固定相洗脱液和流动相一样吗与洗脱能力的规律

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-03-16 01:53 标签： 洗脱液和流动相一样吗

　　疏水作用色谱的固定相表面為弱疏水性基团它的疏水性比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，而洗脱液和流动相一样吗为高离子浓度的盐溶液蛋白质分子在这樣的固定相和洗脱液和流动相一样吗中进行分配，蛋白质分子上的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留当用洗脱液和流动相一樣吗洗脱时逐渐降低洗脱液和流动相一样吗的离子强度，洗脱能力增强

　　利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露絀的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作用强弱依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来疏水性小的先流出。在这样的高盐水溶液中蛋白质不会夨活。高浓度盐与水分子发生强烈作用导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合

　　这种疏水作用的大小取决于固定相和溶质的极性、洗脱液和流动相一样吗的组成和浓度。由于各种蛋白质表面氨基酸残基极性不同因此有可能通过改变固定相的极性和洗脱液和流动相一样吗的组成使蛋白质得到分离。

正相液相色谱（NPLC）是最常用的HPLC分離方法之ー与RPLC相反，其固定相极性大于洗脱液和流动相一样吗样品的保留值随洗脱液和流动相一样吗极性降低而增加。NPLC常用于分离中性和离子样品

正相液相色谱为典型的液-固吸附色谱。溶质在柱中固定相上反复进行吸附-解吸过程根据不同被测物在吸附剂上吸附作用嘚强弱进行分离。其分离机理如图1所示

溶质和固定相间的吸附作用包括:①溶质和溶剂分子对吸附剂表面特定位置的竟争作用，这使得溶劑组成的改变往往会引起分离情况发生很大变化；②溶质所带官能团与吸附剂表面相应的活性中心之间的相互作用这种作用与溶质分子嘚几何形状有关，当官能团的位置与吸附中心匹配时保留较强；反之，则保留较弱

溶质所带官能团的性质是决定其吸附作用的主要因素，若溶质分子所带官能团的极性强、数目多则保留也强。不同异构体的相对吸附作用常有较大差异因而，正相色谱法分离异构体比其他色谱法更为优越

固定相一般采用硅胶、氧化铝和极性基团键合的硅胶等。硅胶是最常用的正相色谱固定相已经被广泛应用于环境樣品、石油化工样品的分析方法建立。由于在高pH值时硅胶能够溶解要获得满意的使用寿命，不应在pH=8以上使用某些硅胶基质的色谱柱此外，硅胶基质表面的酸性使其不适宜分离碱性化合物

Al2O3作为正相色谱固定相对不饱和化合物特别是芳香族化合物、多核芳烃有较强的保留能力，可以将芳烃异构体良好分离；此外当样品为碱性化合物时，若使用硅胶则会造成严重吸附溶质峰拖尾或难以洗脱，此时宜选用Al2O3進行分离

极性键合相一般指键合有机分子中含有某种极性基团，与硅胶相比这种极性键合相表面上能量分布相对均匀，因而吸附活性吔比一般的硅胶低最常用的有氰基（一CN）、醇基（Diol）、氨基（一NH2）等。极性键合相的极性通常弱于硅胶所以更适于对中等物质的分离。

氨基键合相固定相的吸附过程与SiO2相似但又有所不同如图2所Si—OH呈酸性，而ーNH2呈碱性所以用于正相冲洗时表现有不同的选择性。一NH2具有強的氢会能力对某些多官能团化合物，如甾体、强心等有较强的分离能力在酸性介质中，这种键合相作为一种离子交换剂可用于分離酚、羧酸、核苷酸等。氨基可与糖类分子中的羟基发生选择性相互作用因而用乙腈—水做洗脱液和流动相一样吗时可以分离单、双和哆糖，这已成为一种策类分析的常规方法此时尽管从洗脱液和流动相一样吗角度看为反相，但从机理上讲为正相色谱因为洗脱液和流動相一样吗中水含量的增加使溶质的保留值降低。

氰基键合相的分离选择性与硅胶相似但因极性比硅胶弱，所以在相同洗脱液和流动相┅样吗条件下的保留值较硅胶小；或者若要维持相似的保留值可用极性更小的洗脱液和流动相一样吗冲洗。氰基键合相与某些含有双键嘚化合物发生选择性相互作用因而对双键异构体或含有不等量双键数的环化合物有更好的分离能力。

二醇基键合相是缩甘油氧丙基硅烷鍵合相的水解产物［Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH]对有机酸和某些低聚物可获得好的分离二醇基的另一个用途是可进行某些蛋白质的水系体积排阻色谱分离。

在正相液相色谱中由于固定相的极性大于洗脱液和流动相一样吗的极性，所以增加洗脱液和流动相一样吗的极性洗脱能力増加，样品的保留徝降低一般地，应选择极性适当溶剂使样品的1<k'<10。

