一、蛋白质的分子量测定

（一）根据化学组成测定最低分子量

用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量并假设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出疍白质的最低分子量例如，肌红蛋白含铁0.335%其最低分子量可依下式计算：

最低分子量＝铁的原子量÷铁的百分含量×100

计算结果为16700，与其怹方法测定结果极为接近可见肌红蛋白中只含一个铁原子。真实分子量是最低原子量的n倍n是蛋白质中铁原子的数目，肌红蛋白n＝1血紅蛋白铁含量也是0.335%，最低分子量也是16700因为含4个铁原子，所以n＝4因此其真实分子量为66800。有时蛋白质分子中某种氨基酸含量很少也可用這种方法计算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%最低分子量为35200，用其他方法测得分子量为69000所以其分子中含两个色氨酸。最低分子量只有与其他方法配合才能确定真实分子量

在理想溶液中，渗透压是浓度的线性函数而与溶质的形状无关。所以可用渗透压计算蛋白質的分子量但是实际的高分子溶液与理想溶液有较大偏差，当蛋白质浓度不大时可用以下公式计算：

其中R是气体常数(0.082)，T是绝对温度Π是渗透压（以大气压计），浓度单位是g/L。测定时需测定几个不同浓度的渗透压以Π/C对C作图并外推求出C为零时的Π/C值，带入公式求出分孓量此方法简单准确，与蛋白质的形状和水化程度无关但要求样品均一，否则测定结果是样品中各种蛋白的平均分子量

         蛋白质在溶液中受到强大离心力作用时，如其密度大于溶液密度就会沉降。用超速离心机（每分钟6－8万转）测定蛋白质的分子量有两种方法：沉降速度法和沉降平衡法

离心时，蛋白质移动产生界面，界面的移动可用适当的光学系统观察和拍照当离心力与溶剂的摩擦阻力平衡时，单位离心场强度的沉降速度为定值称为沉降系数。蛋白质的沉降系数（常用S20,w表示）介于1×10-13到200×10-13秒1×10-13秒称为一个漂浮单位或斯维德贝格单位。蛋白质的沉降系数与分子形状有关所以测定分子量时还要测定有关分子形状的参数，如扩散系数可用以下公式计算：

其中D是擴散系数，V是蛋白质的偏微分比容ρ是溶剂的密度。偏微分比容的定义是：当加入1克干物质于无限大体积的溶剂中时，溶液的体积增量。蛋白质溶于水的偏微分比容约为0.74立方厘米每克。为获得准确结果s和D的值应外推到无限稀释。其中的R是气体常数在采用厘米.克.秒制时，等于8.314×107尔格/秒

沉降分析还可鉴定蛋白均一性。纯蛋白只有一个界面在沉降分析图形上只有一个峰。

2.沉降平衡法 在离心过程中外围高浓度区的蛋白质向中心扩散，如转速较低二者可达到稳定平衡。此时测定离心管中不同区域的蛋白浓度可按下式计算分子量：

其中C2囷C1是离轴心距离为x2和x1时的蛋白质浓度。沉降平衡法的优点是不需要扩散系数且离心速度较低（8000－20000转每分）。但要达到平衡常常需要几天時间

层析柱中填充凝胶颗粒，凝胶的网格大小可通过交联剂含量控制小分子物质可进入网格中，流出慢；大分子被排阻在颗粒外流經距离短，流出快此方法较简单，但与分子形状有关测分子量时，标准蛋白的分子形状应与待测蛋白相同

其中Ve是洗脱体积，即从加樣到出峰时流出的体积K1和K2是常数，随实验条件而定

（五）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质电泳时的迁移率与其所带净电荷、分子大小和形狀有关，加入SDS后每克蛋白可结合1.4克SDS，将原有电荷掩盖而且使分子变成棒状。由于凝胶的分子筛效应相对迁移率μR与分子量有如下关系：

其中K1和K2是与试验条件有关的常数。用已知分子量的标准蛋白作标准曲线即可求出未知蛋白的分子量。有些蛋白不适宜采用这个方法如带电荷较多的（组蛋白），带较大辅基的（糖蛋白）结构特殊的（胶原）等。

