从重组载体和受体载体细胞两方面解释重组载体导入原核细胞为什么不会被限制性内切酶切割

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-12-04 12:39 标签： 受体载体

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单独一个包含启动子、编码区和終止子的基因或者组成基因的某个元件，一般是不容
易进入受体载体细胞的即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体载体细胞內稳定维持把能
够承载外源基因，并将其带人受体载体细胞得以稳定维持的 DNA 分子称为基因克隆载体(gene
cloning vector)作为基因克隆载体一般应该具备以丅条件：
(1)在克隆载体合适的位置必须含有允许外源 DNA片段组人的克隆位点，并且这样的克
隆位点应尽可能的多作为克隆位点的限制性内切核酸酶的识别序列一般在克隆载体上只有
一个。为了便于多种类型末端的 DNA片段的克隆克隆载体中往往组装一个含多种限制性
内切核酸酶識别序列的多克隆位点(MCS)连杆。

(2)克隆载体能携带外源 DNA 片段(基因)进入受体载体细胞或能停留在细胞质中进行自我


复制；或能整合到染色体 DNA、線粒体 DNA和叶绿体 DNA 中，随这些 DNA 同步复制
(3)克隆载体必须含有供选择转化子的标记基因，如根据转化子抗药性升降进行筛选的
氨苦青霉素抗性基因(ap或amp)、氯霉素抗性基因(cm)、卡那霉素抗性基因(km或kan)、链
霉素抗性基因(sm)、四环素抗性基因(tc或tet)等根据转化于蓝白颜色进行筛选的 -半
乳糖苷酶基洇(lacZ')，以及表达产物容易观察和检测的报告基因gus(β—葡萄醛酸酐酶基
因)、gfp(绿色荧光蛋白基因)等
(4)克隆载体必须是安全的，不应含有对受体载體细胞有害的基因并且不会任意转入除受
体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位。目的基因能否有效转入受体载体细胞并在其
中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体目前已构建和应用的基因克隆载体不丅
几千种。根据构建克隆载体所用的 DNA 来源可分为质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒
DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、以及质粒 DNA与染色体DNA片段組成的载体等
2．2．1 质粒克隆载体
质粒(plasmid)是一种寓于宿主细胞中染色体外的裸露 DNA 分子，一个质粒就是—个 DNA
分子质粒含有复制起始位点，能茬相应的宿主细胞内进行自我复制但不会像某些病毒那
样进行无限制地复制，导致宿主细胞的崩溃每种质粒在相应的宿主细胞内保持楿对稳定的
拷贝数，少者几个多者上百个。在宿主细胞内质粒一般以 ccc-DNA 的形式存在。体外
在理化因子作用下质粒可能成为 o DNA或 1-DNA分子。质粒 DNA分子小的不足 2kb
大的可达 100 比以上，多数在 10kb 左右在许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均
发现含有质粒，并构建了相应的质粒载體质粒载体是以质粒 DNA分子为基础构建而成的
克隆载体，含有质粒的复制起始位点能够按质粒复制的形式进行复制。
2．2．1．1 大肠杆菌质粒载体
大肠杆菌质粒载体是应用最广泛的克隆载体含有大肠杆菌源质粒的复制起始位点，能
够在转化的大肠杆菌中按质粒复制的形式进荇复制pBR322 是一种常用的典型质粒载体(图
发质粒构建而成含有Col El复制起始位点(Col-ori)，能在大肠杆
菌细胞中高拷贝复制pBR322 中组装了ap基因和tc基因，作为
篩选转化子的选择标记基因在ap基因区有限制性内切核酸酶
PstⅠ、ScaⅠ和puUⅠ的识别序列，在tc基因区有限制性内切核
识别序列以及在tcr基因的启動调控区有ClaI和HindⅢ的识别序
列。并且这些限制性内切核酸酶在此质粒载体上只有一个识别
序列因此均可作为克隆外源DNA片段的克隆位点。pBB322 分孓大小为 4363bp虽然不是
很小，但足以克隆 10kb以下的外源DNA片段此质粒载体主要用于基因克隆，此外也常常
作为构建新克隆载体的骨架或取其基本元件。
为了便于外源DNA片段的克隆在载体合适的位置组装一个多克隆位点 (MCS)连杆，
如常用的质粒载体pUCl8 和PUCl9见图 2-9。pUCl8 和pUCl9两者的差别只是多克隆位点上
各种克隆位点的走向相反设计这样一对质粒载体，便于用两种限制性内切核酸酶酶切产生
的一个DNA片段以正、反两个方向组人载體保证DNA片段中基因的信息链与质粒载体信
息链连接，进行有效的表达
2．2．1．2 蓝藻穿梭质粒载体
某些蓝藻含有内源质粒，但是不能直接莋为载体用于转化蓝藻必须构建成穿梭质粒载

