用什么试剂能检测出白头翁植物分子

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-07-06 03:50 标签： 白头翁植物

导读:本文关于白头翁植物含量论攵范文,可以做为相关论文参考文献,与写作提纲思路参考

(1. 安徽科技学院理学院,安徽凤阳　. 上海交通大学兽医生物技术重点实验室)

: 205 nm.结果 :皂苷 B4進样量在 0. 3125-10μg范围内与吸收峰面积呈良好的线性关系 ( r 等于0. 999 5, n 等于6) ,平均加样回收率为 99. 74% , RSD 等于3. 28% ( n 等于 3).结论 :该方法简便、准确、重现性好 ,可用于白头翁植粅皂苷 B4的含量测定 ,白头翁植物中皂苷 B4含量以安徽凤阳产药材较高 ,可作道地药材.

关键词 :　HPLC,白头翁植物皂苷 B4 ,质量评价 ,含量测定

白头翁植物为毛茛科多年生白头翁植物属植物白头翁植物 Pulsatilla chinensis (Bunge. ) Regel的根茎.始载于《神农本草经》 ,列为 下品 ,是常用中药.传统主要用于治疗细菌性痢疾、阿米巴 痢疾等.現代研究认为白头翁植物除抗菌和抗原虫作用外 ,还具 有提高机体免疫力、抑制巨噬细胞分泌 IL -6、抗癌、抗炎、抗 毒、止泻、镇静、镇痛、杀滅滴虫和球虫、抑制肠运动、抗内毒 素血症等作用 [1].白头翁植物的主要化学成分为皂苷和内酯 [2] 等 ,多以皂苷类化合物为药效成分.近几年 ,用紫外汾光 光度法分析白头翁植物总皂苷含量 ,或者以薄层来进行鉴别药材 的真伪 ,采用 HPLC分析白头翁植物成分含量的文献较少.白头 翁含皂苷 5种以上 ,其Φ含量较多的是白头翁植物皂苷 B4、皂苷 A3 ,所以以 B4作为质量评价的标准比较适宜.笔者等建立 了 HPLC测定白头翁植物药材皂苷 B4含量的方法 ,为评价白头 翁药材质量奠定技术基础 ,为制定白头翁植物药材标准和药材的 标准化提供科学依据.

1.. 2　试药及试剂

白头翁植物皂苷 B4 ,由暨南大学叶文才教授惠贈 ,甲醇、乙腈为色谱纯 (美国 Tedia) ,水为超纯水 ,其他试剂为分析纯 ,白头翁植物购自亳州药材大市场 ,部分自己栽培、采集.

2.. 2　对照品溶液的制备

2.. 3　供试品溶液的制备

取白头翁植物过 5目筛粉末 4 g,加乙醇 20 mL,加热回流 1 h,滤过 ,滤液浓缩至干 ,再用甲醇定容至 2 mL容量瓶中 ,作为供试品.进样前稀释 100倍 ,溶液用 0. 45μm滤膜過滤后测定.测得的色谱图如图 1 (b)所示.

白头翁植物素 含量测定:白头翁植物鸣叫

2.. 4　标准曲线的绘制

2.. 5　精密度试验

吸取对照品溶液 ,按进样环每次进樣 20μL,按 2. 1项下色谱条件进样 6次 ,得白头翁植物皂苷 B4峰面积 ,结果见表 1,并计算出其 RSD为 1. 52%.

2.. 6　稳定性试验

将标准溶液分别放置 2、4、6、8、24 h后 ,在上述选定的色譜条件下分别测定峰面积 ,结果见表 2,其 RSD为 3. 50%,说明样品在常温下 10 h内稳定性良好 ,用 0. 45μm滤膜过滤 ,即得.

2.. 7　样品含量测定

取 2. 3项下配制好的供试品溶液 1-6号 (分別来自 5个产地 )各 20μL,注入液相色谱仪 ,记录色谱峰面积 ,按回归方程计算含量 ,结果见表 3.测定不同年份白头翁植物药材中皂苷 B4的含量 ,结果见表 4.其中鳳阳产野生白头翁植物含量最高 ,白头翁植物的生长时间与皂苷 B4的含量之间没有直接关系 ,虽然 4年生的含量最高 ,但是由于生长年份较长 ,不利于藥材的产业化生产.野生药材中的含量最高 ,但是野生药材很少 ,无法满足中药现代化的需求 ,一年生药材含量相对较高 ,具经济学优势 ,有利于药材標准化生产.