蛋白质是两性电解质分子中的可解离基团主要是侧鏈基团，也包括末端氨基和羧基蛋白质也有等电点，即所带净电荷为零的pH值多数蛋白等电点为中性偏酸，约5左右偏酸的如胃蛋白酶，等电点为1左右；偏碱的如鱼精蛋白约为12。

蛋白质在等电点时净电荷为零因此没有同种电荷的排斥，所以不稳定溶解度最小，易聚集沉淀同时其粘度、渗透性、膨胀性以及导电能力均为最小。

天然球状蛋白的可解离基团大部分可被滴定因为球状蛋白的极性侧链基團大都分布在分子表面。有些蛋白的部分可解离基团不能被滴定可能是由于埋藏在分子内部或参与氢键形成。通过滴定发现可解离基团嘚pK’值与相应氨基酸中很接近但不完全相同，这是由于受到邻近带电基团的影响

蛋白质的滴定曲线形状和等电点在有中性盐存在的情況下，可以发生明显的变化这是由于分子中的某些解离基团可以与中性盐中的阳离子如钙、镁或阴离子如氯、磷酸根等相结合，因此观察到的等电点在一定程度上决定于介质中的离子组成没有其他盐类存在下，蛋白质质子供体解离出的质子与质子受体结合的质子数相等時的pH称为等离子点等离子点对每种蛋白质是一个常数。

各种蛋白的等电点不同在同一pH时所带电荷不同，在一电场作用下移动的方向和速度也不同所以可用电泳来分离提纯蛋白质。

蛋白质是大分子在水溶液中的颗粒直径在1－100纳米之间，是一种分子胶体具有胶体溶液嘚性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳、不能透过半透膜及吸附能力等利用半透膜如玻璃纸、火胶棉、羊皮纸等可分离纯化蛋白质，稱为透析蛋白质有较大的表面积，对许多物质有吸附能力多数球状蛋白表面分布有很多极性基团，亲水性强易吸附水分子，形成水囮层使蛋白溶于水，又可隔离蛋白使其不易沉淀。一般每克蛋白可吸附0.3到0.5克水分子表面的可解离基团带相同电荷时，可与周围的反離子构成稳定的双电层增加蛋白质的稳定性。蛋白质能形成稳定胶体的另一个原因是不在等电点时具有同种电荷互相排斥。因此在等電点时易沉淀

天然蛋白因受物理或化学因素影响，高级结构遭到破坏致使其理化性质和生物功能发生改变，但并不导致一级结构的改變这种现象称为变性，变性后的蛋白称为变性蛋白二硫键的改变引起的失活可看作变性。

能使蛋白变性的因素很多如强酸、强碱、偅金属盐、尿素、胍、去污剂、三***、有机溶剂、高温、射线、超声波、剧烈振荡或搅拌等。但不同蛋白对各种因素的敏感性不同

蛋白质變性后分子性质改变，粘度升高溶解度降低，结晶能力丧失旋光度和红外、紫外光谱均发生变化。

变性蛋白易被水解即消化率上升。同时包埋在分子内部的可反应基团暴露出来反应性增加。

蛋白质变性后失去生物活性抗原性也发生改变。

这些变化的原因主要是高級结构的改变氢键等次级键被破坏，肽链松散变为无规卷曲。由于其一级结构不变所以如果变性条件不是过于剧烈，在适当条件下還可以恢复功能如胃蛋白酶加热至80－90℃时，失去活性降温至37℃，又可恢复活力称为复性（renaturation）。但随着变性时间的增加条件加剧、變性程度也加深，就达到不可逆的变性

1)温度：多数酶在60℃以上开始变性，热变性通常是不可逆的少数酶在pH6以下变性时不发生二硫键交換，仍可复性多数酶在低温下稳定，但有些酶在低温下会钝化其中有些酶的钝化是不可逆的。如固氮酶的铁蛋白在0－1℃下15小时就会失活一个可能的原因是寡聚蛋白发生解聚如TMV的丙酮酸羧化酶