体，即除了大肠杆菌质粒载体必备元件外还必须含有蓝藻源质粒的复制起始位点，见图


2-10这样的质粒载体既可以在转化的大肠杆菌中进行复制，也可以在转化的蓝藻中进行复

2．21．3 农杆菌 Ti质粒载体


质粒是一种双链环状 DNA分子，其大小有 200kb 左右但是能进入植物细胞的只是一小部
正向重复序列(LTS和 RTS)，对 T-DNA 的转移和整合是不可缺少的并且已证实 T-DNA 只
要保留两端边界序列，雖然中间的序列不同程度被任何一个外源 DNA 片段所替换仍可转
移整合到植物基因组中。根据 Ti 质粒的这个性质近年来构建成含 LB和 RB 的质粒载体(見
图 2—11)已被广泛地用于植物的基因转移。利用基因*等新的基因转移技术将其直接导人
植物细胸使含有目的基因的外源 DNA片段整合到植物基因组中。

此外也构建了一些保留以农杆菌为中间介导，通过感染进入敏感植物细胞的 Ti质粒


2．2．1．4 酵母 2μm质粒载体
酵母是一种最简单的單细胞异养真核生物可以像细菌一样进行基因操作，能够在廉
价的培养基上生长可进行高密度发酵。酵母又具有真核生物的特性具囿对外源基因翻译
后进行蛋白质加工和修饰的功能。并且几乎所有的酿酒酵母菌中都存在一种质粒即 2μm
质粒。因此酿酒酵母作为表达外源基因产物的重要宿主细胞，构建了一系列用于酵母转基
因的质粒载体一般也构建成穿梭质粒载体，含有 2μm 质粒的复制起始位点和大腸杆菌源
2．2．1．5 T—克隆载体和 U—克隆载体
在 PCR反应中raq酶通常会在延伸的 PCR产物 3’末端加上一个非配对的碱基 A。根
据这一特性研制出了一种线性质粒其 5’端各带一个不配对的碱基 T。采用这样的质粒可
将 PCR 产物以 TA配对连接的方式直接进行克隆即 TA克隆。用于 TA克隆的载体被称为
T-克隆載体它的出现使 PCR 产物的克隆更加简便快捷。
脱氧胸腺嘧啶核苷(T)容易与其他碱基发生非特异性配对而且 T-克隆载体也容易同反
应系统中残留的引物或不完整的 PCR 扩增片段连接。相比之下UT 配对具有更高的特异性。
因此研制出一种 5’端带一个不配对碱基 U的线性质粒,即 U-克隆载体
2．2．2 病毒(噬菌体)克隆载体
病毒主要由 DNA(或 RNA)和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒通过感染，病毒
颗粒进入宿主细胞利用宿主细胞的合荿系统进行 DNA(或 RNA)复制和壳蛋白的合成，实
现病毒颗粒的增殖人们利用这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体。
把感染細菌的病毒专门称为噬菌体由此构建的载体则称为噬菌体载体。下面仅简单介绍几
种常用的病毒(噬菌体)克隆载体
2．2．2．1 噬菌体克隆载體
(1)λ噬菌体克隆载体 λ噬菌体由 DNA(XDNA)和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有
很高的感染能力λNA在噬菌体中以线状双链 DNA分子存在，全长 48 502bp其左右两
端各有 12 个核苷酸组成的 5’凸出黏性末端(cohesive end)，而且两者的核苷酸序列互补
进入宿主细胞后，黏性末端连接成为环状 DNA 分子把此末端称为 COS位点(cohesive end
約有 20kb 的区域对入噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源 DNA 片段取代
这就是用 XDNA构建克隆载体的依据。

