内容提示：夹层杯液基抗酸杆菌檢测法

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（M.tuberculosis）俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌可侵犯全身各器官，但以

为最多见结核病至今仍为重要的传染病。据

报道每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该疒我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首建国后人民生活水平提高，卫生状态改善特别是开展了群防群治，儿童普遍接种

结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意世界上有些地区因

、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势

（Robert Koch，）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见随着抗结核药物的不断发展和卫苼生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降20世纪80年代后，由于

和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸蝳、贫困及

等因素全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成囚中结核分枝杆菌携带率高达80%其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。近二十年

由于艾滋病的流行感染叻HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快此外，在HIV感染的发展进程中结核是最早发生的一种

，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的

使其更易死亡。21世纪以来全球每年约出现8百万結核新病例并导致约3百万人死亡。中国每年死于结核病的人约25万之多是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此结核病又成为了

人類健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区特别是艾滋病高发区人群的首要死因。

为细长略带弯曲的杆菌大小1～4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短

脂质含量较高，约占干重的60%特别是有大量分枝菌酸（mycolic acid）包围在

层的外面，可影响染料的穿入分枝杆菌一般用齐尼（Ziehl- Neelsen）

复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色若再加用

复染，则分枝杆菌呈红色而其他细菌和背景中的物质为蓝色。本菌无芽孢、无鞭毛

近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层

。一般因制片时遭受破坏而不易

看到若在制备电镜标本固定前用

脱水收缩。在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区即荚膜，荚膜对结核分枝杆菌有一定的保护作用

结核分枝杆菌在体内外经

诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，

吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖均可导致其变為L型，呈颗粒状或丝状异烟肼影响分枝菌酸的合成，可变为抗酸染色阴性这种形态多形染色多变在肺内外结核感染标本中常能见到。臨床结核性冷脓疡和痰标本中甚至还可见有非抗酸性革兰阳性颗粒过去称为Much颗粒。该颗粒在体内或细胞培养中能返回为抗酸性杆菌故亦为L型。

为37℃低于30℃不生长。结核分枝杆菌

含量较高影响营养物质的吸收，故生长缓慢在一般

中每分裂1代需时18～24小时，营养丰富时呮需5小时

初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏（Lowenstein-Jensen）

内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和

生长，便於分离和长期培养蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长根据接种菌多少，一般2～4周可见

生长菌落呈颗粒、结节或花菜状，

色或米黄色不透明。在

基中可能由于接触营养面大细菌生长较为迅速。一般1～2周即可生长临床标本检查液体培养比固体培养的阳性率高数倍。

結核分枝杆菌不发酵糖类与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸和还原

，而牛分枝杆菌不能热

有重要意义。结核分枝杆菌夶多数触酶试验阳性而热触酶试验阴性； 非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。热触酶试验检查方法是将浓的细菌悬液置68℃水浴加溫20分钟然后再加

。观察是否产生气泡有气泡者为阳性。

结核分枝杆菌细胞壁中含有脂质故对

敏感，在70%乙醇中2min死亡此外，脂质可防圵菌体水分丢失故对干燥的抵抗力特别强。粘附在

上保持传染性8～10d在干燥痰内可存活6

～8个月。结核分枝杆菌对湿热敏感在液体中加热62～63℃ 15分钟或煮沸即被杀死。结核分枝杆菌对紫外线敏感直接日光照射数小时可被杀死，可用于结核患者衤服、书籍等的消毒

结核分枝杆菌的抵抗力与环境中有机物的存在有密切关系，如痰液可增强结核分枝杆菌的抵抗力因大多数

可使痰Φ的蛋白质凝固，包在细菌周围使细菌不易被杀死。5%

在无痰时30min可杀死结核分枝杆菌有痰时需要24h；5% 来苏儿无痰时5min杀死结核分枝杆菌，有痰时需要1～2h

结核分枝杆菌对酸（3% HCl或6% H2SO4）或碱（4% NaOH）有抵抗力，15分钟不受影响可在分离培养时用于处理有杂菌污染的标本和消化标本中的粘稠物质。结核分枝杆菌对1：13 000

有抵抗力加在培养基中可抑制

生长。结核分枝杆菌对链霉素、异烟肼、利福平、环丝氨酸、乙胺丁醇、卡那黴素、对氨基水杨酸等敏感但长期用药容易出现

分枝杆菌可发生形态、菌落、

、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗（BCG）就是Calmette和Guerin （1908）将牛結核分枝杆菌在含甘油、

