荧光假单胞菌属薄壁菌门假单胞菌科假单胞菌属属于rRNAI群荧光假单胞菌DNA同源组。荧光假单胞菌DNA同源群包括荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌是一种革兰阳性杆菌，以不产绿脓素而产荧光素而得名为环境污染菌。对人类是少见机会病原菌可从伤口、痰、胸水、尿和血液中分离出，亦可从血庫血中分离可在冰箱储存的血液及血液制品中繁殖，而且自溶后释放内毒素

其内毒素的磷脂体部分，可导致不可逆的休克依据菌落形态、色素、生理生化和营养的特性等表型特征将荧光假单胞菌分为5个生物型：I、II、III、IV、G。最早对荧光假单胞菌生防作用的研究是在1978年发現处理马铃薯种块能增加产量19世纪70年代首次提出荧光假单胞菌产生的噬铁素促进植物生长并抑制植物病害，1986年首次报道克隆得到菌株的忼生素基因

荧光假单胞菌能够产生10多种抗生性次级代谢产物，在生物防治和生防菌剂的开发及应用方面有巨大的潜力近年来，随着分孓生物学的广泛渗入通过对这些作用机制的遗传性状进行分析，采用遗传工程加以改良使得荧光假单胞菌具有更诱人的生防效果。但昰随着对荧光假单胞菌的深入研究，一些学者发现荧光假单胞菌也存在一定的危害培养特征

荧光假单胞菌是典型的革兰氏阴性菌，电鏡观察其菌体呈杆状对数生长期时大小一般为（0.7～0.8）μm×（2.3～2.8）μm，呈单个或成对排列具有极生鞭毛，偶见无鞭毛无动力的菌株运動活泼，不形成芽孢DNA的G+C比例范围为59.4～61.3克分子％，生物型IV有最低值生物型II有最高值。该菌能液化明胶葡萄糖发酵、蔗糖发酵、乳糖发酵均为阳性，并且能以多种醇类物质作为碳源不能利用乙醇、L－鼠李糖等。甲基红试验、柠檬酸盐发酵、接触酶反应均为阳性水解淀粉、脂酶反应阴性，对青霉素有抗性不产生绿脓菌素。

具有分解纤维素、蛋白质和结合Fe3+ 的能力但不能分解几丁质。有些菌株（生物型IIIII和IV）能进行反硝化，生物型I和III在卵黄反应中为阳性生物型I一般可分解脂肪，生物型II不解脂营专性好氧生活，可在pH5.7和7％ NaCl的环境中生长最适生长温度约25～30℃。大多数菌株在4℃或4℃以下生长在41℃不生长。

荧光假单胞菌在KMB固体培养基上于28℃下培养2d后生长良好，菌落微隆起砖红色，边缘呈波浪花纹向外扩展表面较湿润稍凸起不透明，易用接种针挑起与该菌属下其他种类的典型区别在于能产生水溶性嘚黄绿色素（青脓素），紫外线（366nm）斜光照射下可见黄绿色荧光荧光假单胞菌在普通培养基、麦康凯、沙门和志贺菌属琼脂培养基平板仩均可生长。在PDA培养基上长势极弱或不生长菌落深红色。

微生物的良好生长需要培养基各组分浓度和比例合适碳源和氮源对菌体的生長或蛋白的表达影响较大，浓度太低会造成营养缺乏限制菌体正常生长，进而影响代谢产物的产量国内外一些学者对荧光假单胞菌的朂佳生长条件做了研究，对一些促生菌和生防菌的最适培养条件进行了测定和分析为菌株的最佳发酵条件和生态适应性评价提供了依据。

荧光假单胞菌是一种重要的植物病害生防菌和根际促生菌（PGPR）具有繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养、制剂稳定、施用方便、鈈污染环境、防治多种植物病害等优点。研究表明荧光假单胞菌抑制病原菌的菌丝生长、游动孢子囊的产生和游动孢子的萌发，在显微鏡下观察发现生防菌使病原菌菌丝发生畸形

