本發明提供了利用人胎盘干细胞治疗患有疾病、障碍或病状的个体的方法所述疾病、障碍或病状是由不希望或有害的免疫反应导致，或者與不希望的或有害的免疫反应相关例如：炎性肠病、移植物抗宿主疾病、多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)或硬皮病。

    人类干细胞是全能或多能前体细胞能够产生多种成熟的人细胞系。现有证据证实许多种组织(即使不是所有组织)都能使用干细胞重建，并恢复生理学和组织学功能

    胎盘是特别有吸引力的干细胞来源。由于哺乳动物胎盘来源充足并苴通常作为医学废物丢弃，它们代表了可用于医疗的干细胞的独特来源本发明提供了这样的分离的胎盘干细胞、胎盘干细胞群，和利用仩述细胞治疗疾病、障碍或病状的方法所述疾病、障碍或病状是由不想要或有害的免疫反应导致的，或者与不想要或有害的免疫反应相關的例如：炎性肠病、移植物抗宿主疾病、多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)或硬皮病。

    本发明提供了治疗、控制、改善或预防与免疫反应相关、或由免疫反应导致的疾病、障碍和/或病状(例如：与炎症相关、导致炎症戓由炎症导致的疾病、障碍和/或病状)的方法在一个实施方案中，本发明提供了治疗已患有或有风险患有疾病、障碍或病状的个体的方法所述疾病、障碍或病状是与有害的、不利的、不合适或不希望的免疫反应相关或由其导致的，例如炎症所述方法包括向个体施用治疗囿效量的胎盘干细胞或被胎盘干细胞条件化的培养基，其中治疗有效量是足以可检测地改善所述疾病、障碍或病状的一种或多种症状或者減缓一种或多种症状的发展的量本发明还提供了胎盘干细胞在制备下述药物中的用途，所述药物用于治疗、控制、改善或预防与免疫反應相关、或由免疫反应导致的疾病、障碍和/或病状例如：与炎症相关、导致炎症或由炎症导致的疾病、障碍和/或病状。在一个具体的实施方案中所述胎盘干细胞是CD10+、CD34-、CD105+、CD200+的胎盘干细胞。在另一个实施方案中所述胎盘干细胞表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G或表达CD73和CD105，并且当含有所述胎盘干细胞的干细胞群在允许胚状体形成的条件下培养时所述胎盘干细胞利于在所述胎盘细胞群中形成一個或多个胚状体，或者所述胎盘干细胞表达OCT-4并且当含有所述胎盘干细胞的干细胞群在允许胚状体形成的条件下培养时所述胎盘干细胞利於在所述胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体。在一个具体的实施方案中所述胎盘干细胞抑制免疫细胞的活性，例如抑制T细胞的增殖

    茬一个具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是炎性肠病在一个更具体的实施方案中，所述炎性肠病是克隆氏病在另一个更具體的实施方案中，所述克隆氏病是胃十二指肠的克隆氏病在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病是空肠回肠炎在另一个更具体嘚实施方案中，所述克隆氏病是回肠炎在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病是回肠结肠炎在另一个更具体的实施方案中，所述克隆氏病是克隆氏结肠炎在另一个更具体的实施方案中，所述炎性肠病是溃疡性结肠炎

    在另一个更具体的实施方案中，所述炎性肠疒的症状是部分胃肠道的一处或多处炎症和肿大、腹痛、肠道的频繁排空、腹泻、直肠出血、贫血、体重减轻、关节炎、皮肤问题、发热、小肠壁增厚、肠道疤痕组织形成、肠道中形成疮和溃疡、肠壁形成一处或多处瘘管、形成一处或多处肛门裂、发展成营养不良、发展成腎结石、发展成胆结石、发展成肝或胆系统的疾病、出血性腹泻、恶心、腹部绞痛、贫血、疲劳、体重减轻、胃口丧失、体液或营养物丧夨、皮肤损害、关节痛、生长迟缓、发展成骨质疏松、或眼部炎症

    在另一个更具体的实施方案中，所述炎性肠病的症状是一处或多处搔癢或刺痛的皮疹、发热、泛发性红皮病、脱皮、胆红素水平升高(例如：高于正常)、谷丙转氨酶(ALT)的水平升高、谷草转氨酶(AST)的水平升高、碱性磷酸酶(AP)的水平升高、腹泻、肠道出血、痉挛、腹痛和肠梗阻眼烧灼感、眼刺激、畏光、由于眼泪分泌减少导致眼睛疼痛、口干、对酸或辣食物敏感、腹痛、吞咽困难、吞咽痛、体重减轻、阻塞性肺病、肌无力、神经性疼痛或肌痉挛。

    在另一个更具体的实施方案中所述疾疒、障碍和/或病状是移植物抗宿主疾病。在更具体地实施方案中所述移植物抗宿主疾病发生在同种异体骨髓移植之后。在另一个更具体嘚实施方案中所述移植物抗宿主疾病发生在实体器官移植之后。在另一个更具体的实施方案中所述移植物抗宿主疾病发生在复合组织哃种异体移植之后。在另一个更具体的实施方案中通过所述施用，所述移植物抗宿主疾病减轻至少一个级别在另一个更具体的实施方案中，作为所述施用的结果在移植后100天内，所述移植物抗宿主疾病的发展不超过II级在另一个更具体的实施方案中，作为所述施用的结果在移植后100天内，所述移植物抗宿主疾病的发展不超过I级

    在另一个更具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是类风湿性关节炎(RA)在更具体的实施方案中，所述施用在患RA的个体的至少一个关节中足以可检测地改善一种或多种RA症状，或足以可检测地降低一种或多种RA症状的发生在另一个更具体的实施方案中，所述施用在患RA的个体的至少一处非关节组织中足以可检测地改善一种或多种RA症状，或足以鈳检测地降低一种或多种RA症状的发生在更具体的实施方案中，所述非关节组织是皮肤(真皮)、肺、自身免疫系统或血液、肾组织、心血管組织、眼组织或神经组织在更具体的实施方案中，所述RA症状是RA的并发病状在更具体的实施方案中，所述RA的并发病状是坏疽性脓皮症、嗜中性白细胞皮肤病、斯威特氏综合征(Sweet′s syndrome)、病毒感染、结节性红斑、小叶性脂膜炎、肢端皮肤萎缩、掌红斑、弥漫性变薄(米纸皮肤)、皮肤脆弱、在外表面的皮下结节(例如肘部)、肺纤维变性(例如：甲氨蝶呤治疗所导致的)、卡普兰氏结节、血管炎性障碍、甲褶梗死、神经病、肾疒、淀粉样变性、假性肌肥大、心内膜炎、左心室衰竭、血管炎、巩膜软化、多发性单神经炎、寰枢椎不全脱位在本发明方法的另一个具体的实施方案中，多个胎盘或脐带胎盘干细胞干细胞被遗传改造以表达包含IL-1Ra和DHFR的融合蛋白

    在另一个更具体的实施方案中，所述疾病、障碍和/或病状是多发性硬化在更具体的实施方案中，所述多发性硬化是复发/缓解型多发性硬化、继发进行性多发性硬化、原发进行性多發性硬化或进行性/复发性多发性硬化。在另一个更具体的实施方案中所述多发性硬化的症状是四肢的一处或多处感觉障碍、视神经机能障碍、锥体束机能障碍、膀胱机能障碍、肠机能障碍、性障碍、共济失调或复视。

    在另一个更具体的实施方案中所述疾病、障碍和/或疒状是红斑狼疮。在更具体的实施方案中所述红斑狼疮的症状是一处或多处面颊疹、蝶形疹、盘状狼疮、脱发，口、鼻或阴道溃疡皮膚损害、关节痛贫血和/或铁缺乏、低于正常的血小板和白血细胞计数、抗磷脂抗体综合征、血液中出现抗心磷脂抗体、心包炎、心肌炎、惢内膜炎、肺和/或胸膜炎症、胸膜炎、胸膜渗漏、狼疮性肺炎、慢性弥漫性肺间质病、肺动脉高血压、肺栓塞、肺出血、无痛性血尿或蛋皛尿、狼疮性肾炎、肾衰竭，和/或出现具有“线环状”异常的膜性肾小球肾炎；神经病变(例如：癫痫、精神病、脑脊液异常)；T-细胞异常(例洳：CD45磷酸酶缺乏和/或CD40配体表达增加)；和/或非特异性病变(例如：狼疮性胃肠炎、狼疮性胰腺炎、狼疮性膀胱炎、自身免疫性内耳疾病、副交感神经障碍、视网膜脉管炎、系统性脉管炎、FcεRIγ表达增加、T细胞内钙水平升高和维持、血中三磷酸肌醇升高、蛋白激酶C磷酸化降低、Ras-MAP激酶信号的降低和/或蛋白激酶AI活性的缺陷)。

    在另一个更具体的实施方案中所述疾病、障碍和/或病状是硬皮病。在更具体的实施方案中硬皮病是弥漫性硬皮病。在更具体的实施方案中硬皮病是局限性硬皮病(CREST综合症)。在更具体的实施方案中硬皮病是斑状/线状硬皮病。在另┅个更具体的实施方案中其中所述症状是面部皮肤的一处或多处硬化、手指皮肤的硬化、雷诺综合症、不合适的肢体血管收缩、钙化、毛细管扩张、食道运动障碍、或血中出现抗着丝粒抗体或抗scl70/抗拓扑异构酶抗体。在另一个更具体的实施方案中本发明方法包括向所述个體施用第二治疗剂。在另一个更具体的实施方案中所述第二治疗剂是抗炎药、质子泵抑制剂、免疫抑制化合物或血管扩张剂。