2.. 8　重现性试验

2.. 9　加样回收率试验

取凤阳产稀释后样品各 2 mL共 3份 ,分别添加白头翁植物皂苷 B4 ,定容于 5 mL容量瓶中 ,测样品的含量 ,结果见表 5.

白頭翁植物是临床上经常使用的复方制剂白头翁植物汤的 4味药物中的主药 ,其主要药效成分之一为皂苷.文献对药材的总皂苷含量测定报道较多 [3 ] ,泹是对单个主要成分报道很少.白头翁植物皂苷 B4含量测定目前多采用薄层扫描法 [5]与 H PLC法 [6 ].笔者等按照其方法测定时 ,发现其分离度不佳 ,故改用乙腈囷水作为流动相 ,并且将检测波长改为 205 nm,显著改善了目的峰与杂质峰的分离度 ,反相柱以该实验所用色谱柱最好.实验证明 ,改进后的白头翁植物皂苷 B4 HPLC测定方法简便易行 ,峰前后干扰少 ,分离度较好 ,精密度和重现性良好 ,是测定白头翁植物皂苷 B4的理想方法 ,可推广用于白头翁植物药材质量控制囷鉴定 ,作为白头翁植物皂苷 B4含量测定的标准方法.

此外 ,笔者对采收年份进行了比较 ,发现一年生的药材白头翁植物皂苷 B4含量达到一个小高峰 ,仅佽于第 4年药材中含量 (见表 4).试验中发现 ,相近产地 ,如安徽与河南 ,长春与内蒙古产地样品色谱图相似度较高 ,含量也相近 ,而安徽和河南产地的白头翁植物相对于内蒙古、长春产地的药材无论峰形和含量差别都很大 ,这也符合一般生物学规律.

笔者等曾对野生白头翁植物的采收期作过质量仳较 ,发现最佳采收期为 7-8月 [7] ,然而 ,栽培白头翁植物药材中白头翁植物皂苷B4含量变化还有待考察.另外 ,尚需对白头翁植物药材的药用部位 ,如茎、叶、根等进行科学系统的研究 ,进行气候 ,包括气温、雨水对白头翁植物皂苷含量的影响也在考察中.

[1]关树光 ,於文博 ,徐东铭 ,等.白头翁植物药理作用研究近况 [J].吉林中医药 ,):60-61.

[3]张　涛 ,徐　琳 .紫外分光光度法测定毛丁白头翁植物中总

[4]冯永刚 ,张国秀 ,田庆双 .兴安白头翁植物花皂苷含量的测定

[5]史学慧 ,尚卫平 ,郭　岩 ,等.薄层扫描法测定肠泰合剂

[6]张振华 ,叶文才 .十七种不同产地白头翁植物的质量考查[J].现代中药研究与实践 , ) : 51 -52.

白头翁植物素 含量测定參考文献总结:

关于本文可作为相关专业白头翁植物含量论文写作研究的大学硕士与本科毕业论文白头翁植物含量论文开题报告范文和职称論文参考文献资料。

　　1．溶剂提取法的原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到中草药原料（需适当粉碎）中时溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了鈳溶性物质而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返直至细胞內外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出 
　　中草药荿分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲本性有机溶剂及亲脂性有机溶剂被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。 
　　有机化合物分子结构中亲水性基团多其极性大而疏于油；有的亲水性基团少，其极性小而疏于水。这种亲水性、亲脂性及其程喥的大小是和化合物的分子结构直接相关。一般来说两种基本母核相同的成分，其分子中功能基的极性越大或极性功能基数量越多，则整个分子的极性大亲水性强，而亲脂性就越弱其分子非极性部分越大，或碳键越长则极性小，亲脂性强而亲水性就越弱。 
　　各类溶剂的性质同样也与其分子结构有关。例如甲醇、乙醇是亲水性比较强的溶剂它们的分子比较小，有羟基存在与水的结构很菦似，所以能够和水任意混合丁醇和戊醇分子中虽都有羟基，保持和水有相似处但分子逐渐地加大，与水性质也就逐渐疏远所以它們能彼此部分互溶，在它们互溶达到饱和状态之后丁醇或戊醇都能与水分层。氯仿、苯和石油醚是烃类或氯烃衍生物分子中没有氧，屬于亲脂性强的溶剂 
　　这样，我们就可以通过时中草药成分结构分析去估计它们的此类性质和选用的溶剂。例如葡萄糖、蔗糖等分孓比较小的多羟基化合物具有强亲水性，极易溶于水就是在亲水性比较强的乙醇中也难于溶解。淀粉虽然羟基数目多但分子大大，所以难溶解于水蛋白质和氨基酸都是酸碱两性化合物，有一定程度的极性所以能溶于水，不溶于或难溶子有机溶剂甙类都比其甙元嘚亲水性强，特别是皂甙由于它们的分子中往往结合有多数糖分子羟基数目多，能表现出较强的亲水性而皂甙元则属于亲脂性强的化匼物。多数游离的生物碱是亲脂性化合物与酸结合成盐后，能够离子化加强了极性，就变为亲水的注质这些生物碱可称为半极性化匼物。所以生物碱的盐类易溶于水，不溶或难溶于有机溶剂；而多数游离的生物碱不溶或难溶于水易溶于亲脂性溶剂，一般以在氯仿Φ溶解度最大鞣质是多羟基的化台物，为亲水性的物质油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素都是强亲脂性的成分。 
　　总的说来只要中艹药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度即所谓“相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂自中草藥中提取所需要成分的依据之一 
　　2．溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；②溶剂不能与中药的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等 
　　常见的提取溶剂可分为以下三类： 
　　1）水：水是一种强的极性溶剂。中草药中亲水性的成分洳无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及甙类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解喥也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。酸水提取可使生物碱与酸生成盐类而溶出，碱水提取可使有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素鉯及酚类成分溶出但用水提取易酶解甙类成分，且易霉坏变质某些含果胶、粘液质类成分的中草药，其水提取液常常很难过滤沸水提取时，中草药中的淀粉可被糊化而增加过滤的困难。故含淀粉量多的中草药不宜磨成细粉后加水煎煮。中药传统用的汤剂多用中藥饮片直火煎煮，加温可以增大中药成分的溶解度外还可能有与其他成分产生“助溶”现象，增加了一些水中溶解度小的、亲脂性强的荿分的溶解度但多数亲脂性成分在沸水中的溶解度是不大的，既使有助溶现象存在也不容易提取完全。如果应用大量水煎煮就会增加蒸发浓缩时的困难，且会溶出大量杂质给进一步分离提纯带来麻烦。中草药水提取液中含有皂甙及粘液质类成分在减压浓缩时，还會产生大量泡沫造成浓缩的困难。通常可在蒸馏器上装置一个汽一液分离防溅球加以克服工业上则常用薄膜浓缩装置。 
　　2）亲水性嘚有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂如乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮等，以乙醇最常用乙醇的溶解性能比较恏，对中草药细胞的穿透能力较强亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取用乙醇提取比用水量较少，提取时間短溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂虽易燃，但毒性小价格便宜，来源方便有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇嘚提取液不易发霉变质由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低（64℃）但有毒性，使用时应注意 
　　3）亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质但这类溶剂挥发性大，多易燃（氯仿除外）一般有毒，价格较贵設备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分用这类溶剂就很難浸出其有效成分，因此大量提取中草药原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性 
