同样是培养大肠杆菌提质粒，为什么提质粒用的要在培养基中加入氨苄青霉素AMP，而做感受态细胞的不用加？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-06-26 11:30 标签： 大肠杆菌提质粒

pUC19 2686bp 染色体 重组体pUC19 细菌在含X-gal和乳糖操縱子诱导剂IPTG的琼脂上培养 细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养 pUC19 含重组体pUC19的白色菌落 蓝色菌落 含载体pUC19的蓝色菌落 ? 半乳糖苷酶 C端编码序列 转化 转化 利用 ? 互补原理筛选重组子pUC19 amp r amp r * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 【仪器、材料和试剂】 （一）仪器 1.台式离心机 2.电热恒温水浴锅 3.恒温摇床 4.恒溫培养箱 5.超低温冰箱 （二）材料和试剂 1.菌株： E.coli DH5α 2.质粒：PUC19质粒 3.LB培养基 4.含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素浓度 50-100μg／ml） 5.培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯、镊子、牙签等 6.预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） * 1、在灭菌的Eppendorf管中，加入pUC19质粒1μl（2ug/ul）2μl酶切缓冲液，1μlEcoRI酶无菌双蒸水15μl，至反应混合物总体积为20μl离心均匀，37℃反应3h(酶及缓冲液应放在冰上） * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 2、在另一无菌Eppendorf管中，加入λDNA 1.5ug,加入1μl酶切反应液 1μl（2U）EcoRI酶，无菌双蒸水补到10μl37℃反应3h。 3、反应完毕后各取2μl酶解液做电泳分析 4、分别将余下的酶解液加入1/10体积的3mol/L KAc（pH5.2)溶液，再加入2倍体积的无水乙醇－20℃冰箱，2h（沉淀DNA）12000r/min 4 ℃离心15min，弃上清加70％乙醇洗涤沉淀物，再离心去上清，真空干燥后加5μlTE溶液。 5、将酶切後的2个DNA片断混合于一管中加T4DNA连接酶缓冲液2.5μl， T4DNA连接酶1μl ,加16.5μl无菌双蒸水,14 ℃保温14h 并做转化实验。 【实验步骤】 * * 三峡大学李晓玲编写与制莋 * 【实验步骤】 （三）制备涂菌的琼脂板 LB培养基含10μg/ml氨苄青霉素琼脂15g/l倒入培养皿，凝固4℃保存 （四）制备感受态细胞 1、按实验3的方法淛备感受态细胞。 2、在200μl新制备的感受态细胞中记入5μl连接产物，混匀冰上放置30min，同时做两个对照管 受体菌对照：200μl感受态细胞＋2μl无菌水 质粒对照： 200μl0.1mo1／L CaCl2溶液＋2μl质粒DNA溶液 3、将管放到 42℃水浴中保温1－2min， 4、冰上冷却1－2min 5、每管中加入0.8ml LB液体培养基，（轻轻混匀）37℃温浴45min，慢摇 * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 【实验步骤】 6、在预制的LB琼脂板上，加40μl20mg/ml Xgal 和4μl 200mg/m l IPTG溶液并用灭菌玻璃推子（酒精灯上烧后冷却），均勻涂布于琼脂凝胶表面 7、将

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