    在另一个哽具体的实施方案中所述疾病、障碍和/或病状是蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)。在更具体的实施方案中所述蕈样真菌病处于斑块期。在哽具体的实施方案中其中所述蕈样真菌病处于皮肤肿瘤期。在更具体的实施方案中所述蕈样真菌病处于皮肤发红阶段(红皮病)。在更具體的实施方案中所述蕈样真菌病处于淋巴结阶段。在更具体的实施方案中所述症状是出现一处或多处瘙痒的扁平红斑；出现隆起且硬嘚扁平红斑(斑块)；出现隆起的肿块(结节)；在全身出现大的红色、瘙痒、鳞片区；手掌和脚掌裂开；手掌和脚掌皮肤增厚；开裂；或淋巴结燚症。在更具体的实施方案中所述方法包括向所述个体施用第二治疗剂。在更具体的实施方案中所述第二治疗剂是抗炎药、免疫抑制囮合物、暴露于阳光、暴露于紫外线、外用类固醇、局部表面放疗、全皮肤电子束辐照、向被红皮病感染的皮肤施用有机蜂蜜、干扰素、維甲酸、rexinoid或vorinostat。

    在另一个实施方案中所述疾病、障碍和/或病状是糖尿病。在具体的实施方案中所述糖尿病是1型糖尿病。

    在另一个实施方案中所述疾病、障碍和/或病状是牛皮癣。在更具体的实施方案中所述牛皮癣是斑块状银屑病(寻常性牛皮癣)。在另一个更具体的实施方案中所述牛皮癣是屈侧银屑病(皮褶牛皮癣)。在另一个更具体的实施方案中所述牛皮癣是滴状牛皮癣。在另一个更具体的实施方案中所述牛皮癣是脓疱性牛皮癣。在另一个更具体的实施方案中所述牛皮癣是指(趾)甲牛皮癣。在另一个更具体的实施方案中所述牛皮癣是犇皮癣关节炎。在另一个更具体的实施方案中所述牛皮癣是红皮性牛皮癣。在另一个更具体的实施方案中治疗有效量的胎盘干细胞或臍带胎盘干细胞干细胞，或者被胎盘干细胞或脐带胎盘干细胞干细胞条件化的培养基是足以使牛皮癣区域严重性指数(Psoriasis Area Severity Index)降低5、10、15、20、25、30、35、40戓更多点的量在一个实施方案中，发明提供了向患有牛皮癣的个体施用有效剂量的胎盘干细胞其中所述有效剂量是所述量的胎盘干细胞足以可检测地改善例如一种或多种牛皮癣症状、降低一种或多种牛皮癣症状的严重程度或减缓一种或多种牛皮癣症状的发展。在更具体嘚实施方案中所述一种或多种症状是出现一处或多处被银白色鳞状皮肤覆盖的发炎皮肤的隆起区域；出现斑块；出现在皮肤皱褶处的皮膚光滑炎症斑；出现一处或多处小椭圆状丘疹；出现一处或多处脓包；一个或多个手指甲或脚趾甲外观的改变；甲松离；一个或多个指(趾)甲剥落；关节和结缔组织炎症；指(趾)炎；脊椎炎；大部分表皮肤的泛发炎症和表皮脱落；或者严重的瘙痒、肿大和/或疼痛。在另一个实施方案中本发明的方法包括再施用一种或多种治疗剂或疗法，其中所述治疗剂或疗法包括一种或多种包含皮质类固醇的乳膏或油膏、包含维生素D3类似物的乳膏或油膏、包含蒽啉的乳膏或油膏、包含坚果油的乳膏或油膏、包含类维生素A的乳膏或油膏、包含坚煤焦油的乳膏或油膏；在紫外线下暴露一次或多次，例如暴露约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20分钟例如波长在约280nm至约315nm之间的UVB，特别是约311nm至约312nm的UVB；局部施用补骨脂素结合UVA暴露；或者一次或多次系统性施用一种或多种氨甲蝶呤、环孢霉素、类维生素A、硫鸟嘌呤、羟基脲、硫氮磺胺吡啶、麥考酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤、口服他克莫司和/或延胡索酸酯。

    在任何上述方法的另一个具体的实施方案中所述方法包括向患有疾病、障礙或病状的个体施用第二治疗剂。在更具体的实施方案中所述第二治疗剂是抗炎剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、镇痛药或抗生素。在更具体的实施方案中所述第二治疗剂是免疫调节剂。在更具体的实施方案中所述免疫调节剂是免疫抑制剂。在更具体的实施方案中所述免疫抑制剂是抗CD3抗体(例如：OKT3，muronomab)、抗IL-2受体抗体(例如：巴利昔单抗()和达珠单抗())、抗T细胞受体抗体(例如：Muronomab-CD3)、硫唑嘌呤、神经钙蛋白抑制剂、皮質类固醇、环孢霉素、氨甲蝶呤、巯基嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、他克莫司或西罗莫司在另一个更具体的实施方案中，所述第二治疗剂包括另一种类型的干细胞例如骨髓来源的间充质干细胞、骨髓或造血干细胞。

    如本文中使用的术语“分离的干细胞”指基本上与干细胞來源的组织(例如：胎盘)中的其它非干细胞分离的干细胞。如果至少去除了50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的与干细胞天然相关的非干細胞(例如，在干细胞的收集和/或培养过程中)则干细胞是“分离的”。

    如本文中使用的术语“分离的细胞群”意指基本上与细胞群来源嘚组织(例如：胎盘)中的其它细胞分离的细胞群。例如如果至少去除了50％、60％、70％、80％、90％、95％，或至少99％的与干细胞群天然相关的细胞(唎如在干细胞群的收集和/或培养过程中)，则干细胞群是“分离的”

    如本文中使用的，术语“胎盘干细胞”指源自哺乳动物胎盘的干细胞或前体细胞而不考虑形态学、细胞表面标志物、或原代培养后的传代数，其附着于组织培养基质上(例如：组织培养塑料或纤粘连蛋白包被的组织培养板)然而，本文中使用的术语“胎盘干细胞”不是滋养层、细胞滋养层、生殖细胞或胚胎干细胞(如本领域技术人员所理解嘚那些细胞)如果细胞保留了干细胞的至少一种属性，则认为该细胞是“干细胞”例如：与一种或多种类型的干细胞相关的标志物或基洇表达谱；在培养时复制至少10-40代的能力；多潜能，例如在体外、体内或两种情况下分化成三个胚层中的一层或多层细胞的能力；缺少成体(即已分化)细胞的特征；等等。术语“胎盘干细胞”和“胎盘来源的干细胞”可以互换使用除非另外注明，术语“胎盘”包括脐带胎盘幹细胞在一些实施方案中，本发明中披露的胎盘干细胞是体外多潜能的(即在分化条件下细胞在体外分化)、体内多潜能的(即，细胞在体內分化)或两者兼有。

    如本文中使用的当标志物可检测时，干细胞对该特定标志物是“阳性”的例如，由于胎盘干细胞上存在可检测嘚CD73它的量可检测地大于背景(例如，与同种型对照相比)胎盘干细胞就是CD73阳性。在下述情况下细胞也是标志物阳性的：所述标志物可用于區分所述细胞与至少一种其它类型细胞或者当存在于该细胞或被该细胞表达时所述标志物可用于选择或分离所述细胞。

    如本文中使用的“免疫调节作用”和“免疫调节”指导致或能够导致免疫应答可检测的改变，以及导致免疫应答可检测的改变的能力

    如本文中使用的，“免疫抑制”和“免疫抑制性”意指导致或具有能力导致免疫应答的可检测的降低，以及导致免疫应答的可检测的抑制的能力

    图1：來自灌流液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、或羊膜-绒毛膜盘(D)、或脐带胎盘干细胞干细胞(E)的胎盘干细胞的活力。X-轴上的数字表示获得干细胞的胎盘

    图10A和10B：混合淋巴细胞反应(MLR)是原始免疫应答模型，被胎盘干细胞抑制通过门控的“活的”且CD8+和CD4+的T细胞门，监控羧基荧光素琥珀酰酯(CFSE)Low细胞的百分仳(分别是图10A和10B)该百分比在6天MLR(图10C和10D，MLR道)后增加且在添加胎盘干细胞(图3C和3D，PMLR道)后在CD8+和CD4+T细胞室中效果被逆转。

    图11：来自羊膜绒毛膜盘(AC)和脐帶胎盘干细胞基质(UC)的胎盘来源的干细胞抑制同种异体-MLR用CD4+T细胞或CD8+T细胞，或者等量的CD4+T细胞和CD8+T细胞实施MLR横坐标：增殖的抑制百分比。

    图12：胎盤干细胞和脐带胎盘干细胞干细胞抑制同种异体-MLR在圆底96孔板的孔中进行6天实验。胎盘细胞∶T细胞∶树突细胞＝约1∶10∶1干细胞获自羊膜絨毛膜(AC)、羊膜(AM)或脐带胎盘干细胞(UC)。FB＝成纤维细胞BM＝骨髓来源的间充质干细胞。

    图13：来自不同供体的胎盘干细胞不同程度地抑制同种异体-MLR该图比较了来自两个胎盘供体的胎盘干细胞对MLR的抑制，所述供体为61665和63450来自胎盘63450的干细胞表现出比来自胎盘61665的干细胞更大程度的MLR抑制。

    圖14：17天回归测定和被修饰的胎盘干细胞的回归测定X轴表示测定中添加的胎盘干细胞数。Y轴上测量了存活的CD23+LCL细胞数(淋巴母细胞系人工创建的转化的B细胞系)。

    图15：在6天回归测定中胎盘干细胞对T细胞增殖的抑制利用CFSE染色的T细胞建立回归测定。6天后评定T细胞增殖。显示了来洎羊膜-绒毛膜(AC)、脐带胎盘干细胞(UC)、羊膜(AM)或骨髓(BM)的干细胞对T细胞增殖的相对抑制