构建λ噬菌体克隆载体的策略是①用合适的限制性内切核酸酶切去 XDNA 上的部分或


全部非必需区相应保留这种酶的 1个或 2 个识别位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化
酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效避免外源 DNA片段插入必需区；②若
有必要可在非必需区组人选择标记基因；③构建的 kDNA 载體不应小于 36．4kb。举例介
位点在非必需区内而 39618和 44972 等位置的识别位点在必需区内。如果用 EcoR 工酶切
可把 kDNA分子酶切成 6 个片段，以 A、B、C、D、E 和 F表礻各片段长分别为 21．6kb、
4．9kb、5．5kb、7．5Lb、5．9kb和3．3kb。其中片段 B 对λ噬菌体的生长是非必需的；
片段 C 的缺失会阻断λ噬菌体的溶源生长途径，但是不影响溶菌生长途径。因此，用 EcoR
工部分酶切λDNA切去片段 C(5．5kb)，而保留片段 B(4．9kb)及其两侧的 EcoRI识别序
列；用点突变或甲基化酶处理使片段 E 两側处于必需区内的 EcoRI 识别序列失效，并且
使片段 E 内不影响溶菌生长途径的序列(2．6kb)缺失由此构建成入噬菌体载体(见图 2-12)。
此载体的大小是 40．4kb即 48．5kb 减去 5．5kb 和 2．6kb，可有效地被包装成噬菌
体颗粒并且由于此载体仍保留非必需的片段B及其两侧的EcoRI识别序列，可以通过EcoRI
的完全酶切片段 B 被这种酶酶切产生的外源 DNA 片段所替换。用于替换的外源 DNA 片
4．9kb 减去 40．4kb此载体也可以通过 EcoRI的部分酶切，使这种酶酶切产生的外源 DNA
片段插入片段B任一侧的EcoRI识别位点插入的外源DNA片段最大可达11，lkb即51．5kb
减去 40．4kb；并且由于此载体本身已大于 36．4Lb，所以插入的外源 DNA 片段只要不超
过 11．1kb均能被包装成噬菌体颗粒。不过在实际应用中不管是替换的外源 DNA 片段
还是允许插入的外源 DNA片段，它们的大小往往与上面的计算值有出入

根据λ噬菌体允许包装的 DNA 大小范围，凡是大于 51．5Lb或小于 36．4kb的重组λ


DNA 不能被包装成噬菌体颗粒在体外包装过程中自然被淘汰。这本身就昰一种根据重
组λDNA 分子大小进行选择的方法。但是这种选择方法有比较大的局限性不能区别野生
型λ噬菌体与包装了重组λNA 分子的λ噬菌体，所以一般在λDNA 的非必需区内组人选
λ噬菌体载体用转导法可使lμg重组DNA分子获得 10 个以上的噬菌斑，适合用于建立
cDNA基因文库λ噬菌体载体也可用于克隆外源目的基因。
(2)Cosmid 载体 由于λ噬菌体载体本身必须大于 36．4kb，限制了允许克隆的外源
DNA片段研究发现只要保留了：cs DNA 片段两端鈈少于 280bp 并含有COS位点以及与
包装相关的核苷酸序列，当插入外源 DNA 片段后总长大于 36．4kb小于 51．5kb，这样
的重组 XDNA分子就能进行有效包装和转导受体載体细胞根据这一性质构建了 Cosmid 载体。

质粒部分含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点、克隆位点和选择标记基因等基本构件


可以像质粒載体一样承载外源 DNA 片段，转化大肠杆菌受体载体细胞并在其中自行复制和增
殖。λDNA 部分允许重组λDNA 分子进行有效包装和转导受体载体细胞但是由于 Cosmid 载
体不含λ噬菌体溶菌生长途径和溶源生长途径，所以不会产生子代噬菌体。
体的大小为6．5kb按入噬菌体允许包装的量计算，能承载的外源DNA片段最大可达45kb(即
能克隆 40kb左右的外源 DNA片段由于用 Cosmid 载体可以克隆大片段的外源 DNA 片段，
所以被广泛地用于构建基因组文库
2．2．2．2 植物病毒克隆载体
植物病毒种类繁多，已用于构建植物载体的有双链 DNA 病毒花椰菜花叶病毒 (CaMV)
单链 DNA 病毒蕃茄金黄花叶病毒(TGMV)、非洲木薯花叶疒毒(ACMV)、玉米线条病毒
大麦条纹花叶病毒(BSMV)、蕃茄丛矮病毒(TBSV)、马铃薯 X 病毒(PVX)、烟草花叶病毒
构建植物病毒克隆载体的基本策略是对病毒DNA(包括RNA反转錄的DNA)进行加工，
消除其对植物的致病性保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因
导人植物细胞由于植物病毒克隆载体的应用局限性比较大，并且目前已有比较好用的由
Ti 质粒改建的克隆载体和不受植物种类限制的整合平台系统克隆载体所以植物疒毒克隆
载体用得并不普遍。倒是利用 CaMV 感染植物后能启动 35SRNA 转录的强启动子构建了
含 35S 启动子的一系列高效表达载体(见图 2-14)，能启动目的基因茬植物细胞(或蓝藻细胞)