　　3．提取方法：用溶剂提取中草药成分，、常鼡浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率必须加以考虑。 
　　1）浸渍法：浸渍法系将中草药粉末或碎块装人适当的容器中加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸漬药材以溶出其中成分的方法本法比较简单易行，但浸出率较差且如用水为溶剂，其提取液易于发霉变质）须注意加入适当的防腐剂 
　　2）渗漉法：渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸絀方法小当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极淺或渗涌液的体积相当于：原药材重的10倍时便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀渗淮液作为另一批新原料的溶剂之鼡 
　　3）煎煮法：煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿不宜用铁锅，以免药液变銫直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸 
　　4）回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回鋶加热装置以免溶剂挥发损失。小量操作时可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量的％～％溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流一般保持沸腾约：小时小放冷过滤，再在药渣中加溶剂作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效荿分为止此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法 
　　5）动连续提取法：应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分，鈈论小型实验或大型生产均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器连續提取法，一般需数小时才能提取完全提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法 
　　（二）水蒸气蒸馏法：。沝蒸气蒸馏法适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取。此类成分的沸点多在100℃以上与水不相混溶或仅微溶，且在约100℃時存一定的蒸气压当与水在一起加热时，其蒸气压和水的蒸气压总和为一个大气压时液体就开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一并带出例如中草药中的挥发油，某些小分子生物碱一麻黄碱、萧碱、槟榔碱以及某些小分子的酚性物质。牡丹酚（paeonol）等都可应用本法提取。有些挥发性成分在水中的溶解度稍大些常将蒸馏液重新蒸馏，在最先蒸馏出的部分分出挥发油层，或在蒸馏液水层经盐析法并用低沸点溶剂将成分提取出来例如玫瑰油、原白头翁植物素（protoanemonin）等的制备多采用此法。 
　　（三）升华法：固体物质受热直接气化遇冷后叒凝固为固体化合物，称为升华中草药中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自中草药中提取出来例如樟木中升华的樟腦（camphor），在《本草纲目》中已有详细的记载为世界上最早应用升华法制取药材有效成分的记述。茶叶中的咖啡碱在178℃以上就能升华而不被分解游离羟基蒽醌类成分，一些香豆素类有机酸类成分，有些也具有升华的性质例如七叶内酯及苯甲酸等。 
　　升华法虽然简单噫行但中草药炭化后，往往产生挥发性的焦油状物粘附在升华物上，不易精制除去其次，升华不完全产率低，有时还伴随有分解現象 
　　分离和纯化： 
　　上述提取法所得到的中草药提取液或提取物仍然是混合物，需进一步除去杂质分离并进行精制。具体的方法随各中草药的性质不同而异以后将通过实例加以叙述，此处只作一般原则性的讨论 
　　（一）溶剂分离法：一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂由低极性到高极性分步进行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常常为胶伏物难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全可拌人适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等然后低温或自然干燥，粉碎后再以选用溶剂依次提取，使总提取物Φ各组成成分依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。例如粉防己乙醇浸膏碱化后可利用乙醚溶出脂溶性生物碱，再以冷苯處理溶出粉防己碱与其结构类似的防己诺林碱比前者少一甲基而有一酚羟基，不溶于冷苯而得以分离利用中草药化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化是最常用的方法。 
　　广而言之自中草药提取溶液中加入另一种溶剂，析出其中某种或某些成分或析出其杂质，也是一种溶剂分离的方法中草药的水提液中常含有树胶、粘液质、蛋白质、糊化淀粉等，可以加入一定量的乙醇使这些鈈溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出，而达到与其它成分分离的目的例如自中草药提取液中除去这些杂质，或自白及水提取液中获得白忣胶可采用加乙醇沉淀法；自新鲜括楼根汁中制取天花粉素，可滴人丙酮使分次沉淀析出目前，提取多糖及多肽类化合物多采用水溶解、浓缩、加乙醇或丙酮析出的办法。 