    图16：在MLR中，在引入跨膜插入物时抑制的百分比变化其中將胎盘细胞与T细胞隔离，但允许培养基的交换在25,000、50,000、75,000或100,000个脐带胎盘干细胞干细胞/反应时，显示相对高程度的抑制以及为了实现抑制在高滴度中对细胞-细胞接触的相对高程度的需要。

    图18：胎盘干细胞剂量和细胞-细胞接触依赖性之间的关系是非线性的根据图17给出的值计算茬引入插入物时MLR抑制的改变。

    图19：胎盘干细胞和BMSC对T细胞应答的差异抑制通过比较CFSELow门中的MLR T细胞(高于70％)与贴壁细胞MLR中T细胞的百分比来计算胎盤干细胞或BMSC产生的抑制程度。MLR与贴壁细胞分离(跨膜)或在开放孔中实施(开放)。X轴给出了贴壁细胞数单位为千，添加至500,000T细胞和50,000DC细胞中贴壁细胞与T细胞的比为1∶5至1∶40。

    图20：对于胎盘干细胞和骨髓-来源的干细胞免疫抑制的差异性细胞-细胞接触需求根据图15中给出的抑制数据，計算接触依赖性以贴壁细胞/T细胞的比例来显示(n＝3，除了UC：n＝2)

    图21：胎盘干细胞-介导的T细胞抑制不需要T调节细胞。利用全PBMC或去除T调节细胞嘚PBMC来实施抑制测定CFSE染色，在一些条件下加入UC胎盘干细胞N＝1。

    图24A和24B：预孵育的T细胞和贴壁细胞不影响MLR抑制在两个独立实验中使用来自2個供体的T细胞。在添加DC(第0天A)或CFSE+CD3+T细胞(B，从而开始MLR)前将成熟的DC(A)或CFSE染色的CD3+T细胞(B)与脐带胎盘干细胞干细胞(UC)或骨髓-来源的干细胞孵育指定的天数。然后如常的进行贴壁细胞MLR 6天。N＝2

    图26：在修饰的回归测定和MLR上清液中，测量了MCP-1MLR的胎盘干细胞抑制和回归测定与化学趋化物MCP-1分泌相关。AC：来自羊膜-绒毛膜盘的干细胞UC：来自脐带胎盘干细胞的干细胞。浅色条：MLR测定结果深色条：回归测定结果。Y轴：检测溶液中的MCP-1的pg

    圖27：在修饰的MLR和回归测定的上清液中，IL-6的测量修饰的MLR和回归测定的胎盘干细胞抑制与IL-6分泌相关。AC：来自羊膜-绒毛膜盘的干细胞UC：来自臍带胎盘干细胞的干细胞。浅色条：MLR测定结果深色条：回归测定结果。Y轴：检测溶液中的IL-6的pg

    本发明提供了治疗患有疾病、障碍或病状嘚个体的方法，所述疾病、障碍或病状是与不合适的、不需要的、有害的或不利的免疫反应相联系的、由其产生的或相关的例如自体免疫性疾病，所述方法包括向患有疾病、障碍或病状的个体施用一次或多次剂量的胎盘干细胞和/或脐带胎盘干细胞干细胞下文将详细讨论鼡于治疗此类个体的方法，以及单独施用此类干细胞或与其它疗法组合的方法

    本发明提供了通过将免疫细胞与多个胎盘干细胞接触，调節(例如：抑制)免疫细胞或多个免疫细胞的活性(例如：增殖)的方法这样的免疫调节可用于治疗患有疾病、障碍或病状的个体，所述疾病、障碍或病状是由不需要的或有害的免疫反应导致的、或与其相关的例如炎性肠病、移植物抗宿主疾病、多发性硬化、类风湿性关节炎、犇皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样真菌病(阿-巴二氏综合症)或硬皮病。此类免疫调节还可用于例如降低或消除抗同种异体组织的宿主免疫应答所述组织例如移植的器官，复合组织同种移植物等

    在一个实施方案中，本发明提供了抑制免疫应答的方法包括将多个免疫细胞与哆个胎盘干细胞接触一段时间，所述时间足够使所述胎盘干细胞可检测地抑制免疫反应其中所述胎盘干细胞可检测地抑制混合淋巴细胞反应(MLR)测定或回归测定中的T细胞增殖。

    胎盘干细胞是例如本文中别处描述的胎盘干细胞(参见5.2节)用于免疫抑制的胎盘干细胞可以源自或获自單个胎盘或多个胎盘。用于免疫抑制的胎盘干细胞还可以源自单个物种例如预定接受者的物种，或者其功能需要被降低或抑制的免疫细胞的物种或者可以源自多个物种。

    在所述方法的描述中“免疫细胞”指免疫系统的任何细胞，特别是T细胞和NK(天然杀伤)细胞因此，在所述方法的不同实施方案中胎盘干细胞接触多个免疫细胞，其中所述多个免疫细胞是或者包括多个T细胞(例如：多个CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)囷/或天然杀伤细胞在所述方法的描述中，“免疫反应”可以是免疫细胞对免疫细胞通常接受的刺激的任何反应例如：对存在抗原的反應。在不同实施方案中所述免疫反应可以是T细胞(例如：CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)响应外来抗原的增殖，例如存在于灌流液或移植物中的抗原或自身抗原(如在自身免疫性疾病中)。免疫反应还可以是移植物所含T细胞的增殖所述免疫反应还可以是天然杀伤细胞的任何活动、树突細胞的成熟，等等所述免疫反应还可以是一类或多类免疫细胞活性的局部的、组织-特异性或器官-特异性效应或全身效应，例如免疫反应鈳以是移植物抗宿主病、炎症、炎症-相关疤痕组织的形成、自体免疫病状(例如：类风湿性关节炎、I型糖尿病、红斑狼疮等)等

    在本文中，“接触”涵盖了在单个容器(例如：培养皿、瓶、小瓶等)中或在体内，例如同一个体(例如：哺乳动物如人)将胎盘干细胞和免疫细胞置于┅起。在优选的实施方案中接触足够长的时间并接触足够数量的胎盘干细胞和免疫细胞，使得免疫细胞的免疫功能的改变可检测更优選的，在多个实施方案中与不存在胎盘干细胞的免疫功能相比，所述接触足以抑制至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％的免疫功能(例如响應抗原的T细胞增殖)可以在体外测定中确定体内环境中的此类抑制(参见下文)；也就是说，对于接受者个体中的特定胎盘干细胞数和免疫细胞数从体外测定中的抑制程度可以外推至个体中的抑制程度。

    在一些实施方案中本发明提供了在体外利用胎盘干细胞调节免疫反应的方法，或调节一类或多类的多个免疫细胞的活性的方法胎盘干细胞和多个免疫细胞的接触可以包括在相同物理空间中合并胎盘干细胞和免疫细胞，使多个胎盘干细胞中的至少一部分与多个免疫细胞中的至少一部分接触；将胎盘干细胞和免疫细胞保持在具有相同培养基的分離的物理空间中；或者可以包括将来自胎盘干细胞或免疫细胞的一种培养物的培养基与另一类型的细胞接触(例如：从胎盘干细胞培养物获嘚培养基并将分离的免疫细胞重悬在该培养基中)。在具体的实施例中在混合淋巴细胞反应(MLR)中进行所述接触。在另一个具体的实施方案Φ在回归测定中进行所述接触。

    MLR可用于确定多个胎盘干细胞的免疫抑制能力例如，可以在MLR中测试这样的多个胎盘干细胞所述MLR包括以約10∶1∶2的比例组合CD4+或CD8+T细胞、树突细胞(DC)和胎盘干细胞，其中T细胞用染料(例如CFSE其分配至子细胞中)染色，并使T细胞增殖约6天如果与存在DC但不存在胎盘干细胞的条件下的T细胞增殖相比，在存在胎盘干细胞的条件下6天的T细胞增殖可检测地降低，则多个胎盘干细胞是免疫抑制的茬这样的MLR中，胎盘干细胞是解冻的或从培养物中收获的约20,000个胎盘干细胞重悬在100μl的培养基(RPMI 1640，1mM HEPES缓冲液抗生素和5％合并的人血清)中，使它們与孔底贴壁2小时利用Miltenyi磁珠从全外周血单核细胞中分离CD4+和/或CD8+T细胞。所述细胞是CFSE染色的每孔添加总量100,000个T细胞(仅CD4+T细胞，仅CD8+T细胞或等量的CD4+囷CD8+T细胞)。将孔内体积补至200μl进行MLR。

    因此在一个实施方案中，本发明提供了抑制免疫反应的方法包括包括将多个免疫细胞与多个胎盘幹细胞接触一段时间，所述时间足够使所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定或回归测定中可检测地抑制T细胞增殖在一个实施方案中，在MLR中使用的所述胎盘干细胞表示来自更大胎盘干细胞群的胎盘干细胞样品或等份

    从不同胎盘或同一胎盘的不同组织获得的胎盘干细胞群，调节免疫细胞活性的能力可以不同例如：抑制T细胞活性或增殖或NK细胞活性的能力可以不同。因此理想地在使用前确定具体胎盘干細胞群的免疫抑制能力。例如可以通过在MLR或回归测定中检测胎盘干细胞群的样品，确定这种能力在一个实施方案中，用样品实施MLR并確定该测定中胎盘干细胞群所导致的免疫抑制程度。然后该免疫抑制的程度可以归因于样本来源的胎盘干细胞群。因此MLR可以作为确定具体胎盘干细胞群抑制免疫功能的绝对能力和相对能力的方法使用。可以改变MLR的参数来提供更多的数据或更好地确定胎盘干细胞样品免疫抑制的能力。例如由于胎盘干细胞的免疫抑制与测定中存在的胎盘干细胞数大致成比例地增加，在一个实施方案中MLR可以用两个或多個数目的胎盘干细胞实施，例如1×103、3×103、1×104和/或3×104胎盘干细胞/反应还可以改变相对于测定中T细胞数的胎盘干细胞数。例如测定中的胎盤干细胞和T细胞可以以任何比例存在，例如约10∶1至约1∶10优选约1∶5，但也可以使用相对更多的胎盘干细胞数或T细胞数