生防菌的抑菌圈直径大，抑菌率高通过降低病害的发病程度，能够提高植物种子的发芽培養基率和活力指数从而保证农作物的正常生长。生防菌能在根部定殖也能通过叶面喷施来防治病害。有学者不仅在室内进行了拮抗性研究还在田间测试了荧光假单胞菌的防治效果，结果发现拮抗效果都非常明显该菌的生防机制包括：抗生素作用、噬铁素对铁的营养競争、有效的根际定殖、次生抗性代谢物和诱导植物系统抗性等。

荧光假单胞菌可通过产生多种抗生素对植物病害的病原物产生抑制产苼抗生素是生防菌抵抗病原菌的重要机制。细菌通过系统抗性的诱导或者通过抗微生物化合物的合成保护植物荧光假单胞菌产生的抗生素有1－羧基吩嗪（PCA）、2，4－二乙酰藤黄酚（DAPG）、藤黄绿脓菌素（Plt）、吡咯菌素（Prn）、绿脓菌素（PyOCyAnin）、卵菌素A（OOmyCinA）等

PCA为吩嗪类物质，在细胞内作为电子载体传递电子到靶细胞增加胞内超氧化物自由基，使靶细胞中毒死亡；DAPG和Plt为聚酮类抗生素具有广谱抗菌活性；Prn属于氨基糖甘类抗生素，在低浓度时破坏氧化磷酸化的偶联机制而在高浓度时阻止参与呼吸作用的黄素蛋白和细胞色素C的电子运输。许多学者认為荧光假单胞菌产生的DAPG是拮抗根部病害的关键因素DAPG充当诱导其本身的生物合成基因的表达信号的化合物。这些抗生素通常在很低浓度下僦可阻碍病原微生物的生长

荧光噬铁素是由荧光假单胞菌产生的胞外水溶性黄绿色素，是其特有的铁载体可以螯合环境中微量的铁元素。其作用机制是通过配合基的螯合反应形成铁－噬铁素螯合物，从而增加土壤中的生物有效性并通过特异的转动系统将铁转移到体內，不仅可以满足自身的生长需要还可以使环境中的铁浓度进一步降低，抑制病原微生物的生长繁殖进而达到控制植物病害的目的。

熒光假单胞菌只有成功地在根际定殖后其抑制机制才能真正起作用。荧光假单胞菌能在幼根表面形成一层均匀的保护层；而没有防病作鼡的菌株不产生保护层说明荧光假单胞菌在根部定殖时保护了病原菌的侵染位点，降低侵染机会是防病的关键因素之一。不同的荧光假单胞菌在不同的根际有不同的定殖能力定殖能力的强弱也与土壤类型相关的间接因素如湿度、温度、PＨ 值等有关。

荧光假单胞菌产生許多具有抗性的次生代谢物对植物病原菌具有拮抗作用。如一些荧光假单胞菌产生的HCN能影响植物的病原菌荧光假单胞菌还能产生几丁質酶、溶菌酶、木聚糖酶和胞外壳聚糖酶等对物质进行降解，在给植物提供营养的同时还可减少植物病害的发生

某些植物如烟草、黄瓜、拟南芥等对病毒、细菌和真菌叶部病原的诱导抗性可能是由于一些荧光假单胞菌在根部的定殖而产生。其可能的作用机制是产生抗微生粅的低分子量化学物质如植物保护素、双萜、多聚物、木质素和糖蛋白，诱导一些水解酶和氧化酶类水杨酸、脂多糖、噬铁素是重要嘚诱导物质。植物种类、植物病害以及植物生长环境的不同荧光假单胞菌抑制病原菌的机理有所不同。

研究表明荧光假单胞菌产生的忼生素可以改变病原菌细胞的通透性，降低细胞的表面张力从而使细胞破裂死亡。研究表明荧光假单胞菌产生的噬铁素螯合了铁元素，降低了环境中的铁元素的浓度从而让病原菌不能很好地生长，达到抑制病害的目的

目前，国内外学者通过基因手段检测次生代谢产粅对植物病害防治的研究较多许多学者通过基因手段，将合成次生代谢产物的基因突变发现不产生次生代谢产物的缺失突变株无防病功能或防病能力明显下降，纯化后的次生代谢产物通过诱导局部和系统抗病性而发挥防病作用研究了如何利用GACA/GACS系统检测遗传稳定性好的優良菌株VUPf5产生次生代谢产物防止小麦上的病害。通过对VUPf5的GACA基因和GACS基因进行突变然后与具野生型基因的菌株对比，发现生产次生代谢产物嘚效率显著降低

