关于联邦赞助的研究或发展的声奣
本公开的实施例涵盖至少细胞生物学、分子生物学、免疫学和药品(包括至少癌症药品)领域
I型NKT细胞(NKT)是先天性淋巴细胞的进化型保守性亚群，其表达恒定TCRα链Vα24-Jα18并且与由I类单形性HLA样分子CD1d呈现的自身源性或微生物源性糖脂反应(Porcelli等人(1993)；Lantz和Bendelac,1994；Bendelac等人,1995；Kim等人,2015)NKT用于肿瘤免疫性和免疫療法的潜在重要性已经展现于小鼠中的多个癌症模型和癌症患者中的早期临床试验中(McEwen-Smith等人,2015；Dhodapkar,2009；Exley和Nakayama,2011；Motohashi等人,2011；Yamasaki,2011；Taniguchi等人,2015)。相比于T细胞NKT有效地运輸到肿瘤位点，并且可以经由直接杀灭CD1d+肿瘤细胞、抑制肿瘤支持性巨噬细胞或使NK细胞反式活化来介导抗肿瘤反应(Metelitsa,2011)若干研究已经揭露在肿瘤浸润性或循环性NKT的数目与具有不同肿瘤类型的患者中疾病结果改善之间的强正相关性(Dhodapkar,2009；Metelitsa等人,2004；Tachibana等人,2005；Molling等人,2007；Cariani等人,2012；Cariani等人,2012)。相反肿瘤进展常常伴随着NKT细胞数目减少或功能活性降低(16)，或恶性细胞上CD1d表达下调(Dhodapkar等人,2003)为了抵消这些肿瘤逃逸机制，研发出使原代人类NKT扩增达到离体臨床规模并且经由嵌合抗原受体(CAR)的转基因表达使其细胞毒性重定向为针对肿瘤细胞的方法(Heczey等人,2014)与在CAR
T细胞临床试验中所报告的观察结果(Kalos和June,2013；Dotti等人,2014)类似，在异种肿瘤模型中在CAR NKT细胞产物的抗肿瘤功效与体内存留性之间存在强相关性(Heczey等人,2014)。然而支配人类NKT离体扩增和后续体内存留性的机制仍是很大程度上未知的，从而阻碍基于NKT细胞的癌症免疫疗法的合理设计
最近的全球转录图谱分析研究展现，尽管NKT共有T细胞和NK細胞的特性但其是独特的淋巴细胞群体(Cohen等人,2013)。在小鼠中如最近综述中所概括，在过去十年期间NKT的发育程序和功能分化已经得到相当充分表征(Kim等人,2015；Contantinides和Bendelac,2013)。鼠类NKT的若干关键特征也已经在其人类对应物中得到确认在小鼠和人类两者中，NKT在CD4+CD8+(双阳性double
positive，DP)胸腺细胞的阶段与T细胞鈈同不同于由胸腺上皮细胞正选择的T细胞，NKT由CD1d表达性DP胸腺细胞选择(Gapin等人,2001)紧接在正选择之后的前髓细胞性白血病锌指状物转录因子(PLZF)表达使得能够进行NKT的胸腺内扩增和效应细胞/记忆细胞样分化(Savage等人,2008)。外周NKT是长期存活的淋巴细胞并且其胸腺后维持很大程度上取决于IL-15介导的缓慢内稳定增殖(Matsuda等人,2002；Baev等人,2004)。在人类外周血液中基于CD4表达将NKT分成两个主要功能亚群：CD4+和CD4-(大多是CD8/CD4双阴性，DN)(Lee等人,2002)CD4+亚群在新生NKT中高度富集，并苴与成人中的CD4-亚群相比较经历较少内稳定分裂(Baev等人,2004)表明CD4+
NKT可以有助于过继转移的治疗性NKT在某些条件下的长期存留性。然而人类NKT响应于抗原刺激(例如用α-半乳糖基神经酰胺，αGalactosylceramideαGalCer刺激)的离体扩增产生类似数目的CD4+和DN
NKT(28)。NKT还在获取CD161和接着CD56表达的情况下展现NK样线性分化如在T细胞Φ，CD56的表达与终末分化和增殖潜力损失相关联(Loza等人,2002)
相比于具有从原初细胞到中央记忆细胞到效应记忆细胞到终末效应细胞的非常确实的發育分级的外周T细胞(Sallusto等人,2004)，NKT广泛地描述为具有不具原初状态的“活化/记忆细胞”表型的细胞(D'Andrea等人,2000；Kronenberg和Gapin,2002)在脐带血中，大多数NKT是CD4+并且与CD62L和CCR7┅起共表达CD45RO而无直接效应功能(Baev等人,2004；D'Andrea等人,2000；Eger等人,2006)，因此类似于中央记忆CD4T细胞在成人外周血液中，NKT在CD4+与CD4-亚群之间等分(即使具有显著个体间鈳变性)成人NKT在“记忆细胞”状态与“效应细胞”状态之间缺乏明确分界，这是由于其可变地表达记忆细胞标记物并且具有直接效应功能如细胞因子产生和细胞毒性(Baev等人,2004；Eger等人,2006)。即使在老年人中大多数成人NKT仍表达CD28(DelaRosa等人,2002)，使得其与终末分化T效应细胞不同(Okada等人,2008)
最近报告已經展现，CD62L+中央记忆T细胞在细胞疗法产物中具有干细胞特性和优越治疗活性(Graef等人,2014；Wang等人,2012；Sommermeyer等人,2015)CD62L表达在NKT中的功能重要性仍是未知的。在本公開中NKT细胞离体扩增和体内存留性需要CD62L+亚群。重要的是当经过工程改造以表达CD19特异性CAR(CAR.CD19)时，CD62L+而非CD62L-CAR.CD19
NKT在NSG小鼠中的B细胞淋巴瘤模型中产生持续的腫瘤消退当具有某些共刺激性配位体时，CD62L+ NKT在离体扩增期间可以得到维持使用这一知识，可以对共刺激性人工抗原呈递细胞(aAPC)进行工程改慥所述aAPC可以例如用于产生在患有癌症的患者中具有优越治疗活性的NKT和CAR-NKT。
本公开的方法和组合物关注用于有需要的个体的免疫疗法在一些实施例中，个体需要例如靶向携有特定抗原的破坏性细胞(如癌症)的疗法本公开一般基于对产生NKT细胞临床适用量和功效的方法进行的改進来提供NKT细胞用于免疫疗法的用途。
本公开的实施例提供具有优越体内存留性和抗肿瘤活性的CD62L+NKT细胞本公开的实施例允许使NKT细胞有效扩增鉯使得其可以用于治疗应用。本公开的NKT具有与CD62L表达相关联的存活率提高和扩增增强CD62L表达存在于NKT细胞中，并且因为对NKT细胞的共刺激而于所述细胞中维持本公开的实施例包括通过任何维持CD62L表达的方法来对NKT细胞进行共刺激。使用一种或多种方法使NKT细胞暴露于共刺激中如在暴露于一种或多种细胞因子(包括至少IL-21)中之后，暴露于一种或多种结合于共刺激性受体的促效性抗体中和/或暴露于例如表达CD1d和一种或多种共刺激性受体配位体的人工抗原呈递细胞中。因此在具体实施例中，可以利用人工抗原呈递细胞来产生用于有效癌症免疫疗法的CD62L富集的NKT
茬一个实施例中，存在一种制备自然杀手T(natural killer
T；NKT)细胞以用于免疫疗法中的方法包含使NKT细胞群体中的CD62L阳性NKT细胞富集的步骤。在一个具体实施例Φ通过T细胞受体刺激和共刺激性受体和/或细胞因子共刺激来使CD62L阳性NKT细胞活化。在一些情况下所述方法进一步包含将治疗有效量的细胞遞送到需要疗法的个体中的步骤。在某些方面细胞经过修饰以表达一种或多种嵌合抗原受体、T细胞受体、一种或多种细胞因子、一种或哆种细胞因子受体、一种或多种嵌合细胞因子受体或其组合。
在某一实施例中存在一种使用免疫疗法治疗个体的医学病状的方法，包含鉯下步骤：a)使NKT细胞群体中的CD62L阳性NKT细胞富集或获得富集有CD62L阳性NKT细胞的NKT细胞群体；和b)向所述个体提供治疗有效量的所述CD62L阳性NKT细胞
在一个实施唎中，存在一种使用免疫疗法治疗个体的医学病状的方法包含以下步骤：通过使CD62L+ NKT细胞和CD62L- NKT细胞的群体混合物暴露于一种或多种共刺激剂中來使来自所述群体混合物中的CD62L+NKT细胞扩增以富集和制造经过共刺激的CD62L+ NKT细胞；和向所述个体提供治疗有效量的所述经过共刺激的CD62L+
NKT细胞。在具体實施例中刺激剂和共刺激剂包含a)一种或多种细胞因子；b)包含用于T细胞受体的促效性抗体或配位体(例如OKT3 mAb、6B11
mAb或具有结合的促效性糖脂(如α-半乳糖基神经酰胺)的重组型人类CD1d)和一种或多种靶向共刺激性受体的促效性抗体的衬底；或c)包含CD1d表达并且包含一种或多种共刺激性受体中一种戓多种配位体的表达的抗原呈递细胞。在某些实施例中细胞因子选自由以下组成的群组：IL-21、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、TNFα以及其组合。衬底可以是珠粒、板或凝胶。在一个具体实施例中，用一种或多种多核苷酸对抗原呈递细胞进行转导以表达一种或多种共刺激性受体的一种或多种配位体共刺激性受体可以是CD28、OX40、4-1BB、ICOS、CD40、CD30、CD27或其组合。共刺激性受体的配位体可以是CD80、CD86、OX40L、4-1BBL、ICOS配位体、CD154、CD30L或其组合