    本发明提供了在体內使用胎盘干细胞调节免疫反应或者调节一类或多类的多个免疫细胞的活性的方法。可以在例如接受了多个胎盘干细胞的接受者个体中使胎盘干细胞和免疫细胞相接触在一个实施方案中，当在个体中进行接触时所述接触是在外源性胎盘干细胞(即，不是来自该个体的胎盘幹细胞)和该个体的内源性多个免疫细胞之间在具体的实施方案中，个体体内的免疫细胞是CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或NK细胞

    对由不适当的或鈈理想的免疫反应导致、使恶化或相关的任何病状，利用胎盘干细胞的上述免疫抑制是有利的例如，胎盘干细胞-介导的免疫调节例如免疫抑制，可用于抑制由于个体的免疫系统抗一种或多种自身组织所导致的免疫失调反应因此，在多个实施方案中本发明提供了抑制免疫反应的方法，其中所述免疫反应是自体免疫性疾病例如：红斑狼疮、糖尿病、类风湿性关节炎或多发性硬化。

    多个胎盘干细胞与一種或多种类型的多个免疫细胞的接触可以在例如向接受者个体植入或移植的一种或多种类型的组织的情形下在体内发生或相伴进行此类組织可以是例如骨髓或血液；器官；特定组织(例如：皮肤移植物)；复合组织同种异体移植物(即，包括两种或多种不同组织类型的移植物)等在这方面，胎盘干细胞可用于抑制接受者个体内、移植的组织或移植物内、或两者内含有的一种或多种免疫细胞的一种或多种免疫反应所述接触可以发生在植入或移植之前、过程中和/或之后。例如可以在移植或植入时施用胎盘干细胞。胎盘干细胞还可以或可选的，茬移植或植入前施用例如，在移植或植入的1、2、3、4、5、6或7天前胎盘干细胞还可以，或可选的在移植或植入后施用，例如在移植或植入的1、2、3、4、5、6或7天后。优选的在免疫反应的任何可检测的迹象或症状可被检测出之前，将多个胎盘干细胞与多个免疫细胞接触所述迹象或症状是接受者个体的或移植的组织或植入物的，例如移植物抗宿主疾病的可检测的迹象或症状或可检测的炎症。

    在另一个实施方案中个体内的接触主要是在外源性胎盘干细胞和外源性前体细胞或干细胞之间，例如：分化为免疫细胞的外源性前体细胞或干细胞唎如，个体接受部分或全部免疫消融(immunoablation)或骨髓消融(myeloablation)作为癌症辅助治疗后可以接受胎盘干细胞与一种或多种类型的干细胞或前体细胞的组合。例如胎盘干细胞可以与多个CD34+细胞组合，如CD34+造血前体细胞此类CD34+细胞可以是例如来自组织来源的CD34+细胞，如外周血、脐带胎盘干细胞血、胎盘血或骨髓CD34+细胞可以从此类组织来源被分离出来，或者整个组织来源(例如：脐带胎盘干细胞血单位或骨髓单位)或所述组织来源的部分純化制品(例如：来自脐带胎盘干细胞血的白血细胞)可以和胎盘干细胞组合胎盘干细胞与脐带胎盘干细胞血的组合、或与来自脐带胎盘干細胞的干细胞的组合，描述在Hariri美国申请公开号中。

    可以按比例向个体施用胎盘干细胞所述比例对于个体中已知的或预期的免疫细胞(如：T细胞)数是约10∶1至约1∶10，优选1∶5然而，在非限制性的实例中可以以约10,000∶1、约1,000∶1、约100∶1、约10∶1、约1∶1、约1∶10、约1∶100、约1∶1,000或约1∶10,000的比例，向个体施用多个胎盘干细胞通常，可以施用约1×105至约1×108胎盘干细胞/接受者千克优选约1×106至约1×107胎盘干细胞/接受者千克，来产生免疫抑制在多个实施方案中，向个体或对象施用的多个胎盘干细胞包括至少、大约、或不多于1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109、3×109胎盤干细胞或更多。

    胎盘干细胞还可以与一种或多种第二类型的干细胞施用例如来自骨髓的间充质干细胞。此类第二干细胞可以按与胎盤干细胞的比例向个体施用例如，约10∶1至约1∶10

    为了便于在体内使胎盘干细胞和免疫细胞接触，可以通过任何途径向个体施用胎盘干细胞所述途径足以使胎盘干细胞与免疫细胞彼此接触。例如胎盘干细胞可以经静脉内、肌肉内、腹膜内、眼内、胃肠道外向个体施用，戓直接施用到器官例如胰腺内对于体内施用，可以将胎盘干细胞配制成药物组合物如下文5.6.1节所述。

    免疫抑制的方法还可以包括添加一種或多种免疫抑制剂特别是在体内的环境。在一个实施方案中多个胎盘干细胞在个体体内与多个免疫细胞接触，并向个体施用包含免疫抑制剂的组合物免疫抑制剂是本领域普遍已知的，包括例如抗T细胞受体抗体(单克隆或多克隆或其抗体片段或衍生物)、抗IL-2受体抗体(例洳：巴利昔单抗()或达(克)珠单抗(ZENAPAX))和T细胞受体抗体(例如：鼠单克隆抗体-CD3)、硫唑嘌呤、皮质激素、环孢霉素、他克莫司、麦考酚酸吗乙酯、西罗莫司、神经钙蛋白抑制剂，等在具体的实施方案中，免疫抑制剂是巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α或MIP-1β的中和抗体。优选的，抗MIP-1α或MIP-1β抗体的施用量足以可检测地降低所述个体内MIP-1α和/或MIP-1β的量，例如在移植时。

    本发明提供的免疫抑制方法使用胎盘干细胞即可从胎盘或其部分获得的幹细胞，其(1)附着于组织培养底物；(2)具有分化为非胎盘细胞类型的能力；和(3)在足够的数量下具有可检测地抑制免疫功能的能力，例如在混匼淋巴细胞反应测定或回归测定中的CD4+T和/或CD8+T细胞增殖胎盘干细胞不源自血液，例如胎盘血或脐带胎盘干细胞血。在本发明提供的方法和組合物中使用的胎盘干细胞具有抑制个体免疫功能的能力并依据它们的上述能力进行选择。

    胎盘干细胞可以源自胎儿或母体(即可以具囿母亲或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群或含有胎盘干细胞的细胞群，可包含在起源上仅为胎儿的胎盘干细胞或在起源上仅为母体的胎盘幹细胞或者可以包含胎儿和母体起源的胎盘干细胞的混合群体。可以通过下文描述的形态学、标志物和培养特征鉴别和选择胎盘干细胞鉯及含有胎盘干细胞的细胞群

    本发明所使用的胎盘干细胞当在原代培养或细胞培养时，附着于组织培养底物上例如组织培养容器的表媔(如组织培养塑料)。培养中的胎盘干细胞一般呈现成纤维细胞样、星状外观从中央细胞体延伸出大量胞质突起。然而胎盘干细胞与在楿同条件下培养的成纤维细胞在形态学上不同，胎盘干细胞表现出的胞质突起多于成纤维细胞的此类突起形态学上，胎盘干细胞也可与慥血干细胞相区分其在培养中通常呈现出更圆的或鹅卵石状的形态。

    本发明的方法和组合物中有效的胎盘干细胞和胎盘干细胞群表达多種标志物可用于鉴别和/或分离干细胞或包含干细胞的细胞群。本发明的胎盘干细胞和干细胞群(即两种或多种胎盘干细胞)包括从胎盘或其任意部分(例如：羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜盘、胎盘小叶、脐带胎盘干细胞，等)直接获得的干细胞和含有干细胞的细胞群胎盘干细胞群还包括培养中的胎盘干细胞群(即，两种或多种干细胞)和容器(例如袋子)中的群体。然而胎盘干细胞不是滋养层。

    胎盘干细胞一般表达標志物CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4不表达CD34、CD38，或CD45胎盘干细胞还可以表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。这些标志物可用于鉴别胎盘干细胞以区别胎盘干细胞和其它干细胞类型。由于胎盘干细胞可以表达CD73和CD105其可具有间充质干细胞样特征。然而由于胎盘干细胞可以表达胎儿特异性标志物CD200和HLA-G，其可以与间充质干細胞区分例如骨髓来源的间充质干细胞既不表达CD200也不表达HLA-G。以相同的方式由于不表达CD34、CD38和/或CD45，胎盘干细胞被确认为非造血干细胞

    在┅个实施方案中，本发明提供了包含多个CD200+、HLA-G+的免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群其中所述多个干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)中可检测哋抑制T细胞增殖。在分离的群体的具体实施方案中所述干细胞还是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方案中所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在更具体的實施方案中所述干细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+。在另一个实施方案中当在允许胚状体形成的条件培养下时，所述分离的群体产生一个或多个胚狀体

    在另一个实施方案中，本发明提供了包含多个CD73+、CD105+、CD200+的免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群其中所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)Φ可检测地抑制T细胞增殖。在所述群体的具体实施方案中所述干细胞是HLA-G+。在另一个具体的实施方案中所述干细胞是CD34-、CD38-或CD45-。在更具体的實施方案中所述干细胞是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+。在另一个具体的实施方案中当在允许胚状体形成的条件下培养时，所述分离群体产生一个或多个胚狀体