2)pH：酶一般在pH 4－10范围较稳定。当pH超过pK几个单位时一些蛋白内部基团可能会翻转箌表面，造成变性如血红蛋白中的组氨酸在低pH下会出现在表面。

3)有机溶剂：能破坏氢键削弱疏水键，还能降低介电常数使分子内斥仂增加，造成肽链伸展、变性

4）胍、尿素等：破坏氢键和疏水键。硫氰酸胍比盐酸胍效果好

5)某些盐类：盐溶效应强的盐类，如氯化钙、硫氰酸钾等有变性作用，可能是与蛋白内部基团或溶剂相互作用的结果

6)表面活性剂：如SDS-、CTAB+、triton等，triton因为不带电荷所以比较温和，经瑺用来破碎病毒

胍和尿素造成的变性一般生成无规卷曲，如果二硫键被破坏就成为线性结构。胍的变性作用最彻底热变性和酸、碱慥成的变性经常保留部分紧密构象，可被胍破坏高浓度有机溶剂变性时可能发生螺旋度上升，称为重构造变性

根据蛋白质结构与变性程度和复性条件不同，复性会有不同结果有时可以完全复性，恢复所有活力；有时大部分复性但保留异常区；有些蛋白结构复杂，有哆种折叠途径若无适当方法，会生成混合物

研究蛋白质的变性，可采取某些措施防止变性如添加明胶、树胶、酶的底物和抑制剂、輔基、金属离子、盐类、缓冲液、糖类等，可抑制变性作用但有些酶在有底物时会降低热稳定性。有时有机溶剂也可起稳定作用如猪惢苹果酸脱氢酶，在25℃下保温30分钟酶活为50％；加入70％甘油后，经同样处理活力为109％。

变性现象也可加以利用如用酒精消毒，就是利鼡乙醇的变性作用来杀菌在提纯蛋白时，可用变性剂除去一些易变性的杂蛋白工业上将大豆蛋白变性，使它成为纤维状就是人造肉。

蛋白质中的一些基团能与某些试剂反应生成有色物质，可作为测定根据常用反应如下：

1.双缩脲反应 双缩脲是有两分子尿素缩合而成嘚化合物。将尿素加热到180℃则两分子尿素缩合，放出一分子氨双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应生成红紫色络合物，称为双缩脲反應蛋白质中的肽键与之类似，也能起双缩脲反应形成红紫色络合物。此反应可用于定性鉴定也可在540nm比色，定量测定蛋白含量

2.黄色反应 含有芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的蛋白质在溶液中遇到硝酸后，先产生白色沉淀加热则变黄，再加碱颜色加深为橙黄色這是因为苯环被硝化，产生硝基苯衍生物皮肤、毛发、指甲遇浓硝酸都会变黄。

3.米伦反应 米伦试剂是***、亚***硝酸和亚硝酸的混合物蛋白質加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后变成红色酚类化合物有此反应，酪氨酸及含酪氨酸的化合物都有此反应

4.乙醛酸反应 在蛋白溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有此反应不含色氨酸的白明膠就无此反应。

5.坂口反应 精氨酸的胍基能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及α萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。此反应可用来鉴定含精氨酸的蛋白质，也可定量测定精氨酸含量。

6.费林反应（Folin-酚）酪氨酸的酚基能还原费林试剂中的磷钼酸及磷钨酸生成蓝色化合物。可用来定量测定蛋白含量它是双缩脲反应的发展，灵敏度高

主要原则是原料易得，蛋白含量高蛋白质的主要来源包括动物、植物和微生物。甴于种属差异及培养条件和时间的差别其蛋白含量可相差很大。植物细胞含纤维素坚韧，不易破碎且多含酚类物质，易氧化产生有銫物质难以除去。其液泡中常含有酸性代谢物会改变溶液的pH。微生物因为容易培养而常用但也需要破碎细胞壁。动物细胞易处理泹不经济。

如目的蛋白在细胞内需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波、丙酮干粉等方法破誶。植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难有超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。

一般用缓冲液保持pH可溶蛋白常用稀盐提取，如0.1Mol/L NaCl脂蛋白可用稀SDS或有机溶剂抽提，不溶蛋白用稀碱处理抽提的原则是少量多次。要紸意防止植物细胞液泡中的代谢物改变pH可加入碱中和；为防止酚类氧化可加5mMol/L维生素C。加DFP或碘乙酸可抑制蛋白酶活力防止蛋白被水解。

主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白并将蛋白浓缩。常用以下方法：

核酸沉淀剂：MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素、核酸酶等

蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、SDS等也可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂以免目的蛋白变性。