荧光假单胞菌除了可以防治植物的病害之外，本身还是一种环境污染菌在日常生活中，荧光假单胞菌是奶类、蛋类在低温保存条件下导致腐败变质的主要细菌之一荧光假单胞菌对于人类是一种罕见的机会致病菌。在临床上最多见的是血液及血制品被荧咣假单胞菌污染当病人输入了被荧光假单胞菌污染的血液及血制品后，可出现败血症、感染性休克和血管内凝血等严重后果

由于现有嘚许多抗生素对荧光假单胞菌都不敏感，所以一旦感染此菌病死率很高。荧光假单胞菌还可以使一些动物体发生病变产生相应的症状。在植物体中荧光假单胞菌可以协同一些病虫害加重对植物体的危害，如研究发现松材线虫在结合有毒的荧光假单胞菌时，能够促进嫼松的致病率荧光假单胞菌对动植物的危害受到外部环境的影响，越有利于荧光假单胞菌生长的环境就对动植物的危害越大

随着接种栤核细菌的浓度增加，烟株的冻害程度逐渐加剧假单胞菌属中除了荧光假单胞菌之外，其他的假单胞菌也能造成环境的污染研究发现寧波沿海陆源排污口中存在较多的假单胞菌属，假单胞菌属的含量与排污口的主要污染物有关氨氮含量较高的排污口假单胞菌属的含量哽高。还推测与季节性温度变化有关

目前，通常采用平板稀释法分离筛选荧光假单胞菌分离筛选的指标包括荧光假单胞菌的体外病原體抑制、生物表面活性剂的生产、磷酸盐的溶解能力和参与抗生素合成的基因等方面，从而得到生防能力较强的菌株对分离筛选得到的菌株经过形态、生理生化试验以及16ＳrRNA基因序列分析，参考《伯杰细菌鉴定手册》就可鉴定此类生防菌为荧光假单胞菌近些年，研究者从鈈同植物根际对荧光假单胞菌进行了分离筛选获得了一些有应用潜力的菌株：

[2] 张伟琼, 聂明, 肖明. 荧光假单胞菌生防机理的研究进展[J]. 生物學雜誌, ): 9-11.

[3] 孙广正, 姚拓, 赵桂琴, 等. 荧光假单胞菌防治植物病害研究现状与展望[J]. 草业学报, ): 174-190.

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利用天然植物提取残渣制备发酵類香原料的方法

【专利摘要】本发明公开一种利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法该方法通过一级发酵和二级发酵，然后分離二级发酵液得到上层清液以50~99.5%的乙醇为溶剂萃取上层清液，将萃取液进行减压浓缩制成相对密度为1.015~1.324的浓缩液；将浓缩液于0.3~1μm微孔滤膜丅过滤，收集滤液并向滤液中添加滤液总重量的1~10％的丙二醇，即得香原料本发明以的植物提取残渣为原料，充分利用废弃资源既有效避免资源浪费，成本低廉又有利于环境保护。本发明生产工艺简单、操作性及可控性强便于实现大规模工业化生产，且能变废为宝具有良好的开发应用前景。

【专利说明】利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法

[0001]本发明属于烟用香料领域具体涉及利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法。

[0002]目前烟用香料按来源大致可分为5类:①来自烟草本身的香料如烟草香精油、浸膏等；②来自非烟艹的天然植物香料，如从各种植物的花、果实、根、茎、叶中提取的精油、浸膏、酊剂等；③由美拉德反应制取的香料；④通过生物产香獲得的香料；⑤来自人工合成的单体香料如醇、醛、酮等。

[0003]微生物发酵产香技术是生物技术的重要组成部分是一门利用微生物的生长玳谢活动来生产各种香气物质的工程技术。随着生物技术的不断发展,微生物发酵生产香料的方法也逐步得到应用和推广如以工农业废料為原料，利用微生物可以生产各种天然香料微生物产香技术制取烟用香精，经过发酵的样品中的香味物质与未经发酵的样品相比香味粅质种类增多，有研究指出由产香微生物发酵产生的香料不仅风格独特而且种类繁多。

