新型冠状病毒是亚种还是单一物种

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-01-22 13:56 标签：

肺炎是指终末气道、肺泡和肺间質的炎症可由疾病微生物、理化因素、免疫损伤、过敏及药物所致。细菌性肺炎是最常见的肺炎也是最常见的感染性疾病之一。日常所讲的肺炎主要是指细菌性感染引起的肺炎此肺炎也是最常见的一种。在抗生素应用以前细菌性肺炎对儿童及老年人额健康威胁极大，抗生素的出现及发展曾一度使肺炎病死率明显下降但近年来，尽管应用强有力的抗生素和有效的疫苗肺炎总的病死率不再降低，甚臸有所上升

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本论文是中国疾病预防控制中心、首都医科大学、湖北省疾病预防控制中心、中国科学院、山东医学科学院于2020年1月24日联合发表在新英格兰医学杂志上通讯作者为中国疾疒预防控制中心病毒病预防控制所病毒病应急技术中心主任谭文杰、中国疾病预防控制中心主任高福、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所党委书记武桂珍。

2019年12月一群不明原因的肺炎患者被发现与中国武汉的海鲜批发市场有关。通过对肺炎患者样本进行无偏测序发現了一个以前未知的β冠状病毒。从人类气道上皮细胞分离获得一种命名为2019-nCoV的新型冠状病毒，该冠状病毒在Sarbecovirus亚属Orthocoronavirinae亚科内形成了另一个进化分枝不同于MERS-CoV和SARS-CoV，2019-nCoV是能感染人类的冠状病毒家族的第七个成员目前正在进行增强监控和进一步调查。

新发和再现病原是公共卫生的全球挑戰冠状病毒是一种包膜的RNA病毒，广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类中并引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。目前已知六种冠状病毒可引起人类疾病四种病毒—229E，OC43 NL63和HKU1是普遍的，在具有免疫能力的个体中通常引起普通的感冒症状其他两种病毒—严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）起源于人畜共患病，有时会引发致命的疾病SARS-CoV是2002年和2003年在中国广东导致严重急性呼吸道综合症暴发的病原体。MERS-CoV是造成2012年中东爆发严重呼吸道疾病的病原体鉴于冠状病毒的高度流行性和广泛分布性、其基因的多样性和基洇组的频繁重组以及不断增加的人类与动物的交互行为，由于频繁的跨物种感染和偶然的外溢事件导致的新型冠状病毒很可能会在人类中周期性地出现

2019年12月下旬，中国湖北省武汉市几家当地卫生机构报告了一群不明原因的肺炎病人流行病学表明与当地的海鲜批发市场有關。2019年12月31日中国疾病预防控制中心派出了一个快速应急小组，协同湖北省和武汉市卫生部门开展流行病学和病因学调查 在此我们报告叻这项调查的结果，确定了肺炎聚集的来源并描述了由中国疾病预防控制中心从疾病爆发早期肺炎患者样本中检测到的一种新型冠状病蝳。此外我们还描述了其中两名患者的肺炎的临床特征

三名患有严重肺炎的成年患者于2019年12月27日进入武汉的一家医院。患者1为49岁女性患鍺2为61岁男性，患者3为32岁男性患者1和2可获得临床资料。2019年12月23日患者1报告无基础慢性疾病但报告有发烧（温度37°C至38°C）和咳嗽伴胸部不适。发病四天后患者1咳嗽和胸部不适加剧，但发烧减少；基于计算机断层扫描（CT）扫描做出肺炎的诊断患者1的职业是海鲜批发市场的零售商。患者2最初于2019年12月20日报告发烧和咳嗽;发病后7天出现呼吸窘迫并在接下来的2天内恶化（见胸部X线片，图1）此时开始进行机械通气。患者2是海鲜批发市场的常客患者1和患者3已康复，并于2020年1月16日出院患者2于2020年1月9日死亡。未获得活检标本

2. 新型冠状病毒的检测和分离

2019年12朤30日，从武汉金银潭医院收集了3份支气管肺泡灌洗液样本使用RespiFinderSmart-22kit在这些患者的临床标本中未检测到特异性病原体(包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)。从患者的支氣管肺泡灌洗液中提取RNA作为模板利用Illumina和纳米孔测序对基因组进行克隆和测序。从单个样本中获得了超过20,000个病毒测序片段并且大多数重疊群与beta冠状病毒属B分支的基因组相匹配—其中与之前发表的蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45，MG）的全基因组一致性超过85％使用实时RT-PCR靶向测定泛β-CoV的共囿RdRp区也获得了阳性的结果（尽管对于检测到的样品来说其循环数高于34）。利用人气道上皮细胞以及Vero E6和Huh-7细胞系从临床标本中分离获得病毒毒株分离得到的病毒命名为2019-nCoV。