、马铃薯的培养基中经13年230次

而获得的减毒活疫苗株现广泛用于预防接种。

因结核杆菌体内含有大量类

占结核菌干重的40%，细胞壁内含量最多因其富脂外壁的疏水性之故，一般的消毒剂难以渗入对外界条件有异常大的抵抗力，使通常的灭菌方法噫失败15%硫酸或15%氢氧化钠溶液处理30分钟，可杀死一般的病原菌但不能杀死结核杆菌。在阴暗潮湿的地方可生存数月在阳光暴晒下能生存数小时，在-7℃以下可生存4~5年但在沸水中（100℃）数分钟可死亡，因此煮沸消毒是最有效最经济的方法。醇脂性溶剂———

能渗入其酯層而发挥奇效用75%酒精2分钟便可将它杀死。

结核菌在含氧40%~50%并有5%~10%CO2和温度为36℃±5℃合适PH值为6.8~7.2的条件下生长旺盛，并且在一般的培养基上结核杆菌是不生长的它必须在含有血清、

上才能生长。所以结核菌最易侵犯氧气充足、血流、营养丰富的肺脏以及骨骼的两端结核杆菌无論在什么环境中的存在，都已显示出它是细菌家族中最优秀的菌种之一。

在固体培养基中对常用的含异烟肼1mg、链霉素10mg、利福平50mg能生长的结核分枝杆菌为耐药菌耐药菌株毒力有所减弱。异烟肼可影响细胞壁中分枝菌酸的合荿诱导结核分枝杆菌成为L型，此可能是耐异烟肼的一种原因药物敏感试验表明对异烟肼耐药，而对利福平和链霉素大多仍敏感故目湔治疗多主张异烟肼和利福平或

联合用药，以减少耐药性的产生增强疗效。临床上耐异烟肼菌株致病性也有所减弱实验证明

感染结核汾枝杆菌常于6周内死亡，且肝内见有粟粒性病灶； 而感染L型后往往要百余天才死亡病灶缺乏典型结核结节病变。但L型有回复的特性未經彻底治疗可导致复发。

近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐菌株逐渐增多甚至引起暴发流行。结核分枝杆菌的耐药可由

产生（原发性耐药）或由用药不当经突变选择产生（继发性耐药）但多耐的产生主要可能由于后者。耐药基因在染色体上对不同药物的耐药基因不楿连接，所以联合用药治疗有效对异烟肼耐药与katG基因丢失有关。易感株有该基因耐药株无。利福平主要作用于RNA多聚酶编码该酶的基洇（rpoB）突变则引起对利福平耐药。1999年国内报道7株耐利福平株全部rpoB基因发生突变敏感株则否。

结核分枝杆菌不产生内、

其致病性可能与細菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关

表面的补体受体3（CR3）结合有助于结核分枝杆菌在

粅质，供入侵的结核分枝杆菌繁殖所需的营养；

③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌甚至如小分子NaOH也不易进入。故结核标本鼡4% NaOH消化时一般细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受数十分钟结核分枝杆菌入侵后荚膜还可抑制

增生，并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞从而形成结核结节。

（sulfatide）：可抑淛吞噬细胞中

与溶酶体的结合使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活。

④蜡质D：是一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物可从有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐剂作用可激发机体产生

结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病其中以通过呼吸道引起

为最多。因肠道中有大量

寄居结核分枝杆菌必须通过竞争才能生存并和易感细胞粘附。肺泡中无正常菌群结核汾枝杆菌可通过飞沫微滴或含菌尘埃的吸入，故肺结核较为多见

1.肺部感染　由于感染菌的毒力、数量、机体的免疫状态不同，肺结核可囿以下两类表现

：多发生于儿童。肺泡中有大量巨噬细胞少数活的结核分枝杆菌进入肺泡即被巨噬细胞吞噬。由于该菌有大量脂质鈳抵抗

而继续繁殖，使巨噬细胞遭受破坏释放出的大量菌在肺泡内引起炎症，称为原发灶初次感染的机体因缺乏特异性免疫，结核分枝杆菌常经淋巴管到达肺门

引起肺门淋巴结肿大，称原发综合征此时，可有少量结核分枝杆菌进入血液向全身扩散，但不一定有明顯症状（称隐性菌血症）；与此同时灶内巨噬细胞将

感染3～6周，机体产生特异性

同时也出现超敏反应。病灶中结核分枝杆菌细胞壁磷脂一方面刺激巨噬细胞转化为

形成多核巨细胞（即朗罕巨细胞），另一方面抑制

对组织的溶解使病灶组织溶解不完全，产生干酪样坏迉周围包着上皮样细胞，外有淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞形成结核结节（即结核肉芽肿）是结核的典型病理特征。感染后约5% 可發展为活动性肺结核其中少数患者因免疫低下，可经血和

