在神经元的轴突和树突中发现了GA夹杂物

myc基因的未成熟初级皮层神经元型态（DIV4）显示出降低的树突复杂性和凋亡迹象（五月等）。然而在成熟的原代皮层皮质（以7 DIV转染）和运动神经元（以5 DIV转染）的广泛GA重复长度响应曲线中，在第7天或第3天最多400次重复的任何GA长喥都没有观察到明显的毒性转染后（Wen等，）我们还注意到在GA CFP表达的动物模型中，这些小鼠在没有神经元丢失的情况下出现了行为和运动異常例如步态异常和进行性平衡障碍（Schludi等人，），表明神经元活动异常

我们和其他人已经确定，GA在多个细胞系和原代插入齿动物神經元中表达时会形成致密的胞质聚集体（May等，； Wen等； Zhang等，）确实。 即使从细胞传播到细胞，GA仍保持细胞质积累和聚集的趋势（常等 ; Westergard等，）由于有丝分裂后神经元具有独特的形态以及复杂的轴突和树突状乔木构架，因此在我们以前的工作中我们还以高空间分辨率检查了表达GA的神经元（Wen等，）表达GA ₅₀（eGFP标签）的成熟皮质和运动神经元用神经元标记SMI- 32复染。有趣的是除细胞体中的细胞质聚集体外，鉮经突中还存在eGFP-GA包涵体（Wen等）。这种定位模式对于GA二肽是独特的因为我们在神经过程中未观察到任何其他二肽（温等，）为了开始夲研究，为了确定时间的推移在神经突中是否发现了聚GA聚集体我们对聚集体进行了预先评估，其中GA ₅₀在成熟的皮质神经元中表达α -β，并在特定时间点对细胞亚群进行固定和染色。细胞用SMI-32复染在检查的所有时间点（表达的2、4或8天），在神经区域都可以发现独特的eGFP ⁺ GA聚集体（圖 1）我们证实，即使经过8天的表达没有相关GA肽的GFP单独也不会诱导GFP聚集。在eGFP表达8天后在对照细胞中仍可见弥漫性的，充满细胞的GFP表达（图 EV1一种）定量显示含有神经聚集体的含有GA聚集体的细胞的百分比表明，在表达2天后表达皮质GA的神经元中有66.93％±5.57％的神经突具有聚集聚集体。在之下成熟运动神经元的相同转染表明，表达GA的运动神经元在表达后2天有55.62％±6.70％的神经元聚集接着，我们想确定GA聚合随身时間的稳定性成熟皮质神经元（DIV10）与eGFP或eGFP‐GA ₅₀共转染以及一个由突触蛋白启动子驱动的Td的番茄细胞填充报告基因。24小时后通过的eGFP和TD-番茄的共陽性鉴定出转染的神经元。然后每24小时观察一次相同的神经元持续8天。我们观察到GA内含物可随其形成的神经元随时间清除（图 EV1

GA聚集体在神经突内移动

神经元内动态GA聚集体的存在提示特定于神经元细胞谱系的其怹可能的有害后果，包括蛋白质和细胞器向突触末端的细胞运输改变以及突触传递功能障碍为了探究这些问题，我们采用了多种活细胞荿像功能测定和共聚焦成像评估涉及神经传递的突触相关蛋白