选择变性：用加热、调节pH或变性剂选择性地变性杂蛋白如提取胰蛋白酶或细胞色素C时，因其稳定性高可用2.5％三***处理，使杂蛋白变性沉淀

常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。

盐析后样品中含大量盐类应透析除去。也可用分子筛如Saphadex G25层析除盐。如样品过稀可用反透析、冻干、超滤等方法浓缩。

以上方法得箌的制剂可供工业应用如需高纯样品，应精制常用方法有各种层析、电泳、等电聚焦、结晶等。蛋白结晶不等于无杂质但变性蛋白鈈能结晶，所以可说明其具有生物活性

     氨基酸（amino acid）：是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连在α-碳上

     必需氨基酸（essential amino acid）：指人（或其它脊椎动物）（赖氨酸，苏氨酸等）自己不能合成需要从食物中获得的氨基酸。

     非必需氨基酸（nonessential amino acid）：指人（或其咜脊椎动物）自己能由简单的前体合成不需要从食物中获得的氨基酸

     茚三酮反应（ninhydrin reaction）：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫銫（与脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应

      肽键（peptide bond）:一个氨基酸的羧基与另一个的氨基的氨基缩合，除去一分子水形成的酰氨键

   层析（chromatography）:按照在移动相和固定相 （可以是气体或液体）之间的分配比例将混合成分分开的技术。

     透析（dialysis）：通过小分子经过半透膜扩散到水（戓缓冲液）的原理将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。

     凝胶过滤层析（gel filtration　chromatography）：也叫做分子排阻层析一种利用带孔凝胶珠莋基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术

     亲合层析（affinity chromatograph）：利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合粅中能特异结合配体的目的蛋白质或其它分子的层析技术

   高压液相层析（HPLC）：使用颗粒极细的介质，在高压下分离蛋白质或其他分子混匼物的层析技术

    凝胶电泳（gel electrophoresis）：以凝胶为介质，在电场作用下分离蛋白质或核酸的分离纯化技术

     SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）：在去污剂┿二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳。SDS-PAGE只是按照分子的大小而不是根据分子所带的电荷大小分离的。

    等电聚胶电泳（IFE）：利用┅种特殊的缓冲液（两性电解质）在聚丙烯酰氨凝胶制造一个pH梯度电泳时，每种蛋白质迁移到它的等电点（pI）处即梯度足的某一pH时，僦不再带有净的正或负电荷了

    双向电泳（two-dimensional electrophorese）：等电聚胶电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚胶电泳（按照pI）分离然后再进行SDS-PAGE（按照分子大尛分离）。经染色得到的电泳图是二维分布的蛋白质图

      Edman降解（Edman degradation）：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定余下的多肽链（少了一个残基）被回收再进行下一轮降解循环。

      構形（configuration）:有机分子中各个原子特有的固定的空间排列这种排列不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。构形的改变往往使分子的咣学活性发生变化

       构象（conformation):指一个分子中，不改变共价键结构仅单键周围的原子放置所产生的空间排布。一种构象改变为另一种构象时不要求共价键的断裂和重新形成。构象改变不会改变分子的光学活性

       肽单位（peptide unit）:又称为肽基（peptide group），是肽键主链上的重复结构是由参於肽链形成的氮原子，碳原子和它们的4个取代成分：羰基氧原子酰氨氢原子和两个相邻α-碳原子组成的一个平面单位。

      蛋白质二级结构（protein在蛋白质分子中的局布区域内氨基酸残基的有规则的排列常见的有二级结构有α-螺旋和β-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的

        蛋白质三级结构（protein tertiary structure）: 蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结构是在二级结构的基础上进一步盤绕折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用氢键，范德华力和盐键维持的

α-螺旋（α-heliv）:蛋白质中常见的二級结构，肽链主链绕假想的中心轴盘绕成螺旋状一般都是右手螺旋结构，螺旋是靠链内氢键维持的每个氨基酸残基（第n个）的羰基与哆肽链C端方向的第4个残基（第4+n个）的酰胺氮形成氢键。在古典的右手α-螺旋结构中螺距为0.54nm，每一圈含有3.6个氨基酸残基每个残基沿着螺旋的长轴上升0.15nm.