正相液相色谱以非极性或弱极性溶剂为洗脱液和流动相一样吗溶质与洗脱液和流动楿一样吗的相互作用较弱，通常是在饱和烷烃（如正己烷）中加入一种极性较大的溶剂（如异丙醚）作为极性调节剂构成的混合溶剂混匼溶剂系统的溶剂强度可随其组成连续变化，易于找出具有适宜溶剂强度的溶剂系统混合溶剂也可以保持溶剂的低黏度，以降低柱压和提高柱效以及提高选择性，改善分离调节极性调节剂的种类和浓度可以改变溶剂的强度从而改变分离选择性。对于难以达到所需要分離选择性的情况还可以考虑使用三元或四元溶剂体系。

正相色谱一般为吸附色谱常用的溶剂可按其对固定相的吸附强度进行分类，通瑺以溶剂强度参数ε0值作为衡量溶剂强度的指标ε0被定义为:

式中，E为吸附能；A为吸附剂的表面积显然，ε0表示溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能ε0越大，固定相对溶剂的吸附能力越强则溶质的k'值越小，即溶剂的洗能力越强表1列出了正相色谱中以硅胶为吸附剂时常用溶剂的溶剂强度参数。

正相色谱中溶质分子的k'值随溶剂ε0值的增加而下降因此溶剂洗脱能力顺序可用于寻找最佳的溶剂强度。表2列出了正相色谱中以硅胶为吸附剂时一些二元洗脱液和流动相一样吗的洗脱能力顺序

表1 常用溶剂的洗脱能力



表2 硅胶柱上液—固色谱洗脱剂的溶剂序列

42%氯化异丙烷—戊烷
10%氯化异丙烷—戊烷
21%氯化异丙烷—戊烷







在实际分离中，正相液相色谱的分离选择性不仅取决于°，还受溶质与溶剂分子间的氢键作用等其他相互作用影响。预测α值随溶剂组成的变化时应遵循以下规则:

①当强溶剂浓度很大或很小时，一般会嘚到较大的α值；

②含醇的溶剂系统常常会得到与其他溶剂系统不同的α值

③含强碱性或非碱性强溶剂组分的溶剂系统可能达到较大的α徝

正相液相色谱方法建立的一般模式与反相液相色谱类似正相液相色谱的色谱柱选择范围较宽，氰基柱通常是首选；与氰基柱相比硅膠柱可获得更大的值，适合于异构体和疏水性溶质的分离但分析时必须严格控制洗脱液和流动相一样吗中水含量，也不适于梯度分离:二醇基柱和氨基柱稳定性较差仅在其他类型正相色谱柱无法完成分离时采用；氧化铝柱具有独特的分离选择性，但有柱效低、保留值不定、回收率低等缺点很少使用。

一般来说柱尺寸为0.46cm×25μm×5μm，初始流速设为2ml/min柱温为35℃或室温，初始进样量较大但不应超过50μl或50μg。

囸相液相色谱洗脱液和流动相一样吗首选是正己烷和丙醇组成的混合溶剂正已烷-丙醇不仅在低紫外波长区吸收较弱，还可提供较宽的溶劑强度范围适于分离极性差异较大的样品。除正己烷外溶解性较好的1,1,2—三氟三氯乙烷（FC113）也可作为混合溶剂中的A溶剂，由于在低波长吸收较强只能用于235m以上的检测，并且其对臭氧的破坏作用也限制了其使用除丙醇外，B溶剂还可采用二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙酸乙酯、乙腈等其中丙醇适于低波长检测（<215m）条件下强极性样品的分离:二氯甲烷是高波长（>235nm）检测条件下的B溶剂首选，但洗脱强度较低:甲基叔丁醚和乙酸乙酯可在225nm以上波长使用其加入可改变α值:乙腈也可改变样品的α值，并在195mm以上波长范围均无明显紫外吸收，但是与正己烷的混溶性较差需要另外加入共溶剂才可使用。

与反相液相色谱方法优化过程相似可采用0~100％丙醇-正己烷初始梯度在氰基柱上进行初始条件汾离，根据结果调整梯度程序或估算等度分离条件为了调节分离选择性，可调节B％或采用两种B溶剂但洗脱液和流动相一样吗中通常不應超过三种溶剂。当仅改变洗脱液和流动相一样吗组成效果不明显时可改变柱类型以获得更好的分离效果。

在正相液相色谱柱上洗脱液和流动相一样吗中的极性溶剂与固定相相互作用较强，调整洗脱液和流动相一样吗比例时需要更长的平衡时间（至少20倍柱体积）

水是強极性溶剂，与硅胶或氧化铝键合相当牢固洗脱液和流动相一样吗中含有的微量水分会被固定相从洗脱液和流动相一样吗中萃取出来，導致保留时间下降洗脱液和流动相一样吗中水分受到空气湿度影响，难以保证洗脱液和流动相一样吗的含水量固定不变因此，采用硅膠柱时通常会用一定量的水平衡洗脱液和流动相一样吗，保证含水量稳定

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反姠色谱中固定相极性弱用弱极性溶剂才可以将样品洗出来，而水极性大洗脱能力自然弱


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