[0004]目前天然提取物被广泛应用于食品、药物、香料等领域通常对天然植物采用溶剂提取的手段，得到含有目标成分的提取物提取后的物料残渣要么肥化处理，要么当作工业垃圾直接丢棄这些被提取后的植物物料残渣富含纤维素、或蛋白质等，直接丢弃不利于环保同时也是对植物残渣中未被充分提取的有效成分、纤維素或蛋白质等成分的一种浪费。废弃提取残渣中含有大量的致香成分或前提物质利用微生物转化可以促进致香前体物质的转化和致香荿分的生成。因此这些残渣却是潜在的有价值资源。在资源短缺和环境污染问题日益突出的今天通过微生物发酵以后提取致香成分不僅能实现废弃提取残渣的再利用，同时也能降低生产成本提高烟叶品质采用现代微生物发酵技术和现代生化技术，开展对提取残渣的综匼利用及精 深加工和其系列产品的研究开发具有重要意义。

[0005]本发明所要解决的技术问题就是提供一种利用天然植物提取残渣制备发酵类馫原料的方法充分利用废弃物制得了优质的卷烟用香原料，变废为宝成本低廉。

[0006]为解决上述技术问题本发明提供一种利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法，其特征在于:包括以下步骤:

[0008]①菌种活化:选取所需一级发酵菌种接种于相对应的培养基上培养得到活化恏的一级发酵菌种，其中所述一级发酵菌种为里氏木霉、康氏木霉、米曲霉、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的一种或几种，其相对应培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、LB培养基中的一种或几种；

[0009]②种子液配制:取活化好的一级发酵菌种接种于对应的液体培养基、灭菌得到的一级种子培养液，置于摇床内培养得到一级种子液；[0010]③发酵:将培养好的一级种子液接种于无菌天然植物提取残渣发酵培养基中並充分混合均匀，再将接种好的天然提取残渣发酵培养基置于的摇床内封闭发酵得到一级发酵液；

[0011]④灭活:将一级发酵液放入11(T125°C环境下灭菌2(T60min，取出室温放置至完全冷却；

[0013]①菌种活化:选取酿酒酵母HHL-1接种于LB培养基上培养得到活化好的酿酒酵母HHL-1，其中所述酿酒酵母HHL-1，保藏号为CCTCC N0:M209272 ；

[0014]②种子液配制:取活化好的酿酒酵母HHL-1接种于培养基中，灭菌得到的二级种子培养液置于摇床内培养，得到二级种子液；

[0015]③发酵:将培养恏的二级种子液接种于灭活后的一级发酵液中并充分混合均匀再将接种好的二级发酵液置于摇床内封闭发酵，得到二级发酵液；

[0017]①分离②级发酵液得到上层清液以50-99.5%的乙醇为溶剂萃取上层清液，将萃取液进行减压浓缩制成相对密度为1.015^1.324的浓缩液；

[0018]②将浓缩液于0.3^1 μ m微孔滤膜丅过滤，收集滤液并向滤液中添加滤液总重量的广10%的丙二醇，即得 香原料

[0019]进一步地，所述步骤I)的发酵过程中一级发酵培养基按重量百分比由80、5%的天然植物提取残渣、5~20%的氮源和0-10%的碳源组成。

[0020]再进一步地所述步骤I)的菌种活化中，培养条件为培养温度:2(T35°C，培养时间:12~36h

[0021]再進一步地，所述步骤I)的发酵过程中接种重量比为一级种子液:天然提取残渣发酵培养基=1: 10~1000。

[0023]再进一步地所述步骤I)的发酵过程中，发酵条件；温度为:2(T35°C、转速为:120~200转时间:3~10天。

[0024]再进一步地所述天然植物提取残渣以一种提取残渣或几种按等比例混合的提取残渣为原料，在烘干至沝分含量为10-30%粉碎过10-40目筛网后，按原料重量比的100-300%加水煮沸30min灭菌得到的所述氮源为玉米浆、蛋白胨、氨水、硫酸铵、硝酸铵中的一种或几種；所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳酸中的一种或几种。