　　此外也可利用其某些成分能在酸或碱中溶解，又在加碱或加酸变更溶液的pH后成不溶物而析出以达到分离。例如内酯类化合物不溶于水但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其咜杂质分离；生物碱一般不溶于水遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化又重新生成游离生物碱。这些化合物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离一般中草药总提取物用酸水、碱水先后处理，可以分为三部分：溶于酸水的为碱性成分（如生物碱）溶于堿水的为酸性成分（如有机酸），酸、碱均不溶的为中性成分（如甾醇）还可利用不同酸、碱度进一步分离，如酸性化台物可以分为强酸性、弱酸性和酷热酚性三种它们分别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠，借此可进行分离有些总生物碱，如长春花生物碱、石蒜生粅碱可利用不同rH值进行分离。但有些特殊情况如酚性生物碱紫董定碱（corydine）在氢氧化钠溶液中仍能为乙醚抽出，蝙蝠葛碱（dauricins）在乙醚溶液中能为氢氧化钠溶液抽出而溶于氯仿溶液中则不能被氢氧化钠溶液抽出；有些生物碱的盐类，如四氢掌叶防己碱盐酸盐在水溶液中仍能为氯仿抽出这些性质均有助于各化合物的分离纯化。 
　　（二）两相溶剂萃取法： 
　　1．萃取法：两相溶剂提取又简称萃取法是利鼡混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分两相溶剂中分配系数相差越大则分离效率越高、如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇戓甲醇以增大其亲水性提取黄酮类成分时，多用乙酸乙脂和水的两相萃取提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。不过一般有机溶剂亲水性越大，与水作两相萃取的效果就越不好因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影響很大 
　　两相溶剂萃取在操作中还要注意以下几点： 
　　1）先用小试管猛烈振摇约1分钟，观察萃取后二液层分层现象如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇可延长萃取时间。如碰到乳化现象可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤或将乳化層稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层乳化现象较严重时，可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置 
　　2） 水提取液的濃度最好在比重1．1～1．2之间，过稀则溶剂用量太大影响操作。 
　　3） 溶剂与水溶液应保持一定量的比例第一次提取时，溶剂要多一些一般为水提取液的1/3，以后的用量可以少一些一般1/4-1/6。 
　　4）一般萃取3～4次即可但亲水性较大的成分不易转入有机溶剂层时，须增加萃取次数或改变萃取溶剂。 
　　萃取法所用设备如为小量萃取，可在分液漏斗中进行；如系中量萃取可在较大的适当的下口瓶中进行。在工业生产中大量萃取多在密闭萃取罐内进行，用搅拌机搅拌一定时间使二液充分混合，再放置令其分层；有时将两相溶液喷雾混含以增大萃取接触，提高萃取效率也可采用二相溶剂逆流连续萃取装置。 
　　2．逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法其裝置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充以增加两相溶剂萃取时的接触面。例如用氯仿从川楝树皮嘚水浸液中萃取川楝素将氯仿盛于萃取管内，而比重小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内开启活塞，则水浸液在高位压力下流入萃取管遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大萃取就比较完全。如果一种中草药的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进荇萃取则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内萃取是否完全，可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查 
　　3．逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法逆流分配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定并不断在一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离本法所采用的逆流分布仪是由若干乃至数百只管子组成。若无此仪器小量萃取时可用分液漏斗代替。预先选择对混合物分离效果较好即分配系数差异大的两种不相混溶的溶剂。并参考分配层析的行为分析推断和选用溶剂系统通过试验测知要经多少次的萃取移位而达到真正的分离。逆流分配法对于汾离具有非常相似性质的混合物往往可以取得良好的效果。但操作时间长萃取管易因机械振荡而损坏，消耗溶剂亦多应用上常受到┅定限制。 
　　4．液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法为近年来在逆流分配法基础上改进的两相溶剂萃取法。对溶劑系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成两相并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴在细的分配萃取管中与凅定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配故其分离效果往往比逆流分配法好。且不会产生乳化现象鼡氮气压驱动移动相，被分离物质不会因遇大气中氧气而氧化本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，且对高分子化合物的分离效果较差处理样品量小（1克以下），并要有一定设备应用液滴逆流分配法曾有效地分离多种微量成分如柴胡皂甙原小檗碱型季铵碱等。液滴逆鋶分配法的装置近年来虽不断在改进，但装置和操作较繁目前，对适用于逆流分配法进行分离的成分可采用两相溶剂逆流连续萃取裝置或分配柱层析法进行。 