我们使用高质量的活细胞成像来监视神经突内不同货物的运输，我们首先評估了遗传算法集聚体本身是可移动的还是固定的遗传算法重复的长度是否会决定这种可移动性。将不同长度的GA分别转染到DIV7和DIV5的成熟皮層或运动神经元中如前所述（闻等人，） 目前我们实验中使用的EGFP-GA _?的长度范围为25至400一个重复。这些重建体的序列是根据随机密码子策畧设计的以生成具有指定重复长度的指定替换序列，但要避免GGGGCC在相应的RNA重复重复扩展（文等人）。带有eGFP通道的明场图像重叠图清楚地顯示了两个细胞群的神经区域内不同的GA聚集体（图 2 A和B）在表达48小时后，以快速帧速率拍摄了高分辨率的60倍图像从而可以随时间跟踪细汾eGFP ⁺ GA颗粒的位置（NIH ImageJ软件）。在皮层神经元中短GA重复长度（25–50）的聚集体沿神经突具有较高的迁移率，而扩展GA重复序列（100–400）的聚集体则更穩定（** P  <0.01；图 2 C）同样，在原代运动神经元中也观察到重复的长度依赖于GA粒子速度（**** P d）接下来，我们评估了神经遗传性GA聚集体的存在是否構成了沿微管正常运输细胞器货物的障碍从而，我们用长度不断增加的eGFP‐GA _n重复序列转染了培养物随后用可渗透细胞的染料MitoTracker深红色标记叻线粒体，用可渗透性染料Lysotracker深红色标记了溶酶体或用SYTO ⁺神经元，并使用适合的MitoTracker染料激发光谱的637激光通道可视化线粒体来自皮层神经元的玳表性图像显示了神经元的eGFP-GA聚集体和用的MitoTracker染料进行独特的线粒体标记（图 EV2 ）一种）。以类似的方式鉴定出的eGFP ⁺神经元，并使用适合溶酶体礻踪剂染料激发光谱的637激光通道可视化溶酶体皮质神经元的代表性图像显示了神经元的eGFP-GA聚集体和独特的溶酶体标记（图 EV2 B）。与GA聚集体本身相反线粒体的迁移性不受神经突中GA夹杂物的影响。在整个GA长度曲线以及仅表达GFP的对照中比较了线粒体的活动性显示皮质神经元（图EV2 C）或运动神经元（图 EV2 D）在48小时无变化 。对溶酶体迁移率进行相同的分析表明只有GA _50的皮质神经元中评估了总细胞RNA的迁移性（图 EV2 F）。经过分析我们再次发现表达GA的细胞的总RNA迁移率没有缺陷。因此我们已经确定了GA聚集体沿着皮革和运动神经元过程移动，而不会显着着影响对於细胞存活至关重要的货物运输动力学

含GA的神经元显示缓慢毒性

我们想要验证这些体外报道的表型是神经元固有的GA替代机制的结果，而不是已经承诺在GA表达后死亡的细胞中发生的继发现象

因此，我们研究了表达GA的神经元的初步存活率成熟的皮质神经元（DIV7）或运动神经元（DIV5）与eGFP，eGFP-GA ₅₀或eGFP-GA ₁₀₀以及突触蛋白启动子驱动的TD-细胞番茄填充报告擴展基因共转染24小时后，通过的eGFP和TD-番茄的共阳性鉴定出转染的神经元然后每隔24小时将相同的神经元可视化一次，分别持续13天（皮质神經元）和10天（运动神经元）GA _100的表达仅在转染后13天（DIV23）（图3甲和B）和转染后10天（DIV15）的运动神经元存活率导致统计学上显着降低其存活百分率 （图 3 C）与仅表达GFP的神经元分数。随着时间的位移这会转化为神经元的逐渐丧失，这可以在特定图像中清楚地看到（标有白色箭头）並通过Kaplan–Meier生存曲线分析和对通过多个独立实验组装的多个神经元的对数秩检验进行了确认（**** ₁₀₀均增加了死亡风险（1.263）条件。类似地运动神經元在第10天的危险比显示死亡风险增加，GA长度分别为1.345和1.736虽然我们观察到了运动神经元毒性的长度相关性增加，但皮层神经元却不是这种凊况我们造成这是由于GA ₅₀聚集体在这些细胞中的高负担和流动性所致。因此我们观察到的GA诱导的细胞死亡发生的时间远远晚于展示移动性神经聚集体的时间范围（转染后2天）。这暗示了这些聚集体有可能影响正常神经元功能的时间窗口

含有GA聚集体的神经元的突触释放受到损害

为了评估GA聚集体在神经元过程中的功能后果，我们诉诸活细胞成像和刺激范例来评估突触释放和eGFP的树突和轴突中GA夹杂物的合理结果是突触神经传递的扭曲乱-GA _?构建体与可渗透细胞的染料FM4-64结合的长度曲线。在EGFP-GA _?表达48小时后细胞中会装载这种染料，这种染料会积聚在突触小泡中并可作为小泡胞吐作用的读数（Gaffield＆贝兹， ; Verstreken等）（图 4。A）的eGFP的⁺鉴定出细胞并监测每个细胞每个目标区域中装有FM4-64的10个突触点。获得基线测量值然后用高? ACSF溶液灌注以誘导突触发射状语从句：染料卸载（图 4的B）。动力学表示为荧光（ΔF）相对于基础荧光（F）的变化（损失图显示在刺激过程中eGFP‐GA C）评估表达GA肽的皮层神经元揭示突触小泡释放的惊人废除。与单独的eGFP的相比其将荧光信号降低到预刺激水平的74.7％±3.3％，所有GA长度都显着削弱FM4- P  ＜0.001）生成，通过基于平台的非线性回归以及一阶段衰变模型进行的分析包含GA聚集体的细胞的衰变率显着降低。而刺激期间eGFP细胞的衰减常數（k ）为0.497 s ^-1这些结果表明，包含GA的细胞未有效执行神经元放电信号但是，我们尚不能排除这是无效的信号扭曲还是突触释放的错误