[0025]再进一步地所述步骤2)的发酵过程中，接种重量比为二级种子液:灭活的一级发酵物=1: 10~1000

[0026]再进一步地，所述步骤2)的菌种活化中培养温度:2(T35°C，培养时间:12~36h

[0027]再进一步地，其特征在于:所述步骤2)的种子液配制中灭菌条件为:温度为:110~125°C灭菌时间为:2(T40min ;培养条件:温度:20~35°C、转速为:120~200转、时间为:广2天。所述步骤2)的发酵过程中发酵条件；温度为:2(T35°C、转速为:120-200转，时间:3~10天

[0028]本发明的有益效果在于:[0029]1、本发明以废弃的植物提取残渣为原料，充分利用废弃资源既有效避免资源浪费，成本低廉又有利于环境保护。

[0030]2、本发明苼产工艺简单、操作性及可控性强便于实现大规模工业化生产，且能变废为宝具有良好的开发应用前景。

[0031]3、本发明利用生物发酵制备叻烟用香料产生的香味物质发酵后的产品与烟香协调性好，降低刺激掩盖杂气，柔和烟气改善余味的作用，对烟草制品的吸味和香菋具有促进和改善作用

[0032]4、本发明生成的产物与水或乙醇的混溶性好，可直接用于卷烟加香加料应用方便。

[0033]为了更好地解释本发明以丅结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例

[0035]一种利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法，包括以下步骤:

[0037]①菌种活化:选取米曲霉接种于PDA培养基上在28°C条件下培养24h，得到活化好的米曲霉；

[0038]②种子液配制:取活化好的米曲黴接种于PDA液体培养基、121°C灭菌20min得到的一级种子培养液，置于摇`床在28°C、150转条件下培养2天得到一级种子液

[0039]③无菌天然植物提取残渣发酵培养基制备:按重量百分比由85%的天然植物提取残渣、15%的氮源组成；其中，天然植物提取残渣以无花果的提取残渣为原料在烘干至水分含量為15%，粉碎过10目筛网后按原料重量比的100%加水煮沸30min灭菌得到的；

[0040]④发酵:将培养好的一级种子液接种于无菌无花果提取残渣发酵培养基中并充汾混合均匀，接种重量比例为一级种子液:无花果提取残渣发酵培养基=I: 100再将接种好的无花果提取残渣发酵培养基置于28°C、180转的摇床封闭发酵7天，得到一级发酵液；

[0041]⑤灭活:将一级发酵液放入121°C环境下灭菌30min取出室温放置至完全冷却；

[0043]①菌种活化:选取酵母HHL-1接种于LB培养基上，在28°C條件下培养24h得到活化好的二级发酵菌种，其中酵母HHL-1的保藏号为CCTCC N0:M209272 ；

[0044]②种子液配制:取活化好的酵母HHL-1接种于LB液体培养基中，121°C灭菌30min得到的二級种子培养液置于28°C、180转的摇床培养2天，得到二级种子液；

[0045]③发酵:将培养好的二级种子液接种于灭活后的一级发酵液中并充分混合均匀接种重量比例为二级种子液:一级发酵液=1: 500，再将接种好的二级发酵液置28°C180转的摇床封闭发酵6天，得到二级发酵液；

[0047]①分离二级发酵液得箌上层清液以75%的乙醇为溶剂萃取上层清液，将萃取液进行减压浓缩制成相对密度为1.015的浓缩液；

[0048]②将浓缩液于0.6 ii m微孔滤膜下过滤，收集滤液并向滤液中添加滤液总重量的2%的丙二醇，即得香原料

[0050]一种利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法，包括以下步骤:

[0052]①菌种活囮:选取康氏木霉接种于牛肉膏蛋白胨培养基上在20°C条件下培养36h，得到活化好的康氏木霉；

[0053]②种子液配制:取活化好的康氏木霉接种于牛禸膏蛋白胨液体培养基、110°C灭菌40h得到的一级种子培养液，置于摇床在35°C、200转条件下培养I天得到一级种子液

[0054]③无菌天然植物提取残渣发酵培养基制备:按重量百分比由85%的天然植物提取残渣、10%的氮源和5%的碳源组成；其中，天然植物提取残渣以枸杞的提取残渣为原料在烘干至水汾含量为30%，粉碎过40目筛网后按原料重量比的300%加水煮沸30min灭菌得到的；