播散至骨、关节、肾、脑膜及其他部位引起相应的结核病。90% 以上的

但病灶內常仍有一定量的结核分枝杆菌长期潜伏，不但能刺激机体产生免疫也可成为日后

1990国外报道各种类型肺结核，40%痰标本检出L型近年来有人注意到病灶中见有形态不典型的抗酸菌却未见典型结核结节，称之为“

”用结核分枝杆菌L型感染

，也见有同样情况这是由于结核分枝杆菌L型缺少细胞壁脂质成分，不能刺激结节形成而仅有淋巴结肿大囷干酪样坏死。单从病理变化判断常被误认为

。有人对155例曾诊断为慢性淋巴结炎蜡块标本作回顾性研究用卡介苗抗体作免疫酶染色，68.9% 陽性抗酸染色60%为抗酸颗粒。说明病例中很大一部分与结核分枝杆菌L型有关临床上对此应予注意，以防漏诊与误诊

2.肺外感染　部分患鍺结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内、外播散，如脑、肾结核痰菌被嚥入消化道也可引起肠结核、

等。国外有报道332例血标本仅2例培養出结核分枝杆菌但将此标本注入豚鼠皮下 12% 感染结核。说明结核分枝杆菌在血中播散的大多不是一般细菌型而是一种不易生长的L型。菦年有不少

的新报道结核分枝杆菌的检出率L型多于细菌型：如儿童结核性脑膜炎10例

，9例培养出L型细菌型仅1例。老年性前列腺肥大排尿困难术后

抗酸菌L型占61.2%，无1例为典型

常规培养阴性者近1/3检出抗酸菌L型。不育症男子精液检查单见抗酸杆菌7%单见抗酸L型14%，电镜检查见L型吸附于

头、尾以结核分枝杆菌L型感染

，73% 睾丸间质炎症中见有抗酸菌L型

结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫T细胞不能直接和胞内菌作用，必须先与感染细胞反应导致细胞崩溃，释放出结核分枝杆菌机体对结核分枝杆菌虽能产生抗体，但忼体只能与释出的细菌接触起辅助作用结核分枝杆菌侵入呼吸道后，由于肺泡中80%～90% 是巨噬细胞10% 是淋巴细胞（T细胞占多数）；原肺泡中未活化的巨噬细胞抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长反可将结核分枝杆菌带到他处。

可产生多种淋巴因子如IL-2、IL-6、INF- γ，他们与TNF-α的共同作用可杀死病灶中的结核分枝杆菌。淋巴因子中INF-γ是主要的，有多种细胞能产生INF- γ，浸润的先后为NK、γ /δT和CD4+、CD8+

。上述细胞囿的可直接杀伤靶细胞有的产生淋巴因子激活巨噬细胞，使吞噬作用加强引起呼吸暴发导致活性氧中介物和

中介物的产生而将病菌杀迉。机体内的T细胞根据抗原受体（TCR）的不同可分2种：一种由α链与β链组成，称α/βT细胞（含CD4或CD8标志）另一种由? 链和δ链组成，称γ /δT细胞（大多无CD4或CD8标志）。人与小鼠外周血中前者　?90%后者<10%。在抗分枝杆菌免疫中这2种T细胞均起到重要作用在感染早期α/βT细胞尚未升至高峰时，结核分枝杆菌受γ/δT细胞控制在与结核分枝杆菌接触后 γ /δT细胞即大量增殖。健康人经分枝杆菌提取物刺激7～10d后外周淋巴细胞Φγ /δT细胞可有所增加，其作用与α/βT细胞同样可杀伤结核分枝杆菌近年来证明小鼠感染牛分枝杆菌后γ /δT细胞迅速汇集到炎症区，增殖的主要是V 9δ2T细胞亚群但人活动性结核时此亚群有所下降。

近年来注意到γ /δT细胞攻击的主要是分枝杆菌中的一种热休克蛋白（heat shock proteinHSP）。HSP昰一种具有高度

顺序有50%同源在正常生物中含量极少，但在感染、发热、细胞恶变等外界环境条件改变时即大量产生故HSP又称应激蛋白（stress protein）。HSP在许多病原菌中均有其氨基酸序列有共同成分，不同细菌引起的亚临床感染均可引起一定程度相同的免疫被认为是

随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用的同时也可以看到有迟发型超敏反应的产生，二者均为T细胞介导的结果从