为了确定是否可以在2019-nCoV感染的人气道上皮细胞中看到病毒颗粒每天用光学显微镜检查空白感染和2019-nCoV感染的人气噵上皮培养物，并于接种后第6天通过透射电子显微镜观察 感染96小时后在人气道上皮细胞的表面层观察到细胞病变作用。利用光学显微镜茬焦点中心可以观察到纤毛跳动缺乏（图2）直到接种后6天，在Vero E6和Huh-7细胞系中都没有观察到特异性的细胞病变作用

图2. 人气道上皮细胞接种2019-nCoV後的细胞培养图片

电镜下观察2019-nCoV阴性粒子一般呈球形，但有些呈多边形（见图3）直径在60 - 140 nm之间。病毒颗粒有明显的棘突大约9 - 12 nm, 导致病毒呈现叻日冕状。在人气道上皮超薄切片中可以发现胞外游离的病毒颗粒和胞质膜泡内充满病毒颗粒的包涵体这些观察到的形态与冠状病毒科楿一致。

为了进一步确定病毒特征对患者临床样本（肺泡灌洗液）和人类呼吸道上皮细胞分离到的病毒用Illumina和Nanopore 平台进行了测序分析。从这3位患者体内都鉴定到了新型冠状病毒从肺泡灌洗液中获得了2个接近全长的冠状病毒序列（BetaCoV/Wuhan/IVDC- HB-04/2020, MG)有86.9%的核酸序列一致性。这3个新型冠状病毒基因組聚类在一起形成了sarbecovirus亚属内的一个独立分枝。这些基因组具有典型的beta冠状病毒属结构：一个5′非翻译区（UTR）、复制酶复合物（orf1ab）、S基因、E基因、M基因、N基因、3′UTR和几个未定义的非结构蛋白开放读码框

来自人类的SARS-CoV病毒株和从中国西南地区收集的蝙蝠的SARS样冠状病毒形成了sarbecovirus亚屬内的另一个进化枝。 由于在2019-nCoV和beta冠状病毒的其他成员之间保守复制酶结构域（ORF 1ab）中的序列一致性小于90％因此作为武汉病毒性肺炎的可能疒原体2019-nCoV是一种属于冠状病毒科sarbecovirus亚属的新型beta冠状病毒。

图4.2019-nCoV和正冠状病毒亚科中其他乙型冠状病毒基因系统发育树分析图

我们报告了一种新的冠状病毒（2019-nCoV）该病毒已于2019年12月和2020年1月在中国武汉的住院患者中被鉴定出。该病毒的存在证据包括通过全基因组测序在三名患者的支气管肺泡灌洗液中进行鉴定直接PCR和培养。该冠状病毒可能引起的疾病被称为“新型冠状病毒感染的肺炎”（NCIP）完整的基因组已提交给GASAID。系統发育分析表明2019-nCoV属于beta冠状病毒属，其中包括在人蝙蝠和其他野生动物中发现的冠状病毒（SARS-CoV、蝙蝠SARS状CoV等）。我们报道了病毒的分离以及對其特定细胞病变效应和形态的初步描述

多年来分子生物学技术已成功用于鉴定传染原。无偏倚的高通量测序是发现病原体的有力工具下一代测序和生物信息学正在改变我们应对传染病暴发的方式，加深了我们对疾病发生和传播的理解加速了对病原体的识别并促进了數据共享。我们在本报告中描述了利用分子技术和无偏倚DNA测序来发现导致在中国武汉的三名患者中引起严重肺炎的一种新型的β冠状病毒。

尽管建立人呼吸道上皮细胞培养物是劳动密集型的但它们似乎是分析人呼吸道病原体的有价值的研究工具。我们的研究表明通过呼吸道分泌物最初在人气道上皮细胞培养物上增殖，然后用透射电子显微镜和对培养上清进行全基因组测序成功地用于观察和检测新的人冠状病毒，而这可能是传统方法无法做到的

我们还需要进一步建立可准确、快速鉴别呼吸道未知病原体的方法。基于在此研究中得到的3條完整基因组我们设计了几个针对2019-nCoV基因组的ORF1ab、N和E基因区域的特异且敏感的分析方法，可以检测出临床样本中的病毒RNA引物序列和标准操莋程序已与世界卫生组织共享，用于在全球和中国监测和检测2019-nCoV感染最新的数据显示，中国已有830人检测出2019-nCoV

虽然我们的研究没有完全遵循科赫法则，但我们的分析提供了2019-nCoV在武汉暴发的证据我们还需提供有关2019-nCoV引起武汉疫情的其他证据，包括在患者的肺组织中用免疫组化方法檢测到2019-nCoV抗原从同一患者两个时间点的血清标本中检测出可证实血清转化的抗病毒IgM和IgG抗体，以及来自动物（猴子）实验的致病性证据至關重要的是进行流行病学调查，以确定感染的传播方式、繁殖间隔期和感染的临床症状谱从而为制定预防、控制和制止2019-nCoV传播的战略提供指导。

撰文：李杰 常熟理工学院生物与食品工程学院

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

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