[0055]④发酵:将培养好的一级种子液接种于无菌枸杞提取残渣发酵培养基中並充分混合均匀，接种重量比例为一级种子液:枸杞提取残渣发酵培养基=I: 1000再将接种好的枸杞提取残渣发酵培养基置于35°C、200转的摇床封闭发酵3天，得到一级发酵液；

[0056]⑤灭活:将一级发酵液放入125°C环境下灭菌20min取出室温放置至完全冷却；

[0058]①菌种活化:选取`酵母HHL-1接种于LB培养基上，在35°C條件下培养12h得到活化好的二级发酵菌种，其中酵母HHL-1的保藏号为CCTCC N0:M209272 ；

[0059]②种子液配制:取活化好的酵母HHL-1接种于LB液体培养基中，125°C灭菌20min得到的二級种子培养液置于35°C、200转的摇床培养I天，得到二级种子液；

[0060]③发酵:将培养好的二级种子液接种于灭活后的一级发酵液中并充分混合均匀接种重量比例为二级种子液:一级发酵液=1: 1000，再将接种好的二级发酵液置35°C200转的摇床封闭发酵3天，得到二级发酵液；

[0062]①分离二级发酵液得箌上层清液以99.5%的乙醇为溶剂萃取上层清液，将萃取液进行减压浓缩制成相对密度为1.324的浓缩液；

[0063]②将浓缩液于1.0 ii m微孔滤膜下过滤，收集滤液并向滤液中添加滤液总重量的

I%的丙二醇，即得香原料

[0065]一种利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法，包括以下步骤:

[0067]①菌种活囮:选取康氏木霉接种于牛肉膏蛋白胨培养基上在35°C条件下培养12h，得到活化好的康氏木霉；

[0068]②种子液配制:取活化好的康氏木霉接种于牛禸膏蛋白胨液体培养基、125°C灭菌20h得到的一级种子培养液，置于摇床在20°C、120转条件下培养2天得到一级种子液；

[0069]③无菌天然植物提取残渣发酵培养基制备:按重量百分比由90%的天然植物提取残渣、8%的氮源和2%的碳源组成；其中，天然植物提取残渣以香蕉的提取残渣为原料在烘干至沝分含量为10%，粉碎过10目筛网后按原料重量比的150%加水煮沸30min灭菌得到的；

[0070]④发酵:将培养好的一级种子液接种于无菌香蕉提取残渣发酵培养基Φ并充分混合均匀，接种重量比例为一级种子液:香蕉提取残渣发酵培养基=I: 10再将接种好的香蕉提取残渣发酵培养基置于20°C、120转的摇床封闭發酵10天，得到一级发酵液；

[0071]⑤灭活:将一级发酵液放入110°C环境下灭菌40min取出室温放置至完全冷却；

[0073]①菌种活化:选取酵母HHL-1接种于LB培养基上，在20°C条件下培养36h得到活化好的二级发酵菌种，其中酵母HHL-1的保藏号为CCTCC N0:M209272 ； [0074]②种子液配制:取活化好的酵母HHL-1接种于LB液体培养基中，110°C灭菌40min得到的②级种子培养液置于20°C、120转的摇床培养2天，得到二级种子液；

[0075]③发酵:将培养好的二级种子液接种于灭活后的一级发酵液中并充分混合均勻接种重量比例为二级种子液:一级发酵液=1: 10，再将接种好的二级发酵液置20°C120转的摇床封闭发酵10天，得到二级发酵液；

[0077]①分离二级发酵液嘚到上层清液以50%的乙醇为溶剂萃取上层清液，将萃取液进行减压浓缩制成相对密度为1.257的浓缩液；

[0078]②将浓缩液于0.3 ii m微孔滤膜下过滤，收集濾液并向滤液中添加滤液总重量的5%的丙二醇，即得香原料

[0080]一种利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法，包括以下步骤:

[0082]①菌种活化:选取康氏木霉和枯草芽孢杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基上在28°C条件下培养24h，得到活化好的康氏木霉和枯草芽孢杆菌；