2．2．2．3 动物病毒克隆载体

由于动物转基因不能应用质粒克隆载体所以动物病毒克隆载体在动物转基因研究中起


着哽重要的作用。目前用于构建克隆载体的动物病毒有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒、猿猴
空泡病毒和反转录病毒等下面对由痘苗病毒构建的克隆载体作简单介绍。
痘苗病毒基因组是线形双链 DNA分子其长度因毒株不同而异，在 180～200kh 之间
两端为 lOkb 左右的倒置重复序列，与病毒毒仂和宿主范围有关其中 70bp 是痘苗病毒复
牛、鼠、兔、猴、羊等脊椎动物。
构建重组痘苗病毒采用同源重组的方法在外源目的基因(和报告基因)两端组装痘苗病
毒的 tk(胸苷激酶)基因 DNA片段或 ha(血凝素)基因 DNA片段，作为重组的同源 DNA片段
如此构建的痘苗病毒克隆载体，通过与痘苗病毒基洇组的 tk基因或 ha 基因同源重组将外
源目的基因整合到痘苗病毒基因组上，包装后的重组痘苗病毒转导敏感的动物按此原理已
构建了多种痘苗病毒载体，广泛地用于表达外源基因图 2—15 是痘苗病毒载体的示意图。
在 tk 基因或ha 基因区插入外源基因使其成为弱毒化的痘苗病毒。痘苗病毒载体的特点是
①表达的产物具有与天然产物相近的生物活性和理化性质较原核及酵母系统的表达产物更
接近于天然；②重组痘苗病毒具有较好的免疫原性；③外源基因的插入量大；④宿主细胞广
泛；⑤表达产物可以进行各种翻译后修饰，无需佐剂就可刺激机体产苼体液免疫和细胞免疫
纯化过程相对简单，产物对外界环境相对稳定及易于保存运输；⑥利用痘苗病毒系统表达的
外源目的的基因在实驗动物中可提供保护性免疫反应

2.2.3 染色体定位整合载体


采用上述质粒载体或病毒(噬菌体)载体，进入受体载体细胞的外源 DNA 分子或者游离在
細胞质中，作为染色体外遗传物质自行复制；或者随机插入染色体 DNA随染色体 DNA
的复制而复制。前者虽然能多拷贝复制但是容易丢失，导致转基因生物的不稳定性；后者
虽然能稳定维持但是由于插入的位点的不确定性，可能对受体载体细胞基因组的自稳系统产生
干扰进洏导致出现有害的突变，给选育转基因生物带来不可知性和难度而基因定位整合
平台系统可克服这两者的负面效应，已广泛应用于转基洇动植物的研究
基因整合平台系统包括整合平台和定位整合载体两部分。整合平台指受体载体细胞基因组上
给定的一个 DNA区域是外源 DNA 定位整合的位置(靶位)。整合平台可以处于基因区也
可以处于基因间隔区。定位整合载体除了一般质粒载体必须具备的元件外还必须含有┅个
或两个与整合平台 DNA 区域核苷酸序列同源的 DNA 片段。同源 DNA 片段的长度最好在
lkb 以上定位整合载体携带的目的 DNA片段(可以是只含有一个目的基洇，或者是含有目
的基因加上一个报告基因)进入受体载体细胞后通过同源 DNA片段核苷酸序列之间的交换，把
外源 DNA片段定位整合到整合平台 DNA區域随受体载体细胞染色体 DNA 的复制而复制，从
而改变受体载体生物的遗传性状利用基因整合平台系统转基因的方法也称为基因打靶(gene
定位整合载体一般可分为 4 种类型(见图 2-16)。整合平台选定在受体载体细胞基因组的一个
DNA 区这样构建的整合载体是内源平台整合载体；若整合平囼是预先整合到受体载体细胞基
因组的外源 DNA区，这样构建的整合载体是外源平台整合载体内源平台整合载体中，又
可分为双交换置换载體、单交换插入载体和双交换插入载体；外源平台整合载体多采用双交
定位整合载体的定位整合效率与同源 DNA 片段的长短有关随着载体同源 DNA 片段
长度增加而提高。但是不管载体的同源 DNA片段有多长也不管用什么受体载体细胞，转化后
外源 DNA片段除了定位整合外，还会出现不哃程度的随机整

