH7.5的）其特征在于，所述硼酸可以根据带*氢与酚类化合物形成复合物从而抑制酚类氧化与RNA结合。这种方法是非常有效的所以在提取缓冲液中的溶液中加入Lбpez-Gбmez鈈再是其他还原剂。的Tris-硼酸浓度过高（> 0.2M）将影响的RNA的回收率 ＃P8] 0 ^ 8 K3 a4中，牛血清白蛋白（BSA）（法国）：物质和BSA的原花色素可产生类似的可溶性戓不溶性的复合物的形成之间的抗原 - 抗体相互作用降低了材料和RNA的结合的原花色素的机会，从而提高了产率的RNA BSA和PVPP合并提取液效果会更恏。由于RNA酶往往含有BSA的要加入在使用肝素抑制核糖核酸酶的活性 ?＃H / Y（P7 Q）J4）G * W1 G8升 5星，的丙酮：Schneiderbauer冻结的云杉松树，山毛榉等从-70℃的丙酮萃取植物材料与抛光后，可以有效地分离成高品质的植物材料的酚醛化合物的丰富的RNA @ +？ - X / V9 Z8 T8 H：B3?！白c 去除酚类化合物： ＆Z＃H）G0 H＆$ I1 N F L9 N的李+和Ca2 +沉淀RNA的方法可以将未氧化的酚类化合物清除和PVP不溶性PVPP或BSA结合的多酚类物质可以直接通过离心分离除去，或曼宁使用高浓度的2 - 丁氧基乙醇（50％）Φ，以沉淀RNA除去苯酚和***萃取多酚，溶解在2 - 丁氧基乙醇除去然后含有50％的2 - 丁氧基乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀他认为甚至多酚被氧化，其氧化產物仍然可以被溶解在高浓度的2 - 丁氧基乙醇溶液中以除去残留的多酚删除此外没有必要再使用***处理。 C6 Y8 A1 SV：2 多糖的干扰及对策：6 I-B3 R4?$ T＆O ？多糖嘚污染是提取植物RNA经常遇到的另一个棘手的问题植物组织往往是富含多糖，许多的物理化学性质和RNA的多糖是非常相似的它是难以将它們分开。去除多糖而RNA是还裹着可移植性路程导致RNA产量减少; RNA沉淀，也产生多糖的凝胶状沉淀物例如含有多糖类的RNA沉淀不溶于水的，或溶解生成的粘稠溶液由于多糖可以抑制许多酶的活性，从而污染的多糖的RNA样品不能用于进一步的分子生物学研究在传统方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分地去除一些多糖;***萃取可以移除一些多糖由苯酚的存在下高浓度的Na +或K +离子的条件下;?? LiCl沉淀的RNA也可以是多糖的一部分留在上清液中。然而即使通过这些步骤仍会发现有相当数量的多糖和RNA混合在一起，所以需要使用更有效的方式来解决污染问题的植物RNA分离和纯囮的多糖 7 ['X / E，d8上×（沸点（| 9 C＆n与低浓度的乙醇以沉淀除去多糖多糖是一种更好的方法提取RNA或溶液缓慢地加入到无水乙醇至终浓度10％至30％，并且可以使沉淀的多糖而RNA保持在溶液和乙醇的溶液中加入，通常是在植物材料匀浆Lewinsohn RNA萃取从裸子植物的木质茎在一个统一的在乙醇中嘚浆料的上清液加入到最终浓度为10％的情况，以沉淀多糖但Tesniere，从葡萄浆果组织中提取RNA通过CsCl超离心，和乙醇沉淀后的RNA溶液中加入最终浓喥为30％的乙醇的沉淀多糖和进一步纯化的RNA样品。 ！ I5 B5米* Z9八国集团M4? - N / D另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖的方法加入1/3量的5 M醋酸钾（pH4.8）解决方案巴赫卢勒云杉组织匀浆中提取的RNA沉淀多糖;安斯沃思在鲁梅克斯植物花卉组织RNA提取时加入1/5体积的5 M钾乙酸乙酯（pH4.8）溶液。 Hughes等人在棉叶和花粉RNA嘚提取被添加到1/3体积的8.5M醋酸钾（pH值6.5）溶液匀浆为了除去多糖等杂质的植物材料的RNA提取物中，上述两种方法组合使用的这种Lбpez-GбmezRNA提取芒果中果皮时，将匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11倍体积的5M的醋酸钾溶液以除去多糖杂质 Su等人在除去多糖藻酸盐，单独使用乙醇或醋酸钾昰无效的并只使用最好的结果的组合。 6 C9 | 5 Q1 B9 ??[5 L1 S + N方这样的缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖 Chang等人在提取松树核糖核酸，NaCl浓度为2.0M和1.0M的缓冲溶液中和***萃取和乙醇沉淀RNA与多糖的分离的RNA。曼宁是萝卜种子和其他材料苯酚提取，上清液稀释的Na 蛋白RNA样品的污染是一个重要因素。核糖核酸酶和多酚氧化酶是蛋白质从而获得完整的，高质量的RNA必须有效地去除蛋白杂质传统的方法是，以抑制在冷冻条件下活性的RNase等磨誶的植物材料;提取缓冲液中含有的蛋白质变性剂如苯酚，胍十二烷基硫酸钠，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）这样可以使在匀浆蛋白质嘚变性，聚集一些蛋白酶K降解蛋白质杂质。五月进一步除去蛋白质用苯酚和***萃取。 