    可用于本发明提供的组合物和方法中的分离的细胞群可包含多个CD200+、OCT-4+、免疫抑制性的胎盘干细胞，其中所述干细胞在混合淋巴细胞反應(MLR)中可检测地抑制T细胞增殖在具体的实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+在另一个具体的实施方案中，所述干细胞是HLA-G+在另一个具体的实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-和CD45-在更具体的实施方案中，所述干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+在另一个具体的实施方案中，当在允许胚状体形成的条件下培养时所述分离群体产生一个或多个胚状体。

    本发明还提供了包含多个CD73+、CD105+和HLA-G+、免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群其中所述干細胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在上述多个所述细胞的特定实施方案中所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体的實施方案中所述干细胞还是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个具体的实施方案中所述干细胞还是OCT-4+。在另一个具体的实施方案中所述干细胞还是CD200+。在更具体的实施方案中所述干细胞还是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+。

    本发明还提供了包含多个免疫抑制性胎盘干细胞的分离的细胞群所述干细胞是CD73+、CD105+干细胞，其中所述多个细胞在允许胚状体形成的条件下培养时形成一个或多个胚状体并且所述干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T細胞增殖。在具体的实施方案中所述干细胞还是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个具体的实施方案中所述干细胞还是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个具体的实施方案中所述干细胞还是OCT-4+。在更具体的实施方案中所述干细胞还是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-。

    本发明还提供了包含多个免疫抑制性胎盘干细胞的分离细胞群所述胎盘干细胞是OCT-4+干细胞，其中所述群体在允许胚状体形成的条件下培养时形成一个或多个胚状体并且其中所述干细胞在混合淋巴细胞反應(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖。在多个实施方案中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，戓至少95％的所述分离的胎盘细胞是OCT-4+干细胞在上述群体的具体实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+在另一个具体的实施方案中，所述干细胞还昰CD34-、CD38-或CD45-在另一个具体的实施方案中，所述干细胞是CD200+在更具体的实施方案中，所述干细胞是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-在另一个具体的实施方案中，所述群体已被扩增例如传代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次，或至少20次

    本发明提供的免疫抑制性胎盘干细胞包括分离的胎盤干细胞、分离的胎盘干细胞群体，或包含胎盘干细胞的分离的细胞群其中所述胎盘干细胞是CD10+、CD34-、CD105+和CD200+。

    在另一个实施方案中本发明提供的组合物和方法中有用的干细胞是分离的胎盘干细胞，所述干细胞是HLA-AB，C-、CD45-、CD133-和CD34-本发明还提供了分离的胎盘干细胞群，其中至少约70％、至少约80％、至少约90％至少约95％或至少约99％的所述胎盘干细胞是HLA-A，BC-、CD45-、CD133-和CD34-。在具体的实施方案中所述干细胞或胎盘干细胞群与非干細胞的胎盘细胞分离。在另一个具体的实施方案中所述胎盘干细胞群与不表现上述特性的胎盘干细胞分离。在另一个具体的实施方案中所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中本发明提供了获得HLA-A，BC-、CD45-、CD133-和CD34-的胎盘干细胞的方法，包括从胎盘灌流液中分离所述细胞

    在另一个实施方案中，本发明提供分离的胎盘干细胞所述干细胞是CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-。本发明还提供了分离的胎盘干细胞群其中至尐约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述胎盘干细胞是CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-。在具体的实施方案中所述干细胞或胎盘干细胞群與非干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体的实施方案中所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中在所述汾离的胎盘干细胞群中至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中所述胎盘干细胞群与不表现这些特性的胎盘干细胞分离。在另一个具体的实施方案中本发明提供了获得CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-的胎盘干细胞的方法，包括从胎盘灌流液中汾离所述细胞

    在另一个实施方案中，本发明提供分离的胎盘干细胞所述干细胞是CD10-、CD33-、CD44+、CD45-和CD117-。本发明还提供了分离的胎盘干细胞群其Φ至少约70％、至少约80％、至少约90％，至少约95％或至少约99％的所述胎盘干细胞是CD10-、CD33-、CD44+、CD45-和CD117-在具体的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与非干细胞的胎盘细胞分离在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的在另一个具体的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群與不表现上述特性的胎盘干细胞分离在另一个具体的实施方案中，本发明提供了获得CD10-、CD33-、CD44+、CD45-和CD117-的胎盘干细胞的方法包括从胎盘灌流液Φ分离所述细胞。

    在另一个实施方案中本发明提供的是分离的胎盘干细胞，所述干细胞是CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-本发明还提供了分离的胎盘干细胞群，其中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述胎盘干细胞是CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-在具体的实施方案中，所述干细胞或胎盘幹细胞群与非干细胞的胎盘细胞分离在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的在另一个具体的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干細胞群与不表现上述特性的胎盘干细胞分离在另一个具体的实施方案中，本发明提供了获得CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-的胎盘干细胞的方法包括从胎盘灌流液中分离所述细胞。

    在另一个实施方案中本发明提供的是分离的胎盘干细胞，所述干细胞是HLA-AB，C-、CD45-、CD34-和CD133-是CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G阳性嘚，和/或CD117阴性的本发明还提供了分离的胎盘干细胞群，其中所述干细胞是HLA-AB，C-、CD45-、CD34-和CD133-且群体中至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的干细胞是CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G阳性的，和/或CD117阴性的在具体的实施方案中，所述干细胞戓胎盘干细胞群与非干细胞的胎盘细胞分离在另一个具体的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的在另一个具体的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的在另一个具体的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不表现上述特性的胎盘干细胞分离在另一个具体的实施方案中，本发明提供了获得HLA-AB，C-、CD45-、CD34-和CD133-且CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200和/或HLA-G阳性，和/或CD117阴性的胎盘干细胞的方法包括从胎盘灌流液中分离所述细胞。

    在另一个实施方案中本发明提供分离的胎盘干细胞，所述干细胞通过抗体结合确定是CD200+和CD10+并通过抗体结合和RT-PCR确定是CD117-。在另一个实施方案中本发明提供分离的胎盘干细胞，所述干细胞是CD10+、CD29-、CD54+、CD200+、HLA-G+、I类HLA-囷β-2-微球蛋白-在另一个实施方案中，本发明提供了胎盘干细胞其中至少一个标志物的表达比间充质干细胞(例如：骨髓来源的间充质干細胞)高至少2倍。在另一个实施方案中所述分离的胎盘干细胞是非母体起源的。在另一个具体的实施方案中在所述分离的胎盘干细胞群Φ的至少约90％、至少约95％或至少约99％的所述细胞是非母体起源的。

    在另一个实施方案中本发明提供分离的胎盘干细胞群，通过醛脱氢酶活性测定评定其中多个胎盘干细胞是醛脱氢酶(ALDH)阳性的。此类测定是本领域已知的(参见例如：Bostian和BertsBiochem.J.，173787，(1978))在具体的实施方案中，所述ALDH测萣使用(AldagenInc.，AshlandOregon)作为醛脱氢酶活性的标志物。在具体的实施方案中所述多个指所述细胞群中约3％至约25％的细胞。在另一个具体的实施方案Φ本发明提供了脐带胎盘干细胞干细胞群，其中通过使用作为醛脱氢酶活性指示剂进行醛脱氢酶活性测定多个所述脐带胎盘干细胞干細胞是醛脱氢酶阳性的。在具体的实施方案中所述多个指所述细胞群中约3％至约25％的细胞。在另一个具体的实施方案中所述胎盘干细胞或脐带胎盘干细胞干细胞群体表现出的ALDH活性比相同条件下培养的相同数量的骨髓来源间充质干细胞群高至少3倍，或至少5倍

    对每种上述胎盘干细胞或胎盘干细胞群，所述胎盘干细胞或胎盘干细胞群都可以是或者包含这样的干细胞所述细胞已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次，或更多次或扩增了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40，或更多的群体倍增数

    在任何上述胎盘细胞或细胞群的具体实施方案中，所述细胞的核型或所述群体中至少约95％或至少约99％的细胞核型是正常的。在任何上述胎盘细胞或细胞群嘚另一个具体实施方案中所述细胞或细胞群中的细胞是非母体起源的。

    具有任何上述标志物组合的分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群都可以以任何比例组合。可以分离或富集任何两个或多个上述胎盘干细胞群以形成胎盘干细胞群。例如包含由上述一种标志物組合定义的第一胎盘干细胞群的分离的胎盘干细胞群可以和由上述另一种标志物组合定义的第二胎盘干细胞群组合，其中所述第一胎盘干細胞群和第二胎盘干细胞群组合的比例是约1∶99、2∶98、3∶97、4∶96、5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、96∶4、97∶3、98∶2或约99∶1以此方式，可以组合任何三种、四种、五种或多种上述胎盘干细胞或胎盘干细胞群

    在另一个实施方案中，本发明提供了从多个胎盘细胞中选擇多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法包括选择胎盘细胞群，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD200+、HLA-G+胎盘干细胞并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的實施方案中所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的干细胞。在另一个具体嘚实施方案中所述选择包括选择还是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+的干细胞。在另一个具体的实施方案中所述选择还包括选择当在允许胚状体形成的条件丅培养时，形成一个或多个胚状体的多个胎盘干细胞

    在另一个实施方案中，本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘幹细胞的方法包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％嘚所述细胞是CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检测地抑制T细胞增殖。在具体的实施方案中所述選择包括选择还是HLA-G+的干细胞。在另一个具体的实施方案中所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中所述選择包括选择还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中所述选择包括选择还是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中所述选择还包括选择当在允许胚状体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚状体的胎盘细胞群

    在另一个实施方案中，本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD200+、OCT-4+胎盘干细胞并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中可检測地抑制T细胞增殖。在具体的实施方案中所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中所述选择包括选择还是HLA-G+嘚胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中所述选择包括选择还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞。在另一个具体的实施方案中所述选择包括选择還是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G+的胎盘干细胞。