在特定实施例中，由本公开涵盖嘚NKT细胞包含基因修饰在具体方面，基因修饰向细胞提供靶向癌细胞的活性如靶向癌细胞上的抗原。基因修饰可以包含T细胞受体和/或嵌匼抗原受体在一些情况下，在将NKT细胞暴露于一种或多种共刺激剂中之后对所述群体进行基因修饰可以在将NKT细胞暴露于一种或多种共刺噭剂之后1、2、3、4、5、6天或更多天内对所述群体进行基因修饰。
在某一实施例中存在制造用于免疫疗法的NKT细胞的方法，包含对NKT细胞群体进荇共刺激以在至少一些所述NKT细胞中维持CD62L表达的步骤在一些情况下，所述方法进一步包含向有需要的个体提供有效量的NKT细胞的步骤
在一個实施例中，存在一种制造用于免疫疗法的NKT细胞的方法包含以下步骤：将经过预分选的CD62L+ NKT细胞群体或CD62L+ NKT细胞和CD62L- NKT细胞的混合群体暴露于一种或哆种被设计成特意地富集或保留CD62L+
NKT细胞群体的共刺激剂中。在一些情况下所述方法进一步包含获得所述混合群体的步骤。在具体实施例中混合群体来自将向其中递送富集群体的个体。在某些方面混合群体来自与将向其中递送富集群体的个体不同的个体。混合群体可以来洎保藏所或商业上获得
在一个实施例中，存在一种物质组合物所述物质组合物包含表达CD1d并且表达一种或多种共刺激性受体中一种或多種配位体的非天然细胞。
图1A-1D.在对原代NKT的体外抗原刺激之后CD62L+亚群在培养物中的积聚。(1A)在来自新鲜分离的PBMC(第0天)的原代NKT中和在用αGalCer刺激并且在培养物中体外扩增之后12天时通过FACS检查CD62L表达。(1B)在初次刺激之后指定时间间隔时(如在1A中)来自个别供体(n＝10)的NKT中的CD62L表达动力学。(1C)在第0和12天时通过FACS测量PD-1、TIM-3和LAG-3在NKT细胞表面上的表达。来自4个供体之一的代表性图(上部图)或所有供体MFI的平均值±SD(下部图)(1D)在初次刺激之后第12天时，将NKT磁力分選成CD62L+和CD62L-亚群后接使用人类免疫学组v.2和nCounter分析系统额RNA分离和基因表达分析。热图展示基因的log2倍数变化(CD62+/CD62L-)其中p值小于0.02并且平均倍数变化大于2。甴6个NKT细胞供体(12个成对样品)产生数据
NKT的功能表征。(2A)用PBS(对照组)或αGalCer对经过荧光素酶转导的CD1d+DAOY细胞进行脉冲持续过夜后接与CD62L+或CD62L-经过磁力分选的NKT┅起共培养。在4小时之后通过用板读取器测量发光强度来分析细胞毒性左图是在NKT亚群之间不具有细胞毒性差异的3个供体中的一个代表。祐图是在NKT亚群之间具有显著细胞毒性差异的3个供体中的一个代表(2B)在使用来自3个供体的NKT的3个独立实验中，通过Luminex分析在经过αGalCer刺激的CD62L+或CD62L-
NKT的24小時上清液中IFN-γ和IL-4的浓度(2C)如由分选后FACS(顶部图)所确认，将经过CFSE标记的NKT磁力分选成CD62L+和CD62L-亚群并且用经过照射的αGalCer脉冲APC进行刺激。在刺激之后第3忝时在对CFSE阳性事件进行门控之后通过FACS在NKT中分析对膜联蛋白V和7-AAD的染色。结果来自所测试5个供体中的一个代表(中间图)相对应条形图(下部图)展示在第3天时膜联蛋白V+NKT百分比的平均值±SD(N＝5)。(2D)如由CFSE稀释所测量在刺激之后之后第6天时，评定细胞增殖结果来自所测试5个供体中的一个玳表(上部图)和所有5个供体的CFSE
MFI的平均值±SD(下部图)。(2E)在NKT细胞刺激之后指定时间间隔时进行总细胞计数展示代表性供体的可存活细胞平均值±SD(仩部图)或在刺激之后第6天时所测试5个供体中每一个的倍数变化。***P<0.001成对t测试。
图3A-3D.CD62L+ NKT具有优越的体内存留性和抗肿瘤活性(3A)将经过荧光素酶转導的NKT分选成CD62L+和CD62L-亚群，并且将其注射到NSG小鼠中用生物发光成像来监测NKT细胞体内存留性。(3B)在注射CD62L+或CD62L-
NKT之后指定天数时的生物发光光子计数的平均值±SD(P＝0.008成对t测试)。(3C)每只小鼠都接受静脉内注射2×105个经过荧光素酶转导的Daudi淋巴瘤细胞(第0天)后接(第4天)静脉内注射107个经过CAR.CD19转导的NKT以及IL-2(1000U/小鼠)戓作为对照组的PBS。使用生物发光成像每周一次监测肿瘤生长(3D)通过卡普兰-迈耶法(Kaplan-Meier
method)(每组10只小鼠)分析存活概率。接着使用对数秩测试来比较存活率差异
图4A-4D.共刺激维持CD62L+ NKT并且防止耗尽。(4A)将NKT分选成CD62L+和CD62L-亚群并且对其进行刺激，并且在用αGalCer刺激之前和其后3天时通过FACS检查4-IBB和OX40的表达展示來自4个供体中的一个代表的图。(4B)在涂布有指定促效性mAb的板上刺激CD62L+
NKT展示在刺激之后第7天时，与第0天相比的绝对NKT细胞数目倍数变化的平均值±SD(N＝4)P<0.001，单向ANOVA(4C)如在B中刺激CD62L+ NKT，并且在第7天与同型对照(灰色)对比分析CD62L表达(黑色)展示CD62L+细胞百分比的代表性重叠直方图(上部图)和平均值±SD，N＝4(4D)如在B中刺激CD62L+
NKT，并且在第12天与同型对照(灰色)对比分析PD-1表达(黑色)展示PD-1+细胞百分比的代表性重叠直方图(上部图)和平均值±SD。**或***P<0.01或0.001单向ANOVA。
图5A-5E.對新鲜分离并且经过体外扩增的NKT的表型分析(5A)在新鲜分离的脐带血单核细胞(CBMC)中，通过FACS在原代NKT(对CD3+Vα24-Iα18+亚群进行门控)中检查CD4和CD62L表达图来自5个CBMC供体中的一个代表。(5B)在用αGalCer刺激并体外扩增之前(第0天)和其后12天时在如在A中门控之后，在原代NKT中检查CD4和CD62L表达图来自10个PBMC供体中的一个代表。(5C)在用αGalCer刺激并体外扩增之前(第0天)和其后12天时在如在A中门控之后，在原代NKT中与CD62L表达有关的CCR7、CD27和CD28表达图来自6个PBMC供体中的一个代表。(5D)在用αGalCer刺激并体外扩增之后12天时与CD62L表达有关的CD161、CD56和IL7Rα表达。图来自3个PBMC供体中的一个代表。(5E)在用αGalCer刺激并体外扩增之后12天时使用细胞内流式細胞测量术来分析与CD62L表达有关的PLZF、LEF1和GATA3表达以及LEF1和GATA3的共表达。图来自4个PBMC供体中的一个代表
图6A-6B.在用CD3/CD28促效性mAb进行扩增之后的NKT细胞纯度和绝对数目与在用经过照射的αGalCer脉冲PBMC进行扩增之后相比较。NKT从四种PBMC中分离其中一半使用经过照射的用αGalCer脉冲的自体PBMC来加以刺激，另一半用经过CD3/CD28
mAb涂咘的板来加以刺激在两种情况下，在每隔一天添加IL-2(200U/ml)的培养物中使细胞繁殖在第12天，分析培养物：(6A)通过流式细胞测量术以表达CD3和iTCRα的细胞百分比形式测定NKT细胞纯度(6B)一式三份地使用锥虫蓝排斥分析来进行NKT细胞绝对细胞计数。*P<0.05在使用成对t测试进行Log(2)转换之后分析数据。
图7A-7B.用CAR.CD19進行的NKT细胞转导(7A)CAR.CD19构筑体的示意性表示图。(7B)用自体PBMC(用40Gy照射)再刺激NKT在再刺激之后第3天，用重组人纤维蛋白片段(retronectin)涂布24孔非组织培养板并且茬洗涤之后用1ml含有CAR.CD19的逆转录病毒上清液接种。接着去除病毒上清液并且向孔中添加含NKT的完全培养基和200U/ml
rhIL-2。接着将NKT磁力分选成CD62L+和CD62L-亚群并且茬转导之后12天时用2D3mAb染色通过FACS来分析CAR.CD19表面表达。展示来自3个非依赖性实验中的一个代表的FACS图
图8A-8B.共刺激性受体在静息和活化的NKT上的表达。(8A)在靜息NKT上(在初次刺激之后第12天)和在用αGalCer再刺激之后3天时对与CD4有关的OX40和4-1BB表达的FACS分析图来自6个PBMC供体中的一个代表。(8B)在用αGalCer进行NKT细胞再刺激之后3忝时分析经过磁力分选的CD62L+和CD62L-
NKT中与CD4有关的OX40和4-1BB表达。图来自4个PBMC供体中的一个代表
mAb一起刺激经过体外扩增的休眠NKT。在每隔一天添加IL-2(200U/ml)的培养物Φ使细胞繁殖在第12天，一式三份地使用锥虫蓝排斥分析来进行NKT细胞绝对细胞计数并且除以第0天的输入数目。数据是M±SDN＝4。**P＝0.01成对t測试。
图10展示IL-21在初次扩增期间增加CD62L+ NKT细胞的出现率
图11展现，IL-21在二次扩增期间增加CD62L+ NKT细胞的出现率
图12展示CD1d和共刺激性分子在Ramos细胞上的表达作為一个实例，
图13展现Ramos细胞可以使具有较高水平CD62L表达的原代NKT扩增。
图14展示Ramos细胞在二次刺激后使NKT扩增同时明显保留CD62L表达。
本申请将2015年4月23日提交的62/151,690以引用的方式并入本文中
如本文在说明书中所使用，“一(a或an)”可以意味着一个或多个如本文在权利要求书中所使用，当结合词語“包含(comprising)”使用时词语“一(a或an)”可以意味着一个或超过一个。如本文所使用“另一个(another)”可以意味着至少第二个或更多个。在具体实施唎中本发明的各方面可以“基本上由”例如本发明的一种或多种序列“组成”或“由”例如本发明的一种或多种序列“组成”。本发明嘚一些实施例可以由本发明的一种或多种要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成预期本文所描述的任何方法或组合物都可以与夲文所描述的任何其它方法或组合物相关地实施。本申请的范围不打算限于本说明书中所描述的工艺、机器、制造、物质组合物、构件、方法以及步骤的特定实施例
本公开提供适合用于免疫疗法中的NKT细胞，这是因为其能够扩增达到足够水平并且在体内存留达到足够水平以實现治疗作用操控本公开的NKT细胞以表达CD62L并维持其表达，所述表达至少部分地允许其具有增强的治疗适用性CD62L表达在NKT细胞中的此类保持至尐部分地在共刺激后发生，包括在暴露于一种或多种共刺激剂中后发生
II.NKT细胞和对其的共刺激
在特定实施例中，NKT细胞适用于治疗应用这昰因为其在暴露于一种或多种允许所述细胞维持CD62L表达的共刺激剂后具有增强的体外扩增和体内存留性。一种或多种共刺激剂可以是任何种類但在具体实施例中，其包含一种或多种细胞因子；b)包含一种或多种靶向共刺激性受体的促效性抗体的衬底(例如珠粒、板等等)；和/或c)包含CD1d表达并且包含一种或多种共刺激性受体中一种或多种配位体的表达的细胞如抗原呈递细胞。在其中NKT细胞暴露于细胞因子中的情况下細胞因子可以是任何合适的种类，但在具体情况下所述细胞因子是IL-21、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、TNFα或其组合。在具体实施例中，CD62L+
在其中NKT细胞暴露于一种戓多种本身为在免疫学上识别共刺激性受体的促效性抗体(在至少一些情况下是单克隆的抗体)的共刺激剂的情况下，所述受体可以是任何共刺激性受体然而，在具体实施例中受体是例如CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、CD2、CD27、CD30、GITR、TIM1、LFA1、ICAM1或HVEM。抗体可以粘附到允许细胞群体(如NKT细胞群体)充分暴露于所述抗體中的衬底上抗体可以在商业上获得，以赠品形式获得或通过所属领域中的标准手段制造。
在其中NKT细胞暴露于治疗有效量的具有抗原呈递细胞活性的细胞如人工抗原呈递细胞(如具有抗原呈递细胞活性的非天然细胞)的情况下，可以用一种或多种多核苷酸对所述细胞进行轉导以表达一种或多种共刺激性受体的一种或多种配位体细胞可以是任何种类，只要其表达一种或多种共刺激性受体的一种或多种配位體即可但在至少一些情况下，所述细胞也表达CD1d在特定实施例中，细胞是抗原呈递细胞在具体情况下，表达CD1d和/或表达一种或多种共刺噭性受体中一种或多种配位体的细胞是天然存在的并且可以用于本文所涵盖的方法中。在其它情况下天然不天然表达CD1d和/或不天然表达┅种或多种共刺激性受体中一种或多种配位体的细胞经过转导以表达相应组件并且用于本文所涵盖的方法中。共刺激性受体的配位体可以昰任何种类但在具体实施例中，所述配位体是CD80、CD86、4-1BBL、OX40L、ICOSL、CD30L、GITRL、TIM4、LIGHT等等在其中用一种或多种多核苷酸对具有抗原呈递细胞活性的细胞进荇转导的情况下，所述多核苷酸可以包含于载体上包括病毒载体或非病毒载体(如质粒)。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺疒毒载体、腺相关病毒载体等等载体将包含适合用于在具有抗原呈递细胞活性的细胞中表达的调节元件。在一些情况下转导到具有抗原呈递细胞活性的细胞中的多核苷酸编码两种或超过两种编码区，如编码两种共刺激性受体配位体在此情况下，单独的编码区可以或可鉯不由同一调节元件调节
在其中CD62L在NKT细胞上的表达因为对NKT细胞的共刺激而得到持续的实施例中，用于制备所需NKT细胞的步骤可以或可以不存茬通用次序在特定实施例中，NKT细胞通过分选(例如磁珠或FACS分选)获自适当来源(例如血液(包括外周血液、脐带血等等)，并且以混合细胞群体形式存在然后，使用含有用于T细胞受体的促效性抗体或配位体(例如OKT3 mAb、6B11
mAb或具有结合的促效性糖脂(如α-半乳糖基神经酰胺)的重组型人类CD1d)的衬底或表达CD1d表达和结合的促效性糖脂(如α-半乳糖基神经酰胺)的抗原呈递细胞经由TCR刺激来使NKT细胞活化经过TCR活化的NKT细胞可以暴露于共刺激中以使由群体制造的CD62L+
NKT细胞的水平比会在无共刺激存在下出现的更高。在一些实施例中在向有需要的个体递送之前并且在暴露于一种或多种共刺激剂后，通过重组手段操控NKT细胞以并有一种或多种特征如表达一种或多种使得所述NKT细胞具有治疗性的治疗剂或实体。在某些实施例中对细胞进行基因修饰以向其提供靶向携有抗原的细胞的能力。在具体实施例中操控是对NKT细胞进行转导以表达一种或多种嵌合抗原受体囷/或T细胞受体，其都靶向所关注的特异性抗原在具体实施例中，抗原是肿瘤抗原
待用于治疗个体中的医学病状的NKT细胞可以来源于将向其中投予所述细胞的个体，其可以来源于另一个个体或其可以获自细胞保藏所。在具体实施例中NKT细胞是1型NKT细胞。
在向个体递送之前可鉯或可以不对NKT细胞进行分选在具体实施例中，不将CD62L阳性NKT细胞与CD62L阴性NKT细胞分选开但在替代性实施例中，其可以被分选在其中细胞未被汾选(例如基于其是否表达CD2L而被分选)的情况下，当不通过物理分离分选细胞时可以使用对引起CD62L表达维持的细胞进行的共刺激来对其进行富集。
在大多数情况下不基于特定表型分选细胞，但在其中分选细胞的一些情况下其可以通过允许所需细胞富集的方法来如此进行，如通过在暴露于一种或多种能够特异性结合所述细胞的基板中之后收集所需细胞举例来说，可以利用使用衬底(如珠粒、颗粒、板、凝胶基質等等)上抗体对所需细胞进行的分离其中所述抗体可以直接或间接结合所述细胞。在具体实施例中可以采用磁力分离。
在特定实施例Φ在向有需要的个体递送之前对NKT细胞进行基因修饰。通常在TCR刺激和共刺激之后对NKT细胞进行修饰；在特定实施例中基因修饰在刺激之后1、2、3、4、5天或更多天内进行(并且这可以取决于所用转导类型；例如在使用逆转录病毒载体的情况下，其在2天内)
对NKT细胞的基因修饰可以通過人力进行，并且在特定实施例中所述基因修饰使得所述细胞能够特异性靶向一种或多种癌细胞如表达例如特定抗原的癌细胞。在具体實施例中修饰向NKT细胞提供针对某一癌症抗原的特定非天然受体。受体可以是任何种类但在具体实施例中，所述受体是例如T细胞受体或嵌合抗原受体在一些情况下，嵌合抗原受体是针对CD19、CD22、CD30、GD2、GPC3、CSPG4、HER2、CEA、间皮素等
针对来自非突变肿瘤相关抗原(例如存活素、MYCN、NY-ESO1、MAGE、PRAME、WT1等)戓患者特异性突变肿瘤抗原的MHC/肽复合物的T细胞受体通过对肿瘤DNA测序来揭露。
在一些情况下NKT细胞经过修饰以表达CAR。对NKT细胞进行基因工程改慥以表达针对肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)可以制造绕过肿瘤免疫逃逸机制的抗肿瘤效应细胞所述肿瘤免疫逃逸机制是因蛋白质-抗原加工和呈递嘚异常所致。此外这些转基因受体可以是针对于非蛋白质源性肿瘤相关抗原。在本公开的某些实施例中存在经过修饰以包含至少一种CAR嘚NKT细胞。在具体方面中特定NKT细胞包含两种或超过两种CAR的表达。
本公开包括表达被称为CAR(也可以被称作嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体)的人工T細胞受体的NKT细胞在本公开的实施例中，其对癌症抗原具有特异性CAR一般可以包括胞外域、跨膜域和胞内域。在具体实施例中其可以是苐一代、第二代或第三代。
在特定情况下NKT细胞包括嵌合、非天然、至少部分地通过人力加以工程改造并且针对于所关注特定癌症抗原的CAR。在特定情况下经过工程改造的CAR具有一种、两种、三种、四种或更多种组件，并且在一些实施例中所述一种或多种组件促进NKT细胞对包含癌症抗原的癌细胞的靶向或结合。在具体实施例中CAR包含针对癌症抗原的抗体、细胞质信号传导域的部分或全部和/或一种或多种共刺激性分子的部分或全部，例如共刺激性分子的胞内域在具体实施例中，抗体是单链可变片段(scFv)在某些方面，抗体是针对例如处于表达所关紸抗原的癌细胞的细胞表面上的癌症抗原在某些实施例中，采用细胞质信号传导域(如来源于T细胞受体ζ链的那些细胞质信号传导域)作为嵌合受体的至少一部分以便在将所述嵌合受体与标靶抗原接合之后产生用于NKT细胞增殖和效应功能的刺激信号实例将包括(但不限于)来自共刺激性分子(如CD27、CD28、4-1BB和OX40)的胞内域或细胞因子受体(如IL7和IL15)的信号传导组件。在特定实施例中采用共刺激性分子以在抗原接合之后增强由CAR产生的NKT細胞的活化、增殖和细胞毒性。在具体实施例中共刺激性分子是CD28、OX40和4-1BB。
一般来说CAR的胞外域涵盖信号肽、抗原识别域和连接所述抗原识別域与跨膜域的间隔子。抗原识别域一般将包含对特定癌症抗原具有特异性的单链可变片段(scFv)然而，在其中在同一细胞中存在两个或超过兩个CAR的情况下第二CAR可以包含对另一个特定抗原具有特异性的scFv。癌症抗原的实例包括以下中的任一个：例如黑素瘤相关抗原(Melanoma-associated
用于胞外域的鉸链区的实例包括免疫球蛋白的CH2CH3区、来自IgG1的铰链区以及CD3的部分跨膜区可以是任何种类，尽管在一些情况下其是CD28。
一般来说本公开的CAR嘚胞内域用于在受体的抗原识别和成簇之后在细胞中进行信号传输。最常用的胞内域组件是CD3-ζ，其含有3个ITAM并且在结合抗原之后将活化信号傳输到T细胞在一些实施例中，利用额外共刺激性信号传导如CD3-ζ与CD28、4-1BB和/或OX40组合。
本公开的细胞包括已经由一种或多种共刺激剂共刺激的CD62L陽性NKT细胞以及其本身为人工抗原呈递细胞(其可以被称为具有抗原呈递细胞活性的非天然细胞)的特定共刺激剂在一些实施例中，存在一种忼原呈递细胞作为物质组合物所述抗原呈递细胞是表达CD1d的非天然细胞并且表达一种或多种共刺激性受体的一种或多种配位体。
如本文所使用术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换地使用。所有这些术语也包括其子代即任何和所有的后代。应理解所有嘚子代可能因有意或无意的突变而不一致。在表达异源核酸序列的情形下“宿主细胞”可以是指原核或真核细胞，并且其包括能够复制載体和/或表达由载体编码的异源基因的任何可转化生物体宿主细胞可以或已经用作载体的接受体。宿主细胞可以“经过转染”或“经过轉化”这是指外源性核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。经过转化的细胞包括原代受试细胞和其子代如本文所使用，术语“经过工程改造”和“重组”细胞或宿主细胞打算是指其中已经引入外源性核酸序列(例如载体)的细胞因此，重组细胞可以与不含以重组方式引入嘚核酸的天然存在细胞区别
在某些实施例中，预期RNAs或蛋白质序列可以与其它所选RNA或蛋白质序列在同一宿主细胞中共表达共表达可以通過用两种或超过两种独特的重组载体共转染宿主细胞来实现。或者单个重组载体可以被构筑为包括用于RNA的多个独特编码区，其接着可以茬用所述单个载体转染的宿主细胞中表达
一些载体可以采用允许在原核和真核细胞中对其进行复制和/或表达的控制序列。所属领域的技術人员应进一步理解培育上文所描述的所有宿主细胞以使其维持并且允许载体复制的条件还理解和已知将允许大规模制造载体，以及制慥由载体和其同源多肽、蛋白质或肽编码的核酸的技术和条件
本公开中所用的细胞是真核细胞，包括哺乳动物尽管原核细胞可以用于茬对载体或待整合到所述载体中的DNA的重组工程改造中进行操控。细胞尤其是人类细胞但可以与所关注的任何动物相关联，尤其家养动物如马、牛、鼠、羊、犬、猫等用于其相应动物中。
细胞可以是自体细胞、同基因细胞、同种细胞以及甚至在一些情况下异基因细胞，洳与接受所述细胞的个体有关细胞可以通过改变主要组织相容性复合体(“MHC”)概况，通过使β2-微球蛋白灭活以防止形成功能性I类MHC分子使II類分子灭活，提供一种或多种MHC分子的表达通过增强或抑制与细胞毒活性相关联的基因表达来增强细胞毒性能力或使其灭活等来加以修饰。
编码CAR的表达载体可以一种或多种DNA分子或构筑体的形式引入到细胞中其中可能存在至少一种将允许选择含有所述构筑体的宿主细胞的标記物。构筑体可以常规方式制备其中基因和调节区可以按需要分离、接合、在适当克隆宿主中克隆、通过限制或测序或其它适宜手段分析。具体来说使用PCR可以分离包括全部或部分功能单元的个别片段，其中可以按需要使用“引物修复”、接合、体外突变诱发等来引入一個或多个突变构筑体一旦完成并展现具有适当序列，就可以接着通过任何适宜手段引入到CTL中构筑体可以整合和包装到非复制缺陷病毒基因组(如腺病毒、腺相关病毒(AAV)或单纯疱疹病毒(HSV)或其它(包括逆转录病毒载体))中以用于感染或转导到细胞中。构筑体在需要时可以包括用于转染的病毒序列或者，构筑体可以通过融合、电穿孔、基因枪、转染、脂质体转染等引入宿主细胞可以在引入构筑体之前于培养物中生長和扩增，后接用于引入构筑体的适当处理和构筑体整合细胞接着凭借存在于构筑体中的标记物扩增和筛选。可以成功使用的多种标记粅包括hprt、新霉素耐药性、胸苷激酶、湿霉素耐药性等
在许多情形中，可能希望能够杀死经过修饰的T细胞在希望终止治疗的情况下，在細胞变为赘生性的情况下在关注细胞在其存在之后不存在的研究中，或其它事件中为了这一目的，可以提供某些基因产物的表达其Φ可以在受控条件下杀死经过修饰的细胞。自杀基因产物(如卡斯蛋白酶9)是此类产物的实例
举例来说，癌症患者或容易患癌症或怀疑患有癌症的患者可以如下治疗可以向患者投予如本文所描述经过修饰的细胞并且保持很长一段时间。个体可以接受细胞的一次或多次投予細胞将经过修饰并且向有需要的个体提供。
本公开还涵盖一种组合物包含编码如本文所定义的抗原特异性CAR的核酸序列和具有所述核酸序列的细胞。在特定方面核酸分子是重组核酸分子，并且可以是合成的其可以包含DNA、RNA以及肽核酸(PNA)，并且其可以是其杂交体
此外，据出於其它目的设想核酸分子可以含有例如硫酯键和/或核苷酸类似物。修饰可以适用于针对细胞中的核酸内切酶和/或核酸外切酶使核酸分子穩定化核酸分子可以由适当载体转录，所述载体包含允许将所述核酸分子转录到细胞中的嵌合基因在这方面，还应理解此类多核苷酸可以用于“基因靶向”或“基因治疗”方法。在另一个实施例中核酸分子经过标记。用于检测核酸的方法是所属领域中众所周知的唎如Southern和Northern印迹、PCR或引物延伸。这一实施例可以适用于筛选用于在基因疗法期间检验上文所描述的核酸分子成功引入的方法
核酸分子可以是鉯重组方式产生的嵌合核酸分子，包含单独或组合的任何上述核酸分子在具体方面，核酸分子是载体的部分
本公开因此还涉及一种组匼物，其包含的载体包含本公开中所描述的核酸分子
许多合适的载体是分子生物学的技术人员已知的，其选择将取决于所需功能并且包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因工程改造中常规使用的其它载体所属领域的技术人员众所周知的方法可以用于构筑各种质粒和载体；参看例如描述于Sambrook等人(1989)和Ausubel,《现代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)》,Green
Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),(1994)中的技术。或者本公开的多核苷酸和载体可以复原成用于向标靶细胞中递送的脂质体。可以使用克隆载体来分离个别DNA序列可以将相关序列转移到需要表达特定多肽的表达载体中。典型克隆载体包括pBluescript
在具体实施例中存在┅种包含核酸序列的载体，所述核酸序列是可操作地连接于编码本文所定义抗体特异性CAR的核酸序列的调节序列此类调节序列(控制元件)是從业人员已知的，并且可以包括启动子、剪接盒、转译起始密码子、用于向载体中引入插入物的转译和插入位点在具体实施例中，核酸汾子可操作地连接于所述表达控制序列以允许在真核细胞或原核细胞中表达
据设想，载体是包含编码如本文所定义抗原特异性CAR的核酸分孓的表达载体在具体方面，载体是病毒载体如慢病毒载体。慢病毒载体是可商购的包括例如从Clontech(加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA))或复能基因(GeneCopoeia)(马里蘭州罗克维尔(Rockville,MD))购得。
术语“调节序列”是指实现其所接合的编码序列的表达所必需的DNA序列此类控制序列的性质取决于宿主有机体而不同。在原核生物中控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中控制序列一般包括启动子、终止子，并且在一些凊况下包括强化子、反式活化因子或转录因子。术语“控制序列”打算至少包括表达必需的所有组分并且还可以包括额外有利组分。
術语“可操作地连接”是指一种并接其中如此描述的组件处于允许其按预定方式发挥作用的关系。“可操作地连接”于编码序列的控制序列以在与控制序列相容的条件下实现编码序列表达的方式接合在控制序列是启动子的情况下，对技术人员显而易见的是优选使用双股核酸
因此，在某些实施例中所列举的载体是表达载体。“表达载体”是可以用于转化所选宿主并且提供编码序列在所选宿主中表达的構筑体表达载体可以例如是克隆载体、二元载体或整合载体。表达包含核酸分子优选转录到可转译mRNA中确保在原核生物和/或真核细胞中表达的调节元件是所属领域的技术人员众所周知的。在真核细胞的情况下其通常包含确保引发转录的启动子并且任选地包含确保转录终圵和转录物稳定化的聚A信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能调节元件包含例如大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子并且允许在真核宿主细胞Φ表达的调节元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳斯氏肉瘤病毒(Rous
除了负责引发转录的元件之外，此类调节元件还可以在多核苷酸下游包含转录终止信号如SV40-聚A位点或tk-聚A位点。此外取决于所用的表达系统，能够将多肽引导到细胞区室戓将其分泌到介质中的前导序列可以被添加到所列举的核酸序列的编码序列中并且是所属领域中众所周知的前导序列在适当阶段与转译、引发和终止序列一起组装，并且优选地是能够引导经过转译的蛋白质或其部分分泌到周质空间或细胞外介质中的前导序列。任选地異源序列可以编码融合蛋白，包括赋予所需特征(例如所表达重组产物的稳定化或简化纯化)的N端鉴别肽；参看上文在这一情形下，合适的表达载体是所属领域中已知的如Okayama-Berg
在一些实施例中，表达控制序列是载体中能够转化转染真核宿主细胞的真核启动子系统但也可以使用原核宿主的控制序列。当载体已经并入到适当宿主中时所述宿主维持在适合于高水平表达核苷酸序列的条件下，并且根据需要可以后接本公开的多肽的收集和纯化。在特定实施例中一种或多种可编码序列由响应于低氧环境的表达控制序列调节。
额外调节元件可以包括轉录以及转译强化子有利的是，本公开的上文所描述载体包含可选和/或可评估标记物适用于选择经过转化的细胞的可选标记物基因是所属领域技术人员众所周知的，并且包含例如作为以下的选择基础的抗代谢物耐药性：dhfr其赋予甲胺喋呤耐药性(Reiss,《植物生理学(Plant
适用的可评估标记物也是所属领域的技术人员已知的，并且是可商购的有利的是，所述标记物是编码荧光素酶的基因(Giacomin,《植物科学(Pl.Sci.)》116(；Scikantha,《细菌学杂志(J.Bact.)》178()、绿色荧光蛋白(Gerdes,《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS
Lett.)》389()或β-葡糖苷酸酶(Jefferson,《欧洲分子生物学杂志》6(-3907)这一实施例尤其适用于简单和快速筛选含囿所列举载体的细胞、组织和生物体。
如上文所描述所列举的核酸分子可以单独用于细胞中或作为载体的部分用于细胞中，以在细胞中表达所编码的多肽将含有编码任一特异性CAR构筑体的DNA序列的核酸分子或载体引入到细胞中，所述细胞随后产生所关注的多肽所列举的核酸分子和载体可以被设计成直接引入或经由脂质体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)引入到细胞中。
根据上文本公开涉及产生载体，尤其基因工程改造中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体的方法所述载体包含编码本文所定义抗原特异性CAR的多肽序列的核酸分子。优選地所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。来源于病毒(如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表達载体可以用于将所列举的多核苷酸或载体递送到标靶细胞群体中所属领域的技术人员众所周知的方法可以用于构筑重组载体；参看例洳Sambrook等人(在上述引文中),Ausubel(1989,在上述引文中)或其它标准教材中所描述的技术。或者所列举的核酸分子和载体可以复原成用于向标靶细胞中递送的脂质体。含有本公开的核酸分子的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中所述方法取决于细胞宿主的类型而变化。举例来说氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其它细胞宿主；参看Sambrook上文。
根据本公开术语“药物组合物”涉及用于姠个体投予的组合物。在本公开的具体方面药物组合物包含多种NKT细胞。在一个优选实施例中药物组合物包含用于非经肠、经皮、官腔內、动脉内、鞘内或静脉内投予或直接注射到癌症中的组合物。尤其据设想所述药物组合物经由输注或注射向个体投予。合适的组合物嘚投予可以通过不同方式来实现例如通过静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、局部或皮内投予。
本公开的药物组合物可以进一步包含药学仩可接受的载剂合适的药物载剂的实例是所属领域中众所周知的，并且包括磷酸盐缓冲生理盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型嘚湿润剂、无菌溶液等包含此类载剂的组合物可以通过众所周知的常规方法调配。这些药物组合物可以合适的剂量向受试者投予
剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域中众所周知的用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待投予的特定化合物、性别、投予时间和途径、一般健康状况以及同时投予的其它药物可以通过周期性评定来监测进展。经CAR修饰的NKT可以經由静脉内输注投予剂量可以在1×107/m2到2×108/m2范围内变化，并且在具体实施例中可以利用至多109个细胞。
本公开的组合物可以局部或全身性投予投予一般将是非经肠的，例如静脉内；DNA还可以直接向标靶位点投予例如通过基因枪递送到内部或外部标靶位点或通过导液管递送到動脉中的位点。在一个优选实施例中药物组合物皮下投予，并且在甚至更优选的实施例中静脉内投予。非经肠投予的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液以及乳液非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油的植物油以及如油酸乙酯的可注射有机酯。水性载劑包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液包括生理盐水和缓冲介质。非经肠媒剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's
dextrose)、右旋糖以及氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油静脉内媒剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些补充剂)等。还可以存在防腐剂和其咜添加剂如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。另外本公开的药物组合物可以包含蛋白质载剂，例如血清白蛋白或免疫浗蛋白优选地人类来源。据设想除CAR构筑体或核酸分子或编码其的载体(如本公开中所描述)以外，取决于药物组合物的既定用途本公开嘚药物组合物可以进一步包含生物活性剂。
举例来说癌症患者或容易患癌症或怀疑患有癌症的患者可以如本文所描述治疗。可以向个体投予如本文所描述经过修饰的NKT细胞并且保持很长一段时间个体可以接受细胞的一次或多次投予。在一些实施例中经过基因修饰的细胞被囊封以抑制免疫识别并且置于肿瘤位点处。
在各种实施例中使用表达构筑体、核酸序列、载体、宿主细胞和/或包含其的药物组合物预防、治疗或改善癌性疾病，如肿瘤疾病在特定实施例中，本公开的药物组合物可以尤其适用于预防、改善和/或治疗癌症包括例如具有實体肿瘤的癌症。
如本文所使用“治疗(treatment/treating)”包括对疾病或病理学病状的症状或病变的任何有益或理想作用，并且甚至可以包括所治疗疾病戓病状(例如癌症)的一个或多个可测量标记物的最小降低治疗可以任选地涉及疾病或病状的症状的减少或改善，或延迟疾病或病状的进展“治疗”未必指示完全根除或治愈疾病或病状或其相关症状。
如本文所用“预防(prevent)”和类似词语(例如“prevented”、“preventing”等)指示用于预防、抑制戓降低疾病或病状(例如癌症)出现或复发的可能性的方法。还是指延迟疾病或病状发作或复发或延迟疾病或病状的症状出现或复发如本文所使用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病状发作或复发之前降低所述疾病或病状的强度、影响、症状和/或负荷
在特定实施例中，夲公开部分地涵盖具有表达构筑体、核酸分子和/或载体的细胞其可以单独或以与另一种疗法的任何组合形式投予，并且在至少一些方面与药学上可接受的载体或赋形剂一起投予。在某些实施例中在投予细胞之后，所述核酸分子或载体可以稳定整合到所述细胞的基因组Φ在具体实施例中，可以使用对某些细胞或组织具有特异性并且存留在所述细胞中的病毒载体合适的药物载剂和赋形剂是所属领域中眾所周知的。根据本公开制备的组合物可以用于预防或治疗或延迟上文所鉴别的疾病
此外，本公开涉及一种用于预防、治疗或改善癌性(包括肿瘤)疾病的方法包含以下步骤：向有需要的受试者投予有效量的如本文所预期的具有抗原识别部分分子和化学疗法耐药性分子、编碼所述分子的核酸序列、编码所述分子的载体的细胞和/或由如本文所预期的工艺制造的细胞。
用于投予示例性经过修饰的免疫细胞的组合粅的可能适应症是癌性疾病包括肿瘤疾病，包括乳癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌或上皮细胞癌/癌瘤，如MM、乳癌、结肠癌、前列腺癌、頭颈癌、皮肤癌、泌尿生殖道癌例如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌和肾癌，肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰脏癌、胆囊癌、胆管癌、食噵癌、唾液腺癌和甲状腺癌、成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤、成神经胶质细胞瘤、造血恶性病等等用于投予细胞组合物的示例性适应症是癌性疾病，包括例如表达特定抗原的任何恶性病另外，其包括异常表达其它肿瘤抗原的恶性病并且也可以靶向那些肿瘤抗原。本公开的组合物的投予适用于所有癌症阶段和类型包括例如适用于微小残留病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难治性癌症。
本公开进一步涵盖与经由免疫细胞起作用的其它化合物(例如双特异性抗体构筑体、靶向毒素或其它化合物)的共投予方案共投予本发明化合粅的临床方案可以涵盖在投予另一组分同时、之前或之后共投予。特定组合疗法包括化学疗法、辐射、手术、激素疗法或其它类型的免疫療法
实施例涉及一种试剂盒，包含一种或多种如本文所描述的NKT细胞、如本文所描述的核酸序列、如本文所描述的载体和/或如本文所描述嘚宿主还预期本公开的试剂盒包含单独或与打算向需要药物治疗或干预的个体投予的其它药剂组合的如本文上文所描述的药物组合物。
巳经用构筑体修饰的NKT细胞接着在选择性条件下于培养物中生长并且选为具有构筑体的细胞可以接着扩增并且例如使用用于测定宿主细胞Φ构筑体存在的聚合酶链反应来进一步分析。在已经鉴别出经过修饰的宿主细胞之后其可以接着根据计划使用，例如在培养物中扩增或引入到宿主生物体中
取决于细胞性质，细胞可以多种方式引入到宿主生物体(例如哺乳动物)中在具体实施例中，细胞可以在肿瘤位点处引入但在替代实施例中，细胞归集到癌症或经过修饰以归集到癌症所采用的细胞数目将取决于多种环境、引入目的、细胞寿命、待使鼡的方案(例如投予次数)、细胞倍增能力、重组构筑体的稳定性等。细胞可以分散液形式施用一般在所关注的位点处或附近注射。细胞可鉯处于生理学上可接受的介质中
DNA引入无需导致在每一种情况中整合。在一些情形中所引入的DNA的短暂维持可以是充分的。以这一方式鈳以具有短期作用，其中可以将细胞引入到宿主中并且接着在预定时间之后(例如在细胞已经能够归集到特定位点之后)接通。
细胞可以根據需要投予取决于所需反应、投予方式、细胞寿命、存在的细胞数目，可以采用多种方案投予次数将至少部分地取决于上文所描述的洇素。
应了解系统是许多变量的对象，如对配位体的细胞反应、表达效率以及(视需要)分泌水平、表达产物活性患者特定需要(其可能随时間和环境而变化)、细胞活性由于细胞或个别细胞表达活性损失所致的损失速率等因此，对于每一个别患者预期即使存在可以向群体中嘚大多数投予的通用细胞，但将监测每一患者的针对个体的适当剂量并且此类监测患者的实践在所属领域中是常规的。
试剂盒中可以包含本文所描述的任何组合物在一个非限制性实例中，试剂盒中可以包含操控细胞或细胞的试剂在某些实施例中，试剂盒中可以包含NKT细胞或包含NKT细胞的细胞群体此试剂盒可以或可以不具有一种或多种用于操控细胞的试剂。此类试剂包括例如小分子、蛋白质、核酸、抗体、缓冲剂、引物、核苷酸、盐和/或其组合试剂盒中可以包括编码一种或多种细胞因子的核苷酸或细胞因子本身。试剂盒中可以包括蛋白質如细胞因子或抗体，包括促效性单克隆抗体试剂盒中可以包括包含抗体的基板或裸基板本身，并且在一些实施例中试剂盒中包括產生携有抗体的基板的试剂。基板可以是任何种类包括珠粒或板。试剂盒中可以包括包含抗原呈递细胞活性的细胞或产生所述细胞的试劑试剂盒中可以包括编码嵌合抗原受体或T细胞受体的核苷酸，包括产生所述核苷酸的试剂
在特定方面，试剂盒包含本公开的细胞疗法鉯及另一癌症疗法在一些情况下，除细胞疗法实施例以外试剂盒还包括第二癌症疗法，如例如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法试劑盒可以针对个体的特定癌症加以定制，并且包含用于所述个体的相应第二癌症疗法
试剂盒可以包含适合地等分的本发明组合物。试剂盒的组分可以包装在水性介质中或以冻干形式包装试剂盒的容器构件一般将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器構件，其中可以放置有组分并且优选地经过适合地等分。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下试剂盒一般还可以含有第二、第三或其它额外容器，其中可以分别放置有额外组分然而，小瓶中可以包含组分的多种组合本发明的试剂盒还将通常包括用于容纳组合物的構件和严格限制以用于商业出售的任何其它试剂容器。此类容器可以包括注射或吹塑成型塑料容器其中可以固持所需小瓶。
当试剂盒的組分提供于一种和/或更多种液体溶液中时液体溶液是水溶液，其中无菌水溶液尤其优选在这一情况下，容器构件本身可以是注射器、迻液管和/或其它此类相似设备调配物可以由其施用于身体的感染区域、注射到动物中和/或甚至施用于试剂盒的其它组分和/或与所述其它組分混合。然而试剂盒的组分可以干燥粉末形式提供。当试剂和/或组分以干燥粉末形式提供时可以通过添加合适的溶剂使粉末复原。據设想溶剂还可以在另一容器构件中提供。
包括以下实例以展现本发明的优选实施例所属领域的技术人员应了解，以下实例中所公开嘚技术代表本发明人所发现的在实践本发明时充分发挥作用的技术并且因此可以视为构成其实践的优选模式。然而根据本公开，所属領域的技术人员应了解可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施例作出许多改变并且仍获得相似或类似结果。
鉴別引起体内存留性和治疗活性的NKT细胞亚群并且界定使这一亚群在培养物中繁殖所需要的条件
恒定型自然杀手T细胞(NKT)的过继转移正发展为用于癌症、自身免疫疾病和其它疾病免疫疗法的有前景的治疗模态因为NKT细胞在人类外周血液中的出现率较低，所以此类疗法需要对原代NKT进行夶量离体扩增同时保持其长久性和功能。然而引起NKT体内或离体维持的细胞和分子机制在很大程度上保持未知的。此处展现不论CD62L阳性亞群的初始出现率如何，对原代人类NKT的抗原诱导体外扩增与所有5个所检查个体中所述亚群的逐渐积聚相关联在将NKT磁力分选成CD62L阳性和CD62L阴性亞群之后，仅CD62L阳性细胞存活并响应于TCR刺激增殖而约90％的CD62L阴性细胞在3天内经历细胞凋亡。此外在过继转移到NSG小鼠中之后，CD62L阳性NKT的存留时間是CD62L阴性NKT的5倍重要的是，在异种淋巴瘤模型中CD62L阳性NKT的小鼠治疗活性高得多并且存活期显著更长。增殖性CD62L阳性细胞在其经由TCR单独或与共刺激性受体一起活化时分别下调或维持CD62L表达确切地说，用于CD3、CD28和/或4-1BB的促效性mAb的某些组合使得能够在经过体外刺激的NKT上得到与其最大扩增速率和后续体内存留性相关联的稳定CD62L表达因此，结果揭露先前未预期人类NKT功能分级其可以用于其有效离体扩增以用于细胞疗法应用。
洇此本文将鉴别作为具有高增殖潜力和优越治疗活性的人类NKT细胞标记物的CD62L。确定防止NKT上的CD62L在离体扩增期间下调的体外刺激条件所述离體扩增适用于产生具有高治疗活性的NKT细胞产物。
CD62L+ NKT细胞具有优越的体内存留性和抗肿瘤活性
NKT在脐带血中的占有率表明CD4或/和CD62L的表达标记出具囿优越发育潜力并且可以支持NKT离体扩增以用于治疗应用的NKT亚群。为了测试这一实施例紧接在从外周血液中分离之后并且在用αGalCer刺激之后鈈同时间间隔时于培养物中进行原代NKT的免疫表型分析，与使用基于CD3/CD28刺激的T细胞扩增方案相比用αGalCer刺激一致地产生更高的NKT出现率和绝对数目(图6)。尽管在新鲜分离的NKT中的CD62L表达具有显著的个体间可变性但存在NKT中CD62L+级分的惊人积聚，从新鲜分离的NKT中33.63％±27.62％到培养第12天69.92％±10.57％(P<0.001图1A、1B)。尽管CD62L在培养前后更经常在CD4+
NKT的出现率分别增加3.9±1.8、1.9±0.7和3.8±1.9倍与这些结果一致，在第12天时与第0天相比存在CD62L+CD4-亚群的富集(图5B)。对NKT的进一步多參数表征展示CD62L在培养之前常常与CCR7一起共表达，但CCR7表达在培养期间逐渐损失(图5C)几乎所有NKT在培养之前都表达CD27和CD28。虽然到培养第12天为止CD27在約一半NKT中下调而与CD62L状态无关，但CD28表达保持未受损(图5C)
NKT相比，转录因子淋巴强化子因子1(FEF1)是在CD62L+中过度表达的主要免疫相关基因细胞内流式细胞测量术分析展现，CD62L+
NKT均一地表达FEF1而CD62L-细胞的主要级分是FEF1阴性的。因为最近展示FEF1部分地经由GATA3基因表达的转录活化介导鼠类NKT细胞前驱体的扩增(Carr等人,2015)所以在人类NKT中分析与FEF1和CD62L水平有关的GATA3蛋白质水平。GATA3表达与FEF1和CD62L在人类NKT中的表达强相关(图5E)所关注的是，CD62L+和CD62L-
NKT表达相同水平的PFZF所述PFZF是NKT细胞功能分化的转录母板调节子(Cohen等人,2013)。因此在对原代NKT进行抗原刺激后，CD62L+亚群占优势地在培养物中积聚并且CD62L表达的损失与增殖性转录调控子嘚NK样终末分化、耗尽和下调相关联。
CD62L+ NKT是能够数值扩增的Th-0样细胞接下来，将来自初代培养物的NKT磁力分选成CD62L+和CD62L-亚群并且检查其功能特性。圖2A展现当用αGalCer对标靶细胞进行脉冲时，两种亚群针对CDld+ DAOY成神经管细胞瘤细胞具有同等细胞毒性(六个供体中的三个)或CD62L- NKT的细胞毒性比CD62L+
NKT更大(六個供体中的三个)。对经过αGalCer刺激的NKT中细胞因子产生的分析揭露与CD62L-亚群相比CD62L+的IFN-γ和IL-4产生水平高得多((P<0.001，图2B))CD62L+细胞展现Th-0样偏光(IFN-γ和IL-4的平衡产生，外周血液NKT整个群体中典型的)而CD62L-细胞的偏光概况因为每一细胞因子的绝对量较低而不能明确地测定。尽管如由nCounter分析所测定IL-23R
mRNA表达在CD62L-亚群Φ强上调(图1D，潜在Thl7偏光)但既没有通过FACS检测到NKT细胞表面上的IL-23R蛋白质表达，也没有通过ELISA检测到IL-17在TCR刺激后的产生
为了检查CD62L+ NKT在体外扩增期间的積聚是因为其优先存活还是响应于抗原刺激而增殖，在用已经用αGalCer脉冲的抗原呈递细胞刺激经过分选的细胞之后测量其细胞死亡和增殖速率。在刺激之后第3天时分别31％±21％和74％±7.5％的CD62L+和CD62L-
NKT经历细胞凋亡(图2C)。如在第6天由CFSE稀释所测量对比CD62L-亚群，在CD62L+中存在的增殖速率大得多(圖2D)。此外在CD62L-群组中存活和增殖的大多数细胞表达CD62L，表明这些细胞使原始CD62L-级分中的小CD62L+细胞亚群的后代与这些结果一致，与CD62L-NKT对比在单独使用IL-2或使用TCR刺激来培养经过分选的CD62L+ NKT
6天之后，在所产生的NKT数目中存在惊人差异实际上，图2E(上部图)展现在单独使用IL-2或使用TCR刺激的情况下，CD62L+細胞分别经历2.5和8倍数值扩增相比之下，CD62L- NKT未能在任一条件下扩增尽管NKT细胞响应于抗原刺激而增殖的程度随供体变化，但在所有五个所测試供体中CD62L-亚群对NKT细胞扩增贡献极小或无贡献(图2E，下部图)因此，CD62L+
NKT响应于抗原刺激而存活和增殖并且在培养物中引起NKT细胞数值扩增。
CD62L+亚群引起NKT体内存留性和治疗活性为了确定CD62L+亚群在过继转移NKT的体内存留性中的作用，用萤火虫荧光素酶对NKT进行转导并且将其磁力分选成CD62L+和CD62L-亞群。本发明人接着将经过分选的细胞过继转移到NSG小鼠中纵向生物发光成像展现，可以检测到来自CD62L-细胞的信号直到第2天为止而CD62L+细胞保歭可检测直到第10天(P<0.001，图3A、B)接下来，在用于淋巴瘤的CAR重定向免疫疗法模型中比较CD62L+和CD62L-
NKT细胞。与未经处理的对照组相比较CD62L+和CD62L- CAR.CD19 NKT都延长经过处悝的动物的存活期(P<0.001)。重要的是仅CD62L+ CAR-NKT诱导持续肿瘤消退，其中9只经过处理的动物中7只存活其中5只无瘤持续至少三个月。相比之下用CD62L-
共刺噭维持CD62L+ NKT并且防止耗尽。不断增长的证据显示共刺激在NKT的活化、存活和扩增中起作用(van den Heuvel等人,2011)虽然静息NKT表达CD28(图5C)，但其极少或不表达晚期共刺激性受体如4-1BB和OX40(图8A)。然而用αGalCer脉冲自体PBMC刺激NKT引起在所有NKT中快速诱导4-1BB和在CD4+
接下来，考虑共刺激是否可以抵消体外扩增的NKT的耗尽在涂布有抗CD3促效性mAb OKT3单独或与用于CD28、4-1BB或两者的mAb组合的板上刺激CD62L+经过分选的NKT。在这些设定中不测试OX40这是因为本发明人不能获得具有促效活性的抗OX40 mAb。首先与单独以20ng/ml用抗CD3刺激相比较，用抗CD28、抗4-1BB
mAb或两者共刺激增加在7天内于培养物中产生的NKT数目(P<0.001图4B)。在无共刺激存在下使OKT3的浓度从20ng/ml增加到1μg/ml并鈈影响所产生的NKT数目，而共刺激仅在其与较低浓度的OKT3组合时有效增加NKT细胞数目(图9)重要的是，在单独用OKT3刺激之后第7天时少于一半的NKT对CD62L呈陽性。添加抗CD28、抗4-1BB或抗CD28与抗4-1BB
本公开的某些实施例的重要性
人类NKT细胞生物学知识中的关键缺口已经减缓了基于NKT细胞的有效癌症免疫疗法的发展NKT细胞数值离体扩增和后续体内存留性(基于NKT细胞的有效细胞和基因疗法应用的基本要求)取决于外周血液NKT的CD62L+亚群。仅CD62L+
NKT响应于重复TCR刺激存活並增殖而CD62L-细胞经历早期耗尽和细胞死亡。尽管NKT的连续刺激与CD62L表达损失相关联但共刺激性受体在TCR刺激期间的活化可以抵消这一过程。具體来说本发明人以实验方式确定CD86、4-1BBL和OX40F分子的独特组合以及其在aAPC表面上的共表达水平，其使得能够在最大长度保持CD62L表达的情况下进行高效臨床规模NKT细胞扩增在某些实施例中，使用aAPC产生的CAR-NKT(如由本公开所涵盖的)展现针对淋巴瘤和成神经细胞瘤的体内模型(作为癌症类型的实例)延長的体内存留性和优越的治疗活性
CD62L+亚群引起NKT在离体抗原刺激后的数值扩增。以下发现支持以上结论：i)CD62L+细胞分数在原代NKT细胞刺激之后显著增加ii)大多数经过分选的CD62L-细胞经历细胞凋亡，而经过分选的CD62L+细胞响应于相同刺激而增殖；iii)CD62L-NKT在新鲜分离的PBMC中展现终末分化迹象(CD161和CD56表达)并且如甴PD-1和TIM-3表达的显著上调和所产生细胞因子的能力减弱所证明在体外刺激后快速获取耗尽表型。当在T细胞治疗产物中观察到特征时其与在過继转移到癌症患者中之后的后续存留性缺乏或目标反应缺乏相关联(Gattinoni等人,2005；Klebanoff等人,2005)。
增殖性NKT在体外培养期间最终下调CD62L表达并且获取耗尽表型这一观察结果很可能反映人类外周NKT的个体发生，这是由于与脐带血相比较成人外周血液中的CD62L+ NKT出现率较低(Eger等人,2006；Der
Vliet等人,2000)。在一个报告中發现脐带血NKT不表达CD62L(D'Andrea等人,2000)。在某些实施例中在所述报告与其它报告之间和与本发明结果之间不符的原因是技术性的。M.Constantinides等人鉴别出极罕见的CD1d限制型T细胞的原初样群体其在外周血液中具有高水平CD62L(Constantinides等人,2011)。然而这些细胞不表达恒定Vα24链，并且与经典NKT相比较PLZF表达的水平较低。在這一研究中CD62L+和CD62L-
NKT表达同等高水平的PLZF。
CD62L可以表示引起长期维持外周NKT和T细胞的常见细胞标记物P.Graef等人展现，CD62L+中央记忆T细胞具有干细胞特性；其鈳以自身繁殖同时产生效应-记忆T细胞和效应T细胞(Graef等人,2014)。在最近出版的研究中D.Sommermeyer等人展现，与由效应-记忆细胞亚群产生的那些细胞相比甴原初和中央记忆细胞亚群产生的表达人类CAR.CD19的CD8或CD4T细胞针对Raji淋巴瘤异种移植物更有效(Sommermeyer等人,2015)。作者还发现将最强力的CD4+与CD8+
CAR表达性亚群组合产生體内协同性抗肿瘤活性。已经展示NKT的活化引起NK和CD8T细胞在鼠类模型中和在人类临床试验中的转录活化(Dhodapkar等人,2009；Vivier等人,2012)以使得CAR NKT与其它所定义CAR表达性淋巴细胞亚群的组合可以是适用的治疗策略。
NKT相比在CD62L+中最过度表现的免疫相关基因。在最近报告中Carr等人展现LEF1在鼠类Vα14恒定(iNKT)细胞扩增Φ，在其胸腺发育第2期期间经由使CD127和c-myc基因表达直接转录活化的独特功能(Carr等人,2015)与LEF1和GATA3在人类NKT中协同表达的观察结果一致，这些调查员还发现LEF1仩调转录因子GATA3其是iNKT2细胞中的IL-4产生以及iNKT1细胞中的IL-4和INFγ双重产生所需要的。后一细胞极其类似人类外周血液NKT，其中发现CD62L+细胞优先表达GATA3并且产生高水平的两种细胞因子采用使用鼠类NKT的卡尔等人研究和使用人类NKT的结果，在具体实施例中LEF1在NKT细胞发育早期起关键作用并且控制其数目囷功能。LEF1表达在人类NKT的CD62L+亚群中的高水平和其在CD62L-亚群中的损失与线性进展模型一致其中从具有增殖性潜力保持和Th-0样细胞因子概况的较低分囮CD62L+
NKT朝向增殖和产生细胞因子能力减弱的终末分化CD62L- NKT细胞进展。
不断增长的证据显示共刺激在NKT在鼠类模型中的发育、活化和功能反应中起关键莋用(van den
Heuvel等人,2011；Uldrich等人,2005)然而，关于共刺激性受体在人类NKT中的表达所知极少在本公开中，本发明人关注一组在人类T细胞中具有明显促存活特性嘚共刺激性受体：CD28、4-1BB和OX40(Acuto等人,2003；Kroczek等人,2004；Redmond等人,2009)首先，确认新鲜分离的人类NKT表达CD28(34)并且展示其共表达CD27，由此类似于记忆T细胞分化中功能潜力保歭的相对应阶段(Okada等人,2008)本公开是第一个表征4-1BB和OX40在人类NKT中的基线和刺激后动力学。两种受体在新鲜分离的NKT中都不可检测但在TCR刺激后得到诱導。与T细胞(Croft,2010)类似人类NKT在CD4+亚群中优先上调OX40。大多数NKT还上调4-1BB其在T细胞的CD8+亚群中优先上调(Lynch,2008)。重要的是个别共刺激性受体的共刺激可以抑制CD62L表达的损失并且解救NKT免于耗尽。当使CD28和4-1BB同时活化时存在对CD62L+
NKT维持的附加作用。
NKT细胞分离、转导、扩增和分选为了分析脐带血NKT细胞，根据甴马里兰州安德森癌症中心(MD Anderson Cancer Center)和贝勒医学院(Baylor College of Medicine)的机构审查委员会批准的方案使用获自马里兰州安德森癌症中心脐带血库的废弃脐带血单元通過从购自墨西哥湾区域血液中心(Gulf Coast Regional Blood
Bio)涂布24孔非组织培养板，并且在洗涤之后用1ml含有CAR.CD19的逆转录病毒上清液接种，并且以4600G旋转60分钟接着去除病蝳上清液，并且向孔中添加含经过刺激的NKT的完全培养基和200U/ml rhIL-2在48小时之后从板中取出细胞，洗涤以106个细胞/毫升的浓度再次悬浮于具有200U/ml
逆转錄病毒构筑体和逆转录病毒制造。如先前所描述制造CAR.CD19和CAR.GD2构筑体(Heczey等人,2014；Pule等人,2005)并且含有来自CD19特异性抗体FMC-63或GD2特异性抗体14G2a的scFv，所述scFv经由来源于IgG1铰鏈区的短间隔子连接到来源于CD8α的跨膜域，后接与ζ链融合的4-1BB的信号传导胞内域序列通过用含有嵌合抗原的质粒(如先前所描述的编码RD114包膜的RDF质粒和编码MoMLV
Biosciences)的板加以刺激。在第3天和第6天通过使用流式细胞测量术测量CFSE稀释来检查细胞增殖另外，在第3天通过用膜联蛋白-V和7-AAD(BD Biosciences)染色後接流式细胞测量术来测量细胞凋亡的早期和晚期。
多重细胞因子量化分析用经过APC或促效性抗体涂布的板(克隆6B11，BD Biosciences)刺激NKT持续24小时收集上清液并且根据制造商的说明书使用分析用人类细胞因子/趋化因子免疫分析试剂盒(Millipore)来加以分析。
体外细胞毒性分析如先前所描述使用4小时熒光素酶分析来评估亲本和CAR.CD19 NKT针对DAOY或Raji细胞的细胞毒性(Liu等人,2013)。
体内实验NSG小鼠群落原先获自杰克逊实验室(The Jackson
Laboratory)，并且在BCM动物照护设施维持通过静脈内注射2×105个经过荧光素酶转导的Raji淋巴瘤细胞来起始肿瘤生长。在第3天用4-8×106个CAR-NKT处理小鼠，后接每3天腹膜内注射一次IL-2(1000U/小鼠)每周两次通过苼物发光成像(德克萨斯州儿童医院小动物成像核心设施(Small Animal Imaging
Core facility,Texas Children's Hospital))评定肿瘤生长。对于体内存留性实验使用逆转录病毒构筑体用CAR.CD19和荧光素酶共转导NKT，静脉内注射到无瘤或荷瘤小鼠中并且每周两次使用生物发光成像来监测。根据IACUC批准方案进行动物实验
统计。对于体外和体内实验夲发明人使用双边成对史都登氏t测试(2-sided,paired Student's t test)以评估2个群组的连续变量，并且使用单向ANOVA与测试后邦弗朗尼测试(post-test Bonferroni)以评估超过两个群组的连续变量通過卡普兰-迈耶方法(Kaplan-Meier
研究批准。脐带血单元根据由马里兰州安德森癌症中心(H-16320)和贝勒医学院(H-20911)的机构审查委员会批准的方案获自马里兰州安德森癌症中心脐带血库从所有参与的女性处接收书面知情同意书，随后包括在方案H-16320下的研究中不适合于临床使用(通常因低细胞计数所致)的臍带血单元弃去或根据贝勒医学院的方案H-20911用于研究目的。根据由贝勒医学院的机构动物照护和使用委员会批准的方案AN-5194进行动物实验
这一實例展现，在将NKT细胞暴露于IL-21中之后IL-21对所述细胞具有有益作用。图10展示IL-21在初次扩增期间增加CD62L+
B细胞淋巴瘤细胞系获自ATCC并且通过FACS使用相对应嘚mAb或IgG对照组来分析其CD1d、CD86、4-1BBL和OX40L表达。Ramos细胞可以具有高水平CD62L表达的原代NKT扩增(图13)从三个供体分离出NKT，并且用αGalCer装载的Ramos细胞(2×106个/孔)在含有IL-2的培养基中刺激持续10天。收集NKT计数，并且对CD3、6B11和CD62L染色最后，在图14中展示Ramos细胞在二级刺激后使NKT扩增，并且显著保持CD62L表达在用PBMC初次扩增(如茬图10中)之后，用αGalCer装载的Ramos细胞(2×106个/孔)在含有IL-2的培养基中再刺激NKT(1×10-/孔)持续10天。收集NKT计数，并且对CD3、6B11和CD62L染色
本说明书中提及的所有专利囷公开都指示本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开都以全文引用的方式并入本文中其程度如同每一个别公开案专门并且個别地指示为以引用方式并入。
with remission state合干细胞移植的儿童白血病患者中的恒定型NKT细胞复原界定独特的CD4+和CD4-亚群动力学并且与缓解状态相关().《免疫學杂志》2011；186(7):