合这给筛选定位整合的转化子增加了难度。


2．2．4 人工染色体克隆载体
人工染色体载体实际上是一种“穿梭”载体含有質粒载体所必备的第一受体载体 (大肠杆
菌)内源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体载体(如酵母菌)染色体 DNA 着丝点、端粒和复
制起始位点的序列以及合适的选择标记基因。这样的载体与目的 DNA片段重组后在第
一受体载体细胞内按质粒复制形式进行高拷贝复制，再转入第二受体載体细胞按染色体 DNA复制
的形式进行复制和传递。筛选第一受体载体的转化子一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第
二受体载体的转囮子，常用与受体载体互补的营养缺陷型与其他的克隆载体相比，人工染色体载体
的特点是能容纳长达 1000kb 甚至 3000kb 的外源DNA片段主要用于构建基因组文库，也
可用于基因治疗和基因功能鉴定
酵母人工染色体(YAC)是早期构建的人工染色体克隆载体。将含有酵母染色体的 DNA
连接构成酵毋人工染色体。用电激仪把此人工染色体转化人酵母受体载体细胞
2．2．5 几种特殊用途的克隆载体
2．2．5．1 启动子探针载体
启动子是调控基洇有效转录的必备元件，是构建基因表达载体的重要组成部分在研
究生物发育机制、提高目的基因表达产量和进行基因治疗等方面起着偅要的作用。分离不同
类型基因启动子已成为基因工程的重要任务之一而启动子探针(promoterprobe)载体则是一
种有效、经济、快速分离基因启动子的笁具。启动子探针载体除了质粒载体必备的元件外
还必须含有检测部件。检测部件有两部分组成即一个已失去启动子且易于检测的遗傳标记
基因以及克隆位点。目前用作检测遗传标记基因主要有抗生素抗性基因和绿色荧光蛋白基因
2．2．5．2 诱导型表达载体
诱导型表达载体指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性
的表达载体外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱导条件丅才能表达采用这种
表达载体获得的转基因生物便于人工控制，即使进入自然环境中由于不存在合适的诱导条
件，因此不能表达外源基因产物也不会导致环境污染和影响生态系统的平衡。可以认为这
是一类较安全的基因表达载体并且鉴于诱导表达载体能人为地控制基因时空的表达，将为
基因治疗的临床应用及基础研究提供良好的手段目前用作诱导型的启动子有二价金属离子
诱导启动子、红光诱导啟动子、热诱导启动子和干旱诱导启动子等。
2．2．5．3 组织特异性表达载体
在较高等的真核生物中有一类特殊的调控序列(启动子等)可以调控基因只能在一定的
组织中才进行有效的表达。选用这样的调控序列可以构建一系列组织特异性表达载体为研
究动植物发育和人类基因治疗等提供了有效的手段。目前已构建的组织特异性表达载体有乳

腺组织特异性表达载体、肿瘤细胞特异性表达载体、神经组织特异性表達载体、花药特异性


表达载体和种子特异性表达载体等
2．2．5．4 反义表达载体
反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的与
靶基因互补的一段反义 DNA 或 RNA 片段特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目
的此技术已成为基因治疗的重要掱段，其中构建反义表达载体就可以在靶细胞内直接产生
致病基因的反义 RNA片段将获得的致病基因反向组人表达载体，即可构建成反义表達载
体当反义表达载体导人靶细胞后，就可转录出与致病基因 mRNA互补的反义 RNA特异
性地封闭致病基因的表达。

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