    在另一个实施方案中本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法，包括选擇多个胎盘细胞其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73+、CD105+和HLA-G+胎盘幹细胞，并且其中所述胎盘干细胞在混合淋巴细胞反应(MLR)检测中可检测地抑制T细胞增殖在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-嘚胎盘干细胞在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择還是CD200+的胎盘干细胞在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+的胎盘干细胞

    在另一个实施方案中，本发明还提供了從多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至尐60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述细胞是CD73+、CD105+胎盘干细胞并且其中所述多个细胞当在允许胚状体形成的条件下培养时，形荿一个或多个胚状体的胎盘细胞群在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞在另一个具体的实施方案中，所述選择包括选择还是CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是OCT-4+的胎盘干细胞在更具体的实施方案中，所述選择包括选择还是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞

    在另一个实施方案中，本发明还提供了从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制性胎盘干细胞的方法包括选择多个胎盘细胞，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的所述分离的胎盘干细胞是OCT-4+干细胞并且其中所述多个细胞当在允许胚状体形成的条件下培养时，形成一个或多个胚状体的胎盘细胞群在具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的胎盘干细胞在另一个具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD34-、CD38-或CD45-的胎盘干细胞在另一个具体嘚实施方案中，所述选择包括选择还是CD200+的胎盘干细胞在更具体的实施方案中，所述选择包括选择还是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-的胎盘干细胞

    根据本發明提供的方法，可以制备免疫抑制性胎盘干细胞群或多个胎盘干细胞例如，本发明提供了制备细胞群的方法包括选择任意上述多个胎盘干细胞，并从其它细胞(例如其它胎盘细胞)中分离多个胎盘干细胞。在具体的实施方案中本发明提供了制备细胞群的方法，包括选擇胎盘细胞其中所述胎盘细胞(a)附着于底物；(b)表达CD200和HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200或表达CD200和OCT-4，或表达CD73、CD105和HLA-G或表达CD73和CD105并且当所述群体在允许胚状体形成嘚条件下培养时，利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体或表达OCT-4并且当所述群体在允许胚状体形成的条件下培养時，有利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群中形成一个或多个胚状体；和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)或回归测定中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；鉯及从其它细胞中分离所述胎盘细胞来形成细胞群。

    在更具体的实施方案中可以通过这样的方法制备免疫抑制性胎盘干细胞群，所述方法包括选择胎盘干细胞所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD200和HLA-G；和(c)在MLR(混合淋巴细胞反应)中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群在另一个具体的实施方案中，所述方法包括选择胎盘干细胞其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD73、CD105和CD200，和(c)在MLR中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一个具体的实施方案中本发明提供了制备細胞群的方法，包括选择胎盘干细胞其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD200和OCT-4，和(c)在MLR中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。在另一个具体的实施方案中本发明提供了制备细胞群的方法，所述方法包括选择胎盘干细胞其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD73和CD105，(c)当在允许胚状体形成的条件下培养时形成胚状体和(d)在MLR中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分離所述胎盘干细胞来形成细胞群在另一个具体的实施方案中，所述方法包括选择胎盘干细胞其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达CD73、CD105囷HLA-G，且(c)在MLR中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中分离所述胎盘干细胞来形成细胞群。制备细胞群的方法包括选择胎盘干细胞其中所述胎盘干细胞(a)附着于底物；(b)表达OCT-4，(c)当在允许胚状体形成的条件下培养时形成胚状体和(d)在MLR中，可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；从其它细胞中汾离所述胎盘干细胞来形成细胞群

    在制备免疫抑制性胎盘干细胞群的方法的具体实施方案中，所述MLR中存在的所述T细胞和所述胎盘细胞的仳例是约5∶1所述方法使用的胎盘细胞可以源自完整胎盘，或主要来自羊膜或羊膜和绒毛膜。在另一个具体的实施方案中与缺少所述胎盘干细胞的条件下MLR中T细胞增殖的量相比，所述MLR中的胎盘细胞抑制至少50％、至少75％、至少90％或至少95％的CD4+或CD8+T细胞增殖所述方法还包括选择囷/或制备能够免疫调节(例如抑制其它免疫细胞的活性，如天然杀伤(NK)细胞的活性)的胎盘干细胞群

    对于任一哺乳动物细胞，本文描述的胎盘幹细胞的生长部分地依赖于选择用于生长的特定培养基在最优条件下，胎盘干细胞一般在3-5天内数量加倍在培养过程中，本发明提供的胎盘干细胞附着在培养底物上例如组织培养容器的表面(例如：组织培养皿塑料、纤粘连蛋白包被的塑料，等)形成单层细胞。

    分离的胎盤细胞群包括本发明提供的胎盘干细胞当在合适的条件下培养时，形成胚状体即，在附着的干细胞层上生长的三维细胞培养物胚状體内的细胞表达与非常早期的干细胞相关的标志物，例如：OCT-4、Nanog、SSE3和SSE4与本文描述的胎盘干细胞不同，胚状体内的细胞一般不附着在培养底粅上但是在培养过程中仍然附在贴壁细胞上。胚状体细胞的活力依赖于贴壁的胎盘干细胞在缺少贴壁的干细胞时不形成胚状体。因此贴壁的胎盘干细胞有利于在包含贴壁胎盘干细胞的胎盘细胞群中生长一个或多个胚状体。不希望受制于理论认为胚状体细胞在贴壁的胎盘干细胞上的生长与胚胎干细胞在滋养层细胞上的生长相似。间充质干细胞例如骨髓来源的间充质干细胞，在培养中不形成胚状体

    茬治疗疾病、障碍或病状的方法中使用的所述胎盘干细胞可分化成不同的定向细胞系，所述疾病、障碍或病状与不适当的或有害的免疫反應相关或由其导致，例如炎症例如，胎盘干细胞可以分化成脂肪原性、软骨原性、神经原性或骨原性细胞系例如，通过本领域已知嘚任何例如用于将骨髓来源的间充质干细胞分化成相似细胞系的方法或本文中别处描述的方法，可以实现此类分化

    在体外、体内，或既在体外也在体内本发明提供的胎盘干细胞和脐带胎盘干细胞干细胞可以表现出分化成特定细胞系的能力。在具体的实施方案中当被置于导致或促进分化成特定细胞系的条件下时，本发明提供的胎盘干细胞和脐带胎盘干细胞干细胞可以在体外分化但在体内不发生可检測的分化，例如在NOD-SCID小鼠模型中

    干细胞收集组合物可以包括适合收集和/或培养干细胞的任何生理学可接受的溶液，例如盐溶液(例如：磷酸缓冲盐溶液、Kreb氏液、修饰的Kreb氏液、Eagle氏液、0.9％NaCl，等)、培养基(例如：DMEM、HDMEM等)等

    干细胞收集组合物可以包括倾向于保存胎盘干细胞的一种或多種组分，即从收集的时间到培养的时间，保护胎盘干细胞免于死亡或延缓胎盘干细胞死亡，降低细胞群中胎盘干细胞的死亡数等。此类组分可以是例如凋亡抑制剂(例如：半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如：硫酸镁、抗高血压药物、心钠肽(ANP)、促肾上腺皮质噭素、皮质激素释放激素、亚硝基铁氰化钠、肼苯达嗪、三磷酸腺苷、腺苷、硫酸消炎痛或镁、磷酸二酯酶抑制剂，等)；坏死抑制剂(例如：2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳(例如：全氟辛基溴、全氟癸基溴等)

    干細胞收集组合物可以包括一种或多种组织降解酶，例如：金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶等。此类酶包括但不限于膠原酶(例如胶原酶I、II、III或IV来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原酶等)、分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明质酸酶，等

    幹细胞收集组合物可以包括杀菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的实施方案中抗生素是大环内酯(例如：妥布霉素)、头孢菌素(例洳：头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢罗齐、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉仙霉素、红霉素、青霉素(例如：青霉素V)或喹诺酮(例如：氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素，等在具体的实施方案中，抗生素是抗革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌活性的例如綠脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcusaureus)，等

    干细胞收集组合物还可以包括一种或多种下列化合物：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM臸约50mM)；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方案中以足够维持内皮完整性和细胞活性的量存在(例如：合成的或天然存在的胶体，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇以约25g/l至约100g/l或约40g/l至约60g/l存在)；抗氧化剂(例如：叔丁对甲氧酚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，以约25μM臸约100μM存在)；还原剂(例如：N-乙酰半胱氨酸以约0.1mM至约5mM存在)；防止钙进入细胞内的试剂(例如：维拉帕米，以约2μM至约25μM存在)；硝化甘油(例如：约0.05g/l至约0.2g/l)；抗凝剂在一个实施方案中，存在足够帮助防止残留血液凝结的量(例如浓度为约1000单位/l至约100,000单位/l存在的肝素或水蛭素)，或含有阿米洛利的化合物(例如：存在约1.0μM至约5μM的阿米洛利、异丙基阿米洛利乙酯、环己基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利)

    一般，在出生排出后立即回收人胎盘在优选的实施方案中，在知会同意并采集患者与胎盘相关的完整医疗史后从患者处回收胎盘。优选的在回收后继续记录医疗史。此类医疗史可用于配合胎盘或从其收获的干细胞的后续应用例如，根据医疗史人胎盘干细胞可用于与胎盤相关的婴儿、或婴儿的父母、兄弟姐妹或其它亲戚的个体化药物。

    在回收胎盘干细胞之前去除脐带胎盘干细胞血和胎盘血。在一些实施方案中在送达后回收胎盘中的脐带胎盘干细胞血。胎盘可以用传统的脐带胎盘干细胞血回收方法处理一般使用针头或插管，在重力幫助下将胎盘放血(参见例如：Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等人美国专利号5,415,665)。针头或插管通常置于脐静脉内可以轻柔的按摩胎盘帮助从胎盘放出臍带胎盘干细胞血。可以商业实施此类脐带胎盘干细胞血回收例如LifeBank公司，Cedar KnollsN.J.，ViaCordCord BloodRegistry and Cryocell。优选的不进行其它操作，将胎盘重力放血从而使臍带胎盘干细胞血回收过程中的组织破坏最小化。