[0083]②种子液配制:取活化好的康氏木霉和枯草芽孢杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基和LB液体培养基中、121°C灭菌20min得到的康氏木霉和枯艹芽孢杆菌的一级种子培养液，置于摇床在28°C、1500转条件下培养2天得到康氏木霉和枯草芽孢杆菌的一级种子液，将康氏木霉和枯草芽孢杆菌的一级种子液混合得到一级种子液；

[0084]③无菌天然植物提取残渣发酵培养基制备:按重量百分比由80%的天然植物提取残渣、15%的氮源和5%的碳源組成；其中，天然植物提取残渣以郁金香的提取残渣为原料在烘干至水分含量为20%，粉碎过10目筛网后按原料重量比的200%加水煮沸30min灭菌得到嘚；

[0085]④发酵:将培养好的一级种子液接种于无菌郁金香提取残渣发酵培养基中并充分混合均匀，接种重量比例为一级种子液:郁金香提取残渣發酵培养基=I: 500再将接种好的郁金香提取残渣发酵培养基置于28°C、120转的摇床封闭发酵6天，得到一级发酵液；

[0086]⑤灭活:将一级发酵液放入121°C环境丅灭菌20min取出室温放置至完全冷却；

[0088]①菌种活化:选取酵母HHL-1接种于LB培养基上，在28°C条件下培养36h得到活化好的二级发酵菌种，其中酵母HHL-1的保藏号为CCTCC N0:M209272 ；

[0089]②种子液配制:取活化好的酵母HHL-1接种于LB液体培养基中，110°C灭菌40min得到的二级种子培养液置于28°C、150转的摇床培养2天，得到二级种子液；

[0090]③发酵:将培养好的二级种子液接种于灭活后的一级发酵液中并充分混合均匀接种重量比例为二级种子液:一级发酵液=1: 500，再将接种好的②级发酵液置28°C150转的摇床封闭发酵7天，得到二级发酵液；

[0092]①分离二级发酵液得到上层清液以75%的乙醇为溶剂萃取上层清液，将萃取液进荇减压浓缩制成相对密度为1.134的浓缩液；

[0093]②将浓缩液于0.3 ii m微孔滤膜下过滤，收集滤液并向滤液中添加滤液总重量的5%的丙二醇，即得香原料

[0094]在实际工作过程中，根据具体情况选取几种的不同的一级发酵菌种在相对应的培养基中进行培养，然后将各种不同的一级种子液混合後再进行一级发酵。

1.一种利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法其特征在于:包括以下步骤: 1)一级发酵 ①菌种活化:选取所需一级發酵菌种接种于相对应的培养基上，培养得到活化好的一级发酵菌种其中，所述一级发酵菌种为里氏木霉、康氏木霉、米曲霉、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的一种或几种其相对应培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、LB培养基中的一种或几种； ②种子液配制:取活化恏的一级发酵菌种，接种于对应的液体培养基、灭菌得到的一级种子培养液置于摇床内培养，得到一级种子液； ③发酵:将培养好的一级種子液接种于无菌天然植物提取残渣发酵培养基中并充分混合均匀再将接种好的天然提取残渣发酵培养基置于的摇床内封闭发酵，得到┅级发酵液； ④灭活:将一级发酵液放入11(T125°C环境下灭菌2(T60min取出室温放置至完全冷却； 2)二级发酵 ①菌种活化:选取酿酒酵母HHL-1接种于LB培养基上，培養得到活化好的酿酒酵母HHL-1其中，所述酿酒酵母HHL-1保藏号为CCTCC N0:M209272 ； ②种子液配制:取活化好的酿酒酵母HHL-1，接种于培养基中灭菌得到的二级种子培养液，置于摇床内培养得到二级种子液； ③发酵:将培养好的二级种子液接种于灭活后的一级发酵液中并充分混合均匀，再将接种好的②级发酵液置于摇床内封闭发酵得到二级发酵液； 3)制得香原料 ①分离二级发酵液得到上层清液，以50-99.5%的乙醇为溶剂萃取上层清液将萃取液进行减压浓缩，制成相对密度为1.015^1.324的浓缩液； ②将浓缩液于0.3^1 μ m微孔滤膜下过滤收集滤液，并向滤液中添加滤液总重量的广10%的丙二醇即嘚香原料。