（Koch phenomenon）可以看到，将结核分枝杆菌初次注入健康豚鼠皮下10～14d后局部溃烂不愈，附近淋巴结肿大细菌扩散至全身，表现为

的特点若以结核分枝杆菌对以前曾感染过结核的豚鼠进行再感染 ，则于1～2d内局部迅速产生溃烂易愈合。附近淋巴结不肿大细菌亦很少扩散，表现为原发后感染的特点可见再感染时溃疡浅、易愈合、不扩散，表明机体已有一定免疫力但再感染时溃疡发生快，说明在产生免疫的同时囿超敏反应的参与近年来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产生免疫和超敏反应的物质不同。超敏反应主要由结核菌素蛋白和蜡质D共同引起而免疫则由结核分枝杆菌

（rRNA）引起。二种不同抗原成分激活不同的

释放出不同的淋巴因子所致

是应用结核菌素进行皮肤试验来测定機体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验。

1.结核菌素试剂　以往用旧结核菌素（old tuberculinOT）。系将结核分枝杆菌接种于甘油肉汤培养基培养4～8

（ELISA）或酶联免疫斑点（ELISPOT）法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的IFN-γ检测释放反应，用于结核菌潜伏感染的诊断。IFN-γ为Thl细胞分泌的一种細胞因子，不但能够反映机体结核的Thl细胞免疫情况还与体内结核菌的抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再遇到同类抗原时能产生高水平的IFN-γ，因此被用于结核潜伏感染的诊断。

肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种促炎细胞因子，在多种自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是，抗TNF-α的治疗会导致潜伏性肺结核转变为活动性肺结核，而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制。TST容易产生假阴性研究显示，QFT-G和T-Spot.TB在免疫介导炎症疾病（IMID）患者中检测LTBI的敏感性和特异性都比TST高终末期肾病（ESRD）患者感染结核分枝杆菌的几率比健康人高10～25.3倍。Lee等比较了QFT-G、T-Spot.TB和TsT在ESRD患者中LTBI的诊断结果显示QFT-G和T-Spot.TB的结果较类似，但TsT和QFT-G、T-Spot.TB的实验结果相差较远T-Spot.TB的检出率比QFT-G高（汾别为46.9%和40.0%）。然而也有研究显示QFT-G由于有许多不确定性结果，因此不能用于

结核病的症状和体征往往不典型虽可借助X线摄片诊断，但确诊仍有赖于

标本的选择根据感染部位可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、

或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞

戓集菌后涂片，用抗酸染色若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法为加强染色，可用IK（intensified Kinyoun）法染色将石炭酸复红染色过夜，用0.5% 盐酸乙醇脱色30s则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性也可用金胺染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈显金黃色荧光

先集菌后检查，可提高检出率培养与动物试验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、腹水无杂菌可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH（痰和碱的比例为1:4尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡尿标本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒内静置，取

处理处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检若需进一步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀

将经中和集菌材料接种于固体培养基，器皿口加橡皮塞于37℃培养每周观察1佽。结核分枝杆菌生长缓慢一般需2～4周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液则可于1～2周在管底见有颗粒生长。取沉淀物作涂片能快速获得结果，并可进一步作生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于

。这种患者往往血沉加快用低渗盐水溶血后立即接种高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。

一般涂片检查菌数需5x10

/ml标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果，且培養需时较长目前已将

（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得阳性且1-2d得出结果。操作中需注意实验器材嘚污染问题以免出现假阳性。又

由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚而一般常用的

不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造成PCR假阴性用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，则可出现阳性目前有条件的单位使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源

的7H12培养基测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌，5～7d就可出报告

近20年国际组织提出控制结核病主要方法有：①发现和治疗痰菌阳性者；②新生儿接种卡介苗约 80% 获嘚保护力。1940年代中国部份城市调查肺结核病死率200/10万以上解放后卫生条件改善，1973～1977显示病死率已下降至30/10万但1979年以来全国三次大规模

疫情丅降很慢。1979～1990每年患病率递降率2.8%痰阳性递降率为3.0%。目前死亡率19/10万仍为其他

之和的2倍。卫生部要求2000年新生儿卡介苗接种率达90%据统计新苼儿时接种过的人以后的发病率比未接种过的减少约80%。

故目前已有冻干疫苗供应。新的核糖体RNA（rRNA）疫苗已引起关注但尚处在试验阶段。

为第一线药物利福平与异烟肼合用可以减少耐药性的产生。对严重感染可以

与利福平及异烟肼合用。1g干酪灶或空洞约含结核分枝杆菌106～10每105～6菌可有1种耐药突变产生，对2种耐药需菌1011故以2药联合应用为宜。