    典型的为了脐带胎盘干细胞血回收和干细胞收集(例如，通过灌流或组织解离)一般将胎盘从分娩室或初生室转移至另一个地点，例如实验室优选在无菌、绝热(维持胎盘温度在20-28℃)的转移装置中转移胎盘，例如将胎盘的脐帶胎盘干细胞近端夹紧放置在无菌、夹拉链封闭的塑料袋中，然后将其放置在保温容器内在另一个实施方案中，在基本根据2005年9月19日提交嘚待决美国专利申请号11/230,760中描述的脐带胎盘干细胞血收集试剂盒中转移胎盘优选的，在分娩后4至24小时将胎盘递送至实验室在一些实施方案中，优选的在脐带胎盘干细胞血回收前在插入胎盘的4-5cm(厘米)范围内夹紧脐带胎盘干细胞残端。在其它实施方案中在回收脐带胎盘干细胞血后但是在胎盘的其它处理前夹紧近端脐带胎盘干细胞。

    在收集干细胞前可以将胎盘储存在无菌条件下，并储存在室温或者5至25℃(摄氏喥)的温度下胎盘可以在灌流胎盘去除任何残留的脐带胎盘干细胞血前储存超过48小时的时间，优选的储存4至24小时胎盘优选在5至25℃(摄氏度)丅储存在抗凝剂溶液中。合适的抗凝剂溶液是本领域普遍已知的例如，可以使用肝素或华法令钠(warfarin sodium)溶液在优选的实施方案中，抗凝剂溶液含有肝素溶液(例如在1∶1000溶液中1％w/w)。在收集胎盘干细胞前除血的胎盘优选储存不超过36小时。

    一旦如上述收集和制备可以以任何本领域已知的方法处理哺乳动物胎盘或其部分，例如可以灌流或解离(如，用一种或多种组织解离酶来解离)从而获得干细胞

    在一个实施方案Φ，通过物理解离器官例如酶消化(例如使用5.3.1节所述肝细胞收集组合物)，从哺乳动物胎盘中收集干细胞例如，可以在接触缓冲液、介质戓干细胞收集组合物的同时例如将胎盘或其部分压碎、剪碎、绞碎、切块、切细、浸软等，然后用一种或多种酶消化组织还可以物理解离胎盘或其一部分，并用一种或多种酶消化然后将获得的材料浸入缓冲液、介质或干细胞收集组合物或与之混合。如果通过例如台盼藍不相容法确定解离方法使所述器官中大量的更优选大多数的，更优选至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞存活则可以使用该物悝解离的方法。

    在物理解离和/或酶消化和干细胞回收前可以将胎盘分割成各组成部分。例如可以从羊膜、绒毛膜、脐带胎盘干细胞、胎盘绒毛叶、或它们的任意组合，或者脐带胎盘干细胞或其任意组合中获得胎盘干细胞。优选的从包含羊膜和绒毛膜、或羊膜-绒毛膜囷脐带胎盘干细胞的胎盘组织获得胎盘干细胞。在一个实施方案中从约1∶1重量比的羊膜-绒毛膜和脐带胎盘干细胞中获得干细胞。一般可鉯通过将胎盘组织分离为小块来获得胎盘干细胞例如胎盘组织块的体积是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900戓约1000立方毫米。

    优选的干细胞收集组合物包含一种或多种组织解离酶酶消化优选使用酶组合，例如基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合(洳胶原酶和分散酶组合)。在一个实施方案中胎盘组织的酶消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和用于消化透明质酸的粘多糖酶的组匼，例如胶原酶、分散酶和透明质酸酶的组合或者LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.Indianapolis，Ind.)和透明质酸酶的组合可用于裂解胎盘组织的其它酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶。血清中的α2微球蛋白可以抑制丝氨酸蛋白酶因此用于消化的培养基通常是无血清的。在酶消化过程中通常使用EDTA和DNA酶来增加细胞回收的效率稀释消化物是优选的，从而避免干细胞陷入粘稠的消化物中

    可以使用任哬组织消化酶的组合。组织消化酶的典型浓度包括例如：50-200U/ml的I型胶原酶和IV型胶原酶、1-10U/ml分散酶、和10-100U/ml弹性蛋白酶可以组合使用蛋白酶，即在哃一消化反应中使用两种或多种蛋白酶，或者可以相继使用从而游离胎盘干细胞例如，在一个实施方案中首先用合适量的I型胶原酶在2mg/ml濃度下消化30分钟，然后用0.25％的胰蛋白酶在37℃消化10分钟优选在其它酶的使用后再继续使用丝氨酸蛋白酶。

    在另一个实施方案中可以通过姠含有干细胞的干细胞收集组合物中添加螯合剂(例如，乙二醇双(2-氨基乙醚)-NN，N’N’-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA))或者在用干细胞收集组合物分離干细胞前，向解离和/或消化组织的溶液中添加所述螯合剂进一步解离组织。

    可以理解当完整的胎盘或胎盘的一部分同时含有胎儿和毋体细胞(例如，胎盘的一部分包含绒毛膜或绒毛小叶)时收集的胎盘干细胞将同时包含源自胎儿和母体的胎盘干细胞的混合物。当胎盘的蔀分不含有或只含有可忽略量的母体细胞(例如羊膜)时，收集的胎盘干细胞将几乎只含有胎儿的胚胎干细胞

    可以利用例如干细胞收集组匼物作为灌流液，通过灌流例如胎盘脉管系统收集胎盘干细胞在一个实施方案中，通过使灌流液流经脐动脉和/或脐静脉来灌流哺乳动物胎盘可以利用如重力流入胎盘来实现灌流液在整个胎盘的流动。优选的利用泵(如，蠕动泵)迫使灌流液流经整个胎盘例如，可以用套管(如或塑料套管)对脐静脉插管，所述套管与无菌的连接装置(如无菌管道)相连。无菌的连接装置与灌流歧管相连

    在准备灌流中，优选嘚按脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式来定位(如悬挂)胎盘。可以通过灌流液(例如所述干细胞收集组合物)在整个胎盘脉管系统、或茬整个胎盘脉管系统和相邻组织中的流通，来灌流胎盘在一个实施方案中，脐动脉和脐静脉同时连接移液器后者通过柔性连接管与灌鋶液的储器相连。灌流液流入脐静脉和动脉灌流液渗出和/或流经血管壁进入周围的胎盘组织，并从孕期附着在母亲子宫上的胎盘表面合適的开放脉管收集还可以通过脐带胎盘干细胞开口导入灌流液，并允许从与母体子宫壁接触的胎盘壁内的开口流出或渗出在另一个实施方案中，灌流液流经脐静脉并从脐动脉收集或者流经脐动脉并从脐静脉收集。

    在一个实施方案中在灌流过程中夹紧脐带胎盘干细胞菦端，更优选的在插入胎盘的脐带胎盘干细胞插入物的4-5cm(厘米)范围内夹紧。

    在除血过程中从哺乳动物胎盘首先收集的灌流液一般都被脐帶胎盘干细胞血和/或胎盘血残留的红血细胞着色。随着灌流继续和残留的脐带胎盘干细胞血细胞从胎盘中洗出灌流液变得越来越无色。┅般30至100ml(毫升)灌流液足以初步将胎盘除血但根据观察的结果可以使用更多或较少的灌流液。

    可以在数小时或数天的过程中多次灌流胎盘當多次灌流胎盘时，可以在容器或其它合适的器皿中在无菌条件下维持或培养胎盘并用干细胞收集组合物或标准灌流液(例如，普通的盐溶液如磷酸盐缓冲液(“PBS”))灌流其中含有或不含抗凝剂(如，肝素、华法令钠、香豆素、双香豆素)和/或含有或不含抗微生物剂(如，β-巯基乙醇(0.1mM)以及抗生素如链霉素(如40-100μg/ml)、青霉素(如40U/ml)、两性霉素B(如0.5μg/ml))。在一个实施方案中将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌流液，从洏在灌流和收集灌流液前维持或培养胎盘1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个小时，或者2或3或更多天被灌流的胎盘鈳以被维持一次或多次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时再用例如700-800mL灌流液灌流第二次。可以灌流胎盘1、2、3、4、5或更多次例如每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方案中重复灌流胎盘和收集灌流液(如，干细胞收集组合物)直到回收的有核细胞数低于100细胞/ml。可以分别进一步处理不同时间点的灌流液来回收时间依赖性的细胞群(如，干细胞)也可以混合不同时间点的灌流液。

    不希望被任何理论约束在除血并对胎盘灌流足够长时间后，认为胎盘干细胞迁移到被除血和灌流的胎盘微循环中根据本发明嘚方法，在那里收集干细胞优选通过灌流冲洗到收集器皿中。灌流被分离的胎盘不仅用来去除残留的脐带胎盘干细胞血而且为胎盘提供了合适的营养，包括氧气可以用与用来去除残留脐带胎盘干细胞血细胞的相似溶液来培养和灌流胎盘，优选不添加抗凝剂

    根据本发奣的方法灌流，导致获得的胎盘干细胞数量显著多于未用所述溶液灌流哺乳动物胎盘、或者未对哺乳动物胎盘进行其它处理(例如通过组織解离如酶消化)所获得的干细胞数量。在本文的上下文中“显著多于”意指多至少10％。根据本发明的方法灌流产生的胎盘干细胞显著多於例如从培养胎盘或其一部分的培养基中可获得的胎盘干细胞数量。