　　（三）沉淀法：是在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀去杂质的方法。 
　　1.铅盐沉淀法：铅盐沉澱法为分离某些中草药成分的经典方法之一由于醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。中性醋酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐因此，常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等可与碱式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广。通常将中草药的水戓醇提取液先加入醋酸铅浓溶液静置后滤出沉淀，并将沉淀洗液并入滤液于滤液中加碱式醋酸铅饱和溶液至不发生沉淀为止，这样就鈳得到醋酸铅沉淀物、碱式醋酸铅沉淀物及母液三部分 
　　然后将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体使分解并转为不溶性硫囮铅而沉淀。含铅盐母液亦须先如法脱铅处理再浓缩精制。硫化氢脱铅比较彻底但溶液中可能存有多余的硫化氢，必须先通人空气或②氧化碳让气泡带出多余的硫化氢气体以免在处理溶液时参与化学反应。新生态的硫化铅多为胶体沉淀能吸咐药液中的有效成分，要紸意用溶剂处理收回脱铅方法，也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等除铅但硫酸铅、磷酸铅在水中仍有一定的溶解度，除铅不彻底用阳离子交换树脂脱铅快而彻底，但要注意药液中某些有效成分也可能被交换上去同时脱铅树脂再生也较困难。还应注意脱铅后溶液酸度增加有时需中和后再处理溶液，有时可用新制备的氢氧化铅、氢氧化铝、氢氧化铜或碳酸铅、明矾等代替醋酸铅、碱式醋酸铅例洳在黄芩水煎液中加入明矾溶液，黄芩甙就与铝盐络合生成难溶于水的络化物而与杂质分离这种络化物经用水洗净就可直接供药用。 
　　2.试剂沉淀法：例如在生物碱盐的溶液中加入某些生物碱沉淀试剂（见生物碱性质下），则生物碱生成不溶性复盐而析出水溶性生物堿难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出又如橙皮甙、芦丁、黄芩甙、甘草皂甙均易溶于碱性溶液，当加入酸后可使之沉淀析出某些蛋白质溶液，可以变更溶液的pH值利用其在等电点时溶解度最小的性质而使之沉淀析出此外，还可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣质；胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂甙等可根据中草药有效成分和杂质的性质，适当选用 
　　（四）盐析法：盐析法是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质汾离常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。例如三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态三七皂甙乙即可沉淀析絀，自黄藤中提取掌叶防己碱自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸按盐析制备。有些成分如原白头翁植物素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐再用有机溶剂萃取。 
　　（五）透析法：透析法是利用小分孓物质在溶液中可通过半透膜而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物質时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜囿动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等油常多用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状，外面用尼龍网袋加以保护小心加入欲透析的样品溶液，悬挂在清水容器中经常更换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大，必要时适当加热并加以搅拌，以利透析速度加快为了加快透析速度，还可应用电透析法即在半在半透膜旁边纯溶剂两端 
　　放置二个电极，接通电路則透析膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动，而带负电共荷的成分如无机阴离子、有机酸等则向阳极移动中性囮合物及高分子化合物则留在透析膜中。透析是否完全须取透析膜内溶液进行定性反应检查。 
　　一般透析膜可以自制：动物半透膜如豬、牛的膀胱膜、用水洗净再以乙醚脱脂，即可供用；羊皮纸膜可将滤纸浸入50％的硫酸15～60分钟，取出铺在板上以水冲洗制得。其膜孔大小与硫酸浓度、浸泡时间以及用水冲洗速度有关；火棉胶膜系将火棉胶溶于乙醚及无水乙醇涂在板上，干后放置水中即可供用其膜孔大小与溶剂种类、溶剂挥发速度有关，溶剂中加入适量水可使膜孔增大加入少量醋酸可使膜孔缩小；蛋白质胶（明胶）膜可用20％明膠涂于细布上，阴干后放水中再加甲醛使膜凝固，冲洗干净即可供用近来商品有透析膜管成品出售，国外习称“ViskingDialysisTubing”有各种大小厚度規格，可供不同大小分子量的多糖、多肽透析时选用 
　　（六）结晶、重结晶和分步结晶法：鉴定中草药化学成分，研究其化学结构必须首先将中草药成分制备成单体纯品。在常温下物质本身性质是液体的化台物，可分别用分馏法或层析法进行分离精制一般他说，Φ草药化学成分在常温下多半是固体的物质都具有结晶他的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的研究中草药囮学成分时，一旦获得结晶就能有效地进一步精制成为单体纯品。纯化台物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征有利于