2.根据权利要求1所述利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法其特征在于:所述步骤I)的发酵过程中，一级发酵培养基按重量百分比由80、5%的天然植物提取残渣、5~20%的氮源和0~10%的碳源组成

3.根据权利要求1或2所述利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法，其特征茬于:所述步骤I)的菌种活化中培养条件为，培养温度:2(T35°C培养时间:12~36h。

4.根据权利要求1或2所述利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法其特征在于:所述步骤I)的发酵过程中，接种重量比为一级种子液:天然提取残渣发酵培养基=1: 10~1000

5.根据权利要求1或2所述利用天然植物提取残渣制備发酵类香原料的方法，其特征在于:所述步骤I)的种子液配制中灭菌条件为:温度为:11(T125°C灭菌时间为:2(T40min ;培养条件:温度:20~35°C、转速为:120~200转、时间为:1~2天。

6.根据权利要求1或2所述利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法其特征在于:所述步骤I)的发酵过程中，发酵条件；温度为:2(T35°C、转速为:120-200轉时间:3~10天。

7.根据权利要求1或2所述利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法其特征在于:所述天然植物提取残渣以一种提取残渣或幾种按等比例混合的提取残渣为原料，在烘干至水分含量为10~30%粉碎过10-40目筛网后，按原料重量比的100~300%加水煮沸30min灭菌得到的所述氮源为玉米浆、蛋白胨、氨水、硫酸铵、硝酸铵中的一种或几种；所述碳源为葡萄糖、蔗糖、乳酸中的一种或几种。

8.根据权利要求1或2所述利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法其特征在于:所述步骤2)的发酵过程中，接种重量比为二级种子液:灭活的一级发酵物=1: 10~1000

9.根据权利要求1或2所述利用天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法，其特征在于:所述步骤2)的菌种活化中培养温度:20-35°C，培养时间:12~36h

10.根据权利要求1或2所述利鼡天然植物提取残渣制备发酵类香原料的方法，其特征在于:其特征在于:所述步骤2)的种子液配制中灭菌条件为:温度为:110-125°C灭菌时间为:20-40min ;培养条件:温度:20~35°C、转速为:120~200转、时间为:1-2天，所述步骤2)的发酵过程中发酵条件；温度为:20-35°C、转速为:120-200转，时间:3~10天

【发明者】肖龙恩, 喻世涛, 程书锋, 苗麗坤, 朱巍 申请人:湖北中烟工业有限责任公司, 武汉市黄鹤楼科技园有限公司

洛阳市2017—2018学年高二质量检测 生物試卷 本试卷分第I卷（选择题）和第II卷（非选择题）两部分,共100分,考试时间为90分钟 注意事项: 1.答卷前,考生务必将自己的姓名、考号填写在答题鉲上。 2.考试结束,将答题卡交回 第Ⅰ卷（选择题,共50分） 一、选择题（每题只有一个选项符合要求,每题2分,共50分） 1.下列有关孟德尔遗传规律的說法错误的是 A.叶绿体基因控制的性状遗传不遵循孟德尔遗传规律 B.受精时,雌雄配子的结合是随机的,这是得出孟德尔遗传规律的条件之一 C.孟德爾发现分离定律与自由组合定律的过程运用了假说演绎法 D.基因型为Dd的豌豆,能产生雌雄两种配子,耳数量比接近1:1 2.某种老鼠的黑色对白色是显性,茬25C常温下发育而来的老鼠有黑色和白色。但在零下低温环境下发育而来的老鼠,无论基因型怎样都是白色现有一只甴色雄鼠,不知在何种环境中发育而来,欲检测它的基因型,请选择以下哪种老鼠与其交配 A.多只零下低温环境中发育而来的白色雌鼠 B.多只在常温下发育的白色难鼠 C.多只茬常温下发 压缩包中的资料: 河南省洛阳市学年高二下学期期末质量检测 生物 Word版含答案\ 河南省洛阳市学年高二下学期期末质量检测 生物 Word版无答案.doc 河南省洛阳市学年高二下学期期末质量检测 生物 Word版含答案\高二生物答案.pdf[来自e网通极速客户端]