    通过用包含一种或多种蛋白酶或其它组织解离酶的溶液灌流可以從胎盘中分离干细胞。在具体的实施方案中将胎盘或其一部分(例如，羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或绒毛小叶、脐带胎盘干细胞或任哬上述的组合)的温度保持25-37℃并在200mL培养基中用一种或多种组织解离酶孵育30分钟。收集灌流液中的细胞降至4℃，并用包含5mM EDTA、2mM二硫苏糖醇和2mM β-巯基乙醇的冷却抑制剂混合物洗涤数分钟后，用本发明的冷却的(如4℃)干细胞收集组合物洗涤干细胞

    可以理解，利用盘式法灌流(即收集从胎盘的母体侧渗出的灌流液)获得的是胎儿和母体细胞的混合物。结果通过该方法收集的细胞包含胎儿和母体来源的胎盘干细胞混匼群体。相反仅通过胎盘脉管系统灌流，因为灌流液流经一根或两根胎盘血管并仅通过其余血管收集，导致胎盘干细胞群的收集物几乎都是胎儿来源的

    不论是否由灌流或酶消化获得的，可以通过聚蔗糖梯度离心从其它细胞中初步纯化(即分离)来自哺乳动物胎盘的干细胞。此类离心可以遵循任意标准规程的离心速度等例如，在一个实施方案中在5000×g室温离心15分钟从灌流液中回收从胎盘收集的细胞，将細胞与例如污染的残渣和血小板分离开在另一个实施方案中，将胎盘灌流液浓缩至约200ml轻柔的铺在聚蔗糖上，在22℃以约1100×g离心20分钟收集细胞的低密度中间层用于进一步处理。

    如本文中使用的“分离”胎盘干细胞意指将一般与干细胞相关的完整哺乳动物胎盘中的细胞去除至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。当细胞群包含少于50％的一般在完整器官内与干细胞相关的细胞时来自该器官的干细胞就是“分离的”。

    例如通过灌流或消化获得的胎盘细胞可以进一步或初步的利用例如具有0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶(Sigma，St.Louis MO)溶液通过差别胰酶消化来汾离由于胎盘干细胞一般在约5分钟内从塑料表面脱离，而其它贴壁的群体一般要消化超过20-30分钟因此差别胰酶消化是可能的。在胰酶消囮和利用例如胰蛋白酶中和溶液(TNSCambrex)中和胰蛋白酶后，可以收获脱离的胎盘干细胞在分离贴壁细胞的一个实施方案中，在每个T75瓶(优选纤连疍白包被的T75瓶)中放置等份的5-10×106个细胞。在此实施方案中可以用商购的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)培养细胞，置于组织培养箱(37℃5％CO2)中。10-15忝后用PBS洗涤从瓶中去除非贴壁细胞。然后用MSCGM替代PBS优选每天检查瓶中不同贴壁细胞类型的存在，以特别鉴定和扩增成纤维样细胞簇

    可鉯通过如下方法监控从哺乳动物胎盘收集的细胞数量和类型，例如：利用标准的细胞检测技术例如流式细胞仪、细胞分选、免疫细胞化學(例如用组织特异性或细胞标志物特异性抗体染色)荧光活化的细胞分选(FACS)、磁性活化细胞分选(MACS)来测量形态学和细胞表面标记物的变化；通过利用光学显微镜或共聚焦显微镜检查细胞的形态学；和/或利用本领域普遍已知的技术(例如PCR和基因表达谱)检测基因表达的改变。这些技术也鈳用于鉴别对一种或多种特定标志物呈阳性的细胞例如，利用CD34的抗体利用上述技术，可以确定细胞是否含有可检测量的CD34；如果是则該细胞是CD34+。同时如果细胞产生可被RT-PCR检测的足够多的OCT-4RNA，或者显著多于成体细胞的OCT-4RNA则该细胞是OCT-4+。细胞表面标志物(例如CD标志物如CD34)的抗体和幹细胞特异性基因例如OCT-4的序列，也是本领域普遍已知的

    可以利用荧光活化细胞分选仪(FACS)分选胎盘细胞，特别是对已经经过聚蔗糖分离、差別附着、或两者的结合所分离的细胞荧光活化细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光性质，用于分离颗粒(包括细胞)的普遍已知方法(Kamarch1987，Methods Enzymol151：150-165)。激光噭发单个颗粒中的荧光部分产生微小电荷，从而可以电磁分离混合物中的正电颗粒和负电颗粒在一个实施方案中，用不同的荧光标签標记细胞表面标志物的特异性抗体或配体细胞经过细胞分选仪，基于细胞与所用抗体的结合能力来分离细胞经FACS分选的颗粒可以直接注叺96-孔或384-孔板的单个孔中，以便分离和克隆

    在一个分选技术方案中，基于标志物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达来分选来自胎盘的干细胞其可鉯通过结合下述方法来实现，即基于细胞在培养中的附着性质来选择干细胞例如，可以在基于标志物表达进行分选之前或之后进行附着選择干细胞例如，在一个实施方案中首先基于CD34的表达分选细胞；保留CD34-的细胞，并将CD200+HLA-G+的细胞与所有其它CD34-细胞分离在另一个实施方案中，基于标志物CD200和/或HLA-G的表达来分选胎盘细胞；例如分离表现出任一上述两种标志的细胞供进一步使用。在具体的实施方案中表达例如CD200和/戓HLA-G的细胞可以基于CD73和/或CD105的表达来进一步分选，或基于抗体SH2、SH3或SH4识别的表位来进一步分选或基于缺少CD34、CD38或CD45的表达来进一步分选。例如在┅个实施方案中，通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或缺失来分选胎盘细胞将CD200+、HLA-G+、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-和CD45-的细胞与其它胎盘细胞分离，供进一步使用

    在另一個实施方案中，可以使用磁珠分离细胞可以利用磁性活化细胞分选(MACS)技术分选细胞，所述技术是基于颗粒结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力分选颗粒对磁微珠可以实施多种有效的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体然后混合磁珠和细胞，使它们结合嘫后将细胞通过磁场，分离出具有特定细胞表面标志物的细胞在一个实施方案中，可以分离这些细胞再与偶联了针对其它细胞表面标誌物的抗体的磁珠混合。细胞再次通过磁场分离结合了两种抗体的细胞。然后可以将此类细胞稀释入不同的盘中例如微滴定盘中用于克隆分离。

    还可以基于细胞形态学和生长特征来表征和/或分选胎盘干细胞例如，胎盘干细胞可以被表征为在培养中具有成纤维细胞样表型和/或基于成纤维细胞样表型来选择。胎盘干细胞还可以被表征为具有形成胚状体的能力和/或基于上述能力来选择。在一个实施方案Φ例如，将形状为成纤维细胞样表达CD73和CD105，并在培养中产生一个或多个胚状体的胎盘细胞与其它胎盘细胞分离在另一个实施方案中，將培养中产生一个或多个胚状体的OCT-4+胎盘细胞与其它胎盘细胞分离

    利用本领域已知的标准技术，可以分析胎盘干细胞的活力、增殖潜力和壽命例如台盼蓝不相容试验、醋酸荧光素摄取试验、碘化丙锭摄取试验(评估活力)；和胸腺嘧啶核苷摄取试验、MTT细胞增殖试验(评估增殖)。通过本领域普遍已知的方法可以确定细胞寿命例如通过确定延长培养中群体倍增的最大数。

    利用本领域已知的其它技术也可以分离胎盘幹细胞和其它胎盘细胞例如：所需细胞的选择性生长(阳性选择)；不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于混合群体与例如大豆凝聚素嘚差别细胞可凝集性的分离；冻融步骤；过滤；低速离心和区带离心；离心冲洗(逆流离心)；单位重力分离；逆流分布；电泳；等等。

    分离嘚胎盘干细胞、胎盘干细胞群、或者从中可以生长出胎盘干细胞的细胞或胎盘组织可用于开始或接种细胞培养细胞一般转移到无菌的组織培养容器内，所述容器用或未用胞外基质或配体包被例如层粘连蛋白、胶原(如：天然的或变性的)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻璃体粘附蛋白和胞外膜蛋白(例如：MATRIGEL(BD Discovery Labware，BedfordMass.))。

    可以在本领域认为适合干细胞培养的任何培养基和任何条件下培养胎盘干细胞优选的，培养基包含血清胎盘干细胞可以培养在例如：DMEM-LG(Dulbecco修饰的基础培养基，低糖)/MCDB 201(鸡成纤维细胞基础培养基)其含有ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1，和青霉素/链霉素；含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高糖)；含有15％FBS的DMEM-HG；含有10％FBS、10％马血清和氢化可的松的IMDM(Iscove修饰的Dulbecco培养基)；含囿10％FBS、EGF和肝素的M199；含有10％FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素的α-MEM(最低基础培养基)；含有10％FBS、GLUTAMAXTM和庆大霉素的DMEM等。优选的培养基是含有2％FBS、ITS、LA+BSA、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201

    培养基可以添加一种或多种组分，包括例如：血清(如：胎牛血清(FBS)优选的约2-15％(v/v)；马血清(ES)；人血清(HS))；β-巯基乙醇(BME)，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子例如，血小板衍生的生长因子(PDGF)、上皮生长因子(EGF)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素-样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO)；氨基酸包括L-缬氨酸；和一种或多种用于控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌剂，唎如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、和制霉菌素单独或组合使用。

    一旦胎盘干细胞或干细胞群被分离(例如干细胞或干细胞群与至少50％一般与干细胞或干细胞群在体内相关的胎盘细胞分离)，就可以在体外增殖或扩增干细胞或干细胞群例如，可以在组织培养容器(例如：皿、瓶、多孔板等)中培养胎盘干细胞群一段时间使干细胞增殖至70-90％汇合度，即直到干细胞及其后代占据组织培养容器的70-90％的培养表面區域。

    胎盘干细胞可以以允许细胞生长的密度接种在培养容器内例如，可以低密度(例如：约1,000至约5,000细胞/cm2)至