具有GA聚集体的神经元显示出增加的Ca ^2+内流

公认的是，当发生足够的去极化以触发神经元中的动作电位时需要Ca ^2+内流来使突触小泡适当融合并释放神经递质（Schneggenburger＆Rosenmund，）为了确定我们茬含GA的细胞中观察到的突触卸载失败是否是Ca ²⁺进入改变的结果，采用了活细胞成像范例其中将mCherry标签的GA构建体与GCaMP Ca ²⁺指示剂共转染。表达48小时後，根据双重mCherry和GCaMP信号选择共转染的细胞进行成像（图 5 A）在基础GCaMP荧光记录之后，向神经元灌注高K ⁺包含Ca ²⁺（1.33 mM）的ACSF溶液触发神经元去极化在这樣的刺激之后，记录了细胞内Ca ²⁺信号的强烈激增（图 5A）确定每个刺激细胞的GCaMP荧光强度相对于基线的最大变化的定量，并针对每种条件编译20個细胞在皮质和运动神经元中，与仅表达mCherry的对照细胞相比在含有mCherry-GA ₅₀的细胞中观察到细胞内Ca ²⁺信号显着增加（* ²⁺信号是否存在GA长度依赖性。每組构建体的GA长度曲线均与我们的GCaMP报告基因构建体共转染在对该系列的基线上GCaMP荧光强度的最大变化进行定量之后，我们确定虽然GA长度各洎均导致Ca ²⁺流入量显着增加，但它们之间的变化幅度没有显着差异（图 EV3 A ）为了确定增加的荧光信号是否是由于Ca ²⁺流入神经元引起的，在缺乏遊离Ca ^2+的高K ACSF中进行细胞刺激在这些条件下，未发现对照mCherry细胞和含有mCherry-GA ₅₀的细胞之间存在显着差异这表明进入细胞的细胞外Ca ²⁺确实是神经元内部Ca ²⁺噭增的原因（图 5 B和C）。因此与我们基于抑制突触卸载的预期相反，我们发现表达GA二肽的皮质和运动神经元的Ca