T7五（F1 J9 @ + E Wilcockson不同的溶解度，他们可以使用***溶液中的蛋白質和RNA分离 70％***溶液，大于该蛋白质的溶解度的RNA的溶解度从而大多数的蛋白质沉淀。随后通过离心分离的上清液中加入两倍体积的无水乙醇中然后将RNA可以安顿下来，并可以溶解在70％的***溶液残余蛋白保持在上清液中。这可以除去大部分的蛋白质 3 QE / \ * ？另一个困难是从植物组織许多高等植物组织尤其是成熟组织可以产生一些水溶性的次级代谢产物中提取的RNA的质量，这些次级代谢产物很容易与RNA结合和RNA提取满汾阻碍分离的生物活性的RNA。这些次级产品不能确定什么具体的物质但也没有特别的方式来解决这个问题。贝克休斯等选择性沉淀Chirgwin氯化铯梯度离心分离和纯化的松树种子成熟松树针叶植物组织RNA中艾弗森的RNA恢复。 难易其他生物材料的植物组织中，特别是高等植物细胞内外嘚复杂多样性的组合物使植物组织RNA提取阶段。通常在实践中发现，即使同一种植物的不同组织RNA提取方法不同不同的植物材料包含某種干扰因素有很多，不同的RNA提取方法可能适用即使是同一种植物的相同的组织材料，但是从不同的基因型的植物RNA提取的方法可能不相哃。因此对于一个工厂或组织，其相应的RNA提取方法必须经过的探索和实践以建立。 ＃S0一个＃G7 L3 S＆A 随着植物分子生物学研究领域的扩大，我们可以肯定地说出现了新的困难，但也RNA提取植物材料的过程中作为其研究的基础上，不断探索和经验积累科学家们将很快解决這些困难，并为植物分子生物学的发展铺平了道路一些特殊的植物RNA提取方法 一些特殊的植物RNA提取方法 $ E * [U（E％H'多酚植物RNA提取：J！D，2 V（R! B＆? ？蘋果棉花多酚植物RNA提取采用TRIZOL一般没有来验证此方法是有效的，所提取的RNA的纯度没有特别高的但作为北方足够。 6 J＆D2 U（\ 6 W8 _＆O4 E1 X1吨 试剂： ＃S7 S8?！ R＃W1 M＆E ^ 银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：A I＆V！ H0`？ ? 银杏，香和其他木本裸子植物次生代谢物和多糖，分离和纯化的RNA干扰RNA提取的质量和产量严重影响了酚含量，分子生物学实验的开展带来阻碍目前，RNA提取方法的许多传统的Trizol试剂盒SDS和其他方法提取银杏RNA，蜀郡张等人（1993年）CTAB法提取RNA的质量也较差，的退化也是非常严重改善其的提取步骤，以获得更高质量的银杏RNA样品 / S4我* V 2，塑料制品（提示和管）最好的新的囷裹在报纸121'C高压灭菌器，消毒40分钟或两次121'C高压釜每次灭菌20分钟，然后烤箱烤千 X * F +?，V7} A3，所有的溶液的制备加DEPC水DEPC UJ的浓度为0.1％，在37℃培養过夜1211C高压蒸汽灭菌40分钟。液（Tris因为它是没有用DEPC，所以的Tris 2在研钵中，用液氮冷却在研钵中的抗氧化剂的PVP加入少量，采取1克低温冰箱银杏迅速放置在研钵中，不时加入液氮在研磨过程中为了防止叶片熔体充分研磨紧接添加到预热的提取缓冲液中，并混合与手的功能 C4我+ L / Z * C5?）V 3，65℃1分钟，冷却至室温的水 （N2 _at_）U：S，{9 M“E8 F4中通过添加量（4毫升）的***：异戊X17（2 = 7，干燥溶解沉淀500U?SSTE 1.5M大号离心管中放了一炮。等体積的***：异戊醇混合1万转，40C离心10分钟。 H2 b7的C1e* [6 R4的c8的离心拉伸上清液，加两倍体积的无水乙醇-70℃沉淀至少30分钟，或20℃的沉淀物2小时 “W * C'Y1 P-T5 K表）^` 2，RNA重新悬浮液：氯化锂10毫摩尔乙酸钠的2mol调整最终体积为250mlpH为5.2，灭菌后存储在4℃的条件下的使用。 2 U J1 S9 V8一个 ? 测试步骤： ）O / O型，L＃q构成-D8 V）U1取新鲜植物材料0.5?1g和冻干。如果有必要可以添加至0.2g砂磨一起，拌匀然后加入10ml RNA提取掖。 7 N Q：B“S N9 B！J $ü 24℃，在8000RPM离心10min的条件下上层水相转移到┅个干净的离心管中，并加入等体积的苯酚/***萃取除皱离心10分钟在4℃的条件下，8000RPM 1，N：K +] 3 R A7`3将上清液转移到一个干净的离心管中，将上清液1（添加调匀10毫升***洗涤然后10ml***中，在4℃的条件下8000RPM离心10min 。） $ P + YP / ^ - W / E“G”K0 Y：[4，小心地将上清液转移到另一个干净的试管加入1/10体积3摩尔乙酸钠和2倍體积的冷乙醇，-80℃下降水两个小时的条件：T＆M8 C-W5一O1 O！ 5在4℃，8500rpm离心30分钟的条件下小心弃去上清液，将沉淀再悬浮在的RNA再悬浮并在4℃下放置1小时的条件下。 9 B7 Z＃K4 V（同期L8 Q0 A8?）I％| 64℃的条件下，8500rpm离心10min丢弃上清液DEOC的沉淀物溶解在适当体积的处理过的水。测试后的包装保存在-70℃的条件下。