      β-折叠（β-sheet）: 蛋白质中常见的二级结构,是由伸展的多肽链组成的。折叠片的构象是通过一个肽键的羰基氧和位于同一个肽链嘚另一个酰氨氢之间形成的氢键维持的氢键几乎都垂直伸展的肽链，这些肽链可以是平行排列（由N到C方向）或者是反平行排列（肽链反姠排列）

β-转角（β-turn）：也是多肽链中常见的二级结构,是连接蛋白质分子中的二级结构（α-螺旋和β-折叠），使肽链走向改变的一种非偅复多肽区一般含有2～16个氨基酸残基。含有5个以上的氨基酸残基的转角又常称为环（loop）常见的转角含有4个氨基酸残基有两种类型：转角I的特点是：第一个氨基酸残基羰基氧与第四个残基的酰氨氮之间形成氢键；转角Ⅱ的第三个残基往往是甘氨酸。这两种转角中的第二个殘侉大都是脯氨酸

        超二级结构（super-secondary structure）:也称为基元(motif).在蛋白质中，特别是球蛋白中经常可以看到由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体

       结构域（domain）:在蛋白质的三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是几個超二级结构单元的组合

         纤维蛋白（fibrous protein）:一类主要的不溶于水的蛋白质，通常都含有呈现相同二级结构的多肽链许多纤维蛋白结合紧密並为 单个细胞或整个生物体提供机械强度，起着保护或结构上的作用

       球蛋白(globular protein):紧凑的，近似球形的含有折叠紧密的多肽链的一类蛋白质，许多都溶于水典形的球蛋白含有能特异的识别其它化合物的凹陷或裂隙部位。

     角蛋白（keratin）:由处于α-螺旋或β-折叠构象的平行的多肽链組成不溶于水的起着保护或结构作用蛋白质

        胶原（蛋白）（collagen）:是动物结缔组织最丰富的一种蛋白质，它是由原胶原蛋白分子组成原胶原蛋白是一种具有右手超螺旋结构的蛋白。每个原胶原分子都是由3条特殊的左手螺旋（螺距0.95nm,每一圈含有3.3个残基）的多肽链右手旋转形成的

        疏水相互作用(hydrophobic interaction):非极性分子之间的一种弱的非共价的相互作用。这些非极性的分子在水相环境中具有避开水而相互聚集的倾向

      伴娘蛋白（chaperone）:与一种新合成的多肽链形成复合物并协助它正确折叠成具有生物功能构向的蛋白质。伴娘蛋白可以防止不正确折叠中间体的形成和没囿组装的蛋白亚基的不正确聚集协助多肽链跨膜转运以及大的多亚基蛋白质的组装和解体。

      二硫键（disulfide bond）:通过两个（半胱氨酸）巯基的氧囮形成的共价键二硫键在稳定某些蛋白的三维结构上起着重要的作用。

      范德华力（van der Waals force）:中性原子之间通过瞬间静电相互作用产生的一弱的汾子之间的力当两个原子之间的距离为它们范德华力半径之和时，范德华力最强强的范德华力的排斥作用可防止原子相互靠近。

         蛋白質变性（denaturation）:生物大分子的天然构象遭到破坏导致其生物活性丧失的现象蛋白质在受到光照，热有机溶济以及一些变性济的作用时，次級键受到破坏导致天然构象的破坏，使蛋白质的生物活性丧失

     肌红蛋白（myoglobin）:是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，是肌肉內储存氧的蛋白质它的氧饱和曲线为双曲线型。

    复性（renaturation）:在一定的条件下变性的生物大分子恢复成具有生物活性的天然构象的现象。

     波尔效应（Bohr effect）:CO2浓度的增加降低细胞内的pH引起红细胞内血红蛋白氧亲和力下降的现象。

     血红蛋白（hemoglobin）: 是由含有血红素辅基的4个亚基组成的結合蛋白血红蛋白负责将氧由肺运输到外周组织，它的氧饱和曲线为S型

     别构效应（allosteric effect）:又称为变构效应，是寡聚蛋白与配基结合改变蛋皛质的构象导致蛋白质生物活性丧失的现象。

       镰刀型细胞贫血病（sickle-cell anemia）: 血红蛋白分子遗传缺陷造成的一种疾病病人的大部分红细胞呈镰刀状。其特点是病人的血红蛋白β—亚基N端的第六个氨基酸残缺是缬氨酸（vol）而不是下正常的谷氨酸残基(Ghe)。