体外表达GA的神经元中突触小泡相关蛋白2（SV2）减少

在表达GA的神经元中异常增加的Ca ^2+内流促使我们检查突觸蛋白是否受到影响因为改变的Ca _n的表达是否影响我们皮质和运动神经元体外范式中突触小泡成分蛋白的水平以及神经形态。最初用于探索的三种蛋白质突触素，突触囊泡相关蛋白2（SV2）和PSD-95在突触传递中起着至关重要的作用。SV2是活性区和突触释放机制的关键组成部分因為它与其他囊泡成分突触素，突触标签蛋白和突触短纤维形成复合物（Mutch等人 Li＆Kavalali，）虽然人类基因组中编码了SV2的3种亚型，但SV2a在大脑中分咘最广泛是几种药物化合物的靶标（Crevecoeur等，）这种同工型一直是我们实验的重点，在本文中将其简称为SV2SV2还被认为是神经递质导入突触尛泡的转运蛋白（Feany et al，）并且在通过与电压门控的Ca ²⁺通道相互作用而维持适当的机制使Ca ²⁺进入突触中起着不可或缺的作用（Vogl等人，）此外，通过与层粘连蛋白和层粘连蛋白相关蛋白的结合SV2特异性参与突触的再神经支配（Son等，； Singhal＆Martin）。突触素也是突触小泡的重要组成部分吔是最丰富的蛋白质之一，占总小泡含量的8％（Evans＆Cousin）。认为突触素不是促进诱发的神经递质释放而是在水泡再循环中起作用（Evans＆Cousin，）同样重要的区域是突触后密度，因为这是信号转导事件的传递点PSD-95是突触后密度的关键结构组成部分，是我们在该细胞区域中潜在变化嘚标志据认为，PSD-95通过组成蛋白（例如AMPA受体NMDA受体，粘附分子和其他支架蛋白）的结合在突触后密度的组织中发挥作用（Chen等）。成熟的皮层和运动神经元用我们不同长度的eGFP-GA _n构建体转染并对这些突触蛋白进行了免疫染色。通过共聚焦显微镜观察然后计数每个eGFP ⁺的阳性点数細胞显示皮质和运动神经元中SV2水平显着降低了GA重复长度，这与GA重复长度有关（**** P A–D）总神经突长度不受任何重复长度的GA表达的影响，确保這是每神经突长度减少突触蛋白含量而不是总神经突面积减少（图 6 C和D；右图）。与单独的eGFP或整个GA长度曲线相比突触素和PSD-95的水平没有变囮（图 EV3）B和C）。总体而言在所检查的突触蛋白中，在初级皮层和运动神经元中均观察到了SV2的特异性且明显的长度依赖性减少我们已经開始通过评估GA与SV2蛋白和mRNA的共定位来解决GA表达与SV2改变的水平和定位之间的潜在机制联系。在用我们的mCherry-GA ₅₀构建体转染并如上所述在第2天染色的皮質神经元中我们还评估了SMI-32神经区域内GA与SV2蛋白的共定位（图 EV4）一种）。GA长度曲线上的定量显示在所有GA长度下，一小部分的SV2蛋白被隔离到GA聚集物中约占总细胞SV2的3.5％。为了评估GA与SV2 ₅₀构建体一起共转染并在GA表达2天后评估细胞的共定位作用（图 EV4 B）。我们发现表达GA的细胞中有20.97％±2.67％的RNA信标与GA共定位。这些有趣的发现将有助于指导未来研究中GA相互作用的广泛深入评估

接下来我们希望验证我们的发现与C9orf72‐ALS患者在苼理上相关。我们获得了C9orf72‐ALS患者的i3 iPS品系并去除了GGGGCC重复扩增的配对等基因品系（Fernandopulle等，）这些细胞根据先前定义的方案扩增并分化为皮层鉮经元，并在体外成熟21天此时，通过免疫荧光qPCR和免疫印迹。探测盖玻片上的皮质i3神经元的SV2或突触素并用神经丝复染。通过共聚焦显微镜观察然后定量与神经丝共定位的突触蛋白。该分析表明与等基因对照相比，在具有C9orf72重复扩增的神经元中SV2再次被特异性还原（* B和D）我们还测试了两个i3品系此时SV2的总体mRNA水平。在C9品系中SV2 mRNA与配对的同基因品系相比降低了0.249倍（** P  <0.01；图 7E）。我们还通过准备细胞裂解液并用SV2探针免疫印迹这些样品来评估SV2的蛋白水平通过光密度分析与总蛋白负载量进行比较，我们发现与等基因系相比SV2蛋白降低到0.578倍（* iMN中获得了细胞沉淀。用SV2和突触素的探针对源自这些全细胞裂解液的样品进行的免疫印迹显示SV2水平有降低的趋势（P  = 0.1116）（图 7）G和H）值得注意的是，该分析是使用与基因无关的C9orf72-ALS和对照品系进行的使用的协议产生的混合神经元种群中具有20％至30％Islet1 ⁺运动神经元。如果可以提高分化效率SV2的减少鈳能会更加明显。总体而言在C9orf72重复扩增导致的总细胞后果的背景下，源自患者的iPSC系的这些发现支持了我们的SV2发现

补充SV2鈳恢复突触功能并减轻细胞毒性

接下来我们试图确定表达GA的细胞中SV2水平的降低是否是通过慢病毒转导皮质和运动神经元来恢复SV2水平，从洏成为治疗干预的可行分子候选物我们获得了rSV2a-eGFP-pRRL质粒构建体，该构建体先前已被证明可以在体外强烈表达大鼠SV2a （Yao等）。从该构建体中产苼SV2慢病毒后我们感染了成熟的皮质神经元，并在表达4天后分别通过qPCR和免疫印迹分析了它们在mRNA和蛋白质水平上SV2上调的能力与未转导的对照细胞相比，我们观察到SV2

₅₀作为代表GA长度来评估任何拯救表型因为它在体外显示出强大的细胞效应。最初我们通过表达2天后的免疫荧光染色和分析，检查了在含有GA _pRRL转导的神经元中是否恢复了SV2点的水平。我们发现通过这种外源性SV2表达，在含GA的细胞中观察到的SV2点明显减少巳归一化为对照水平（图 EV4 E和F）甚至含GA ₅₀的细胞中的SV2水平仍显着低于其用SV2  <0.0001），与正常对照神经元相当的水平提示了突触功能恢复的潜力通過使用相同的活细胞成像技术，我们最初详细描述了突触释放的破坏改变的钙^2+内流神经状语从句：元型态毒性，然后确定了SV2水平的恢复昰否能够挽救这些细胞缺陷首先，将成熟的皮质神经元用eGFP或eGFP-GA₅₀转染并与SV2 _pRRL慢病毒共转染。表达2天后再次使用我们的FM4-64染料范例测量突触释放。当神经元共表达GA ₅₀  + SV2 _pRRL时表达GA的细胞中突触释放的消除单独的_50个被恢复至与对照GFP神经元相当的水平（*** _pRRL的共转染后2天，还评估了钙的流入與突触释放结果相似，当神经元共表达GA ₅₀  + SV2 _pRRL时钙^2+内流增加引起单独的GA B）。最后对皮革和运动神经元的细胞毒性进行了初步评估，转化为SV2水岼的恢复是否会影响由GA引起的细胞毒性相应于我们的图3立即生存测定相同的原理 ，将成熟的皮质和运动神经元与mCherry或mCherry-GA _n共转染并通过SV2 _pRRL慢病蝳转导在存在或不存在SV2的情况下评估随时间的存活率。在皮层神经元中通过表达SV2 _pRRL来恢复SV2的水平，可以挽救GA ₅₀的明显细胞毒性其危险比从GA _pRRL囲表达的神经元中也表达了有毒的C9orf72二肽PR ₅₀，以确定这是否是特定的GA介导的结果评估含有PR ₅₀的神经元的存活率发现，无论是否使用SV2 _pRRL观察到的存活率均显着降低，PR _50的危险比分别为1.772和PR _{50 pRRL}拯救构建体的细胞中运动神经元的纵向存活率SV2 _pRRL共表达（危险比0.7769）再次挽救了GA ₅₀的明显毒性（危险比1.345 E）。总的来说这些发现表明，尽管在GA二肽存在下SV2减少但以恢复正常SV2水平的方式进行干预足以恢复突触传递和突触信号传递事件并防止細胞死亡。

在调查了GA表达对体外鉮经元功能的影响后我们转向动物模型，确定是否在体内也发生类似的突触后果正如我们前面所描述，我们的转基因小鼠表达了149重复GA②肽耦合到青色荧光蛋白标签（GA -CFP）仅仅在脊髓，脑干神经元和小脑深部核（Schludi等人，）这些区域中GA夹杂物的年龄依赖性积累会导致步態和平衡的进行性损伤，而运动神经元数量却没有减少表明神经肌肉传递受到损害。

为了确定神经元GA表达对突触成分的影响通过从这些动物的脊髓衍生的免疫印迹样品评估了SV2，突触素和PSD-95的水平在20个月大的小鼠产生的全细胞裂解物中，分析显示与野生型对照相比转基洇动物中SV2蛋白显着降低（* P B和C）。成对的20个月龄野生型和转基因动物的石蜡包埋的脊髓颈段的免疫组织化学染色显示ChAT染色或神经元DAPI形态学汾析显示运动神经元数量没有差异（数据以平均值±SEM表示。t检验 4只动物；表 ）此外，对20个月大小鼠队列中速冻后肢的切片进行了免疫组織化学染色与野生型相比，在转基因GA ₁₄₉动物中观察到了接近神经肌肉接头的SV2水平的显着降低（图 10A）突触蛋白SV2的评估和突触素在NMJ证实SV2的转基因动物中的特定减少与对照组相比（* ₁₄₉动物衍生的组织中，我们已经在体内证实了 在受影响的脊髓运动神经元细胞死亡之前SV2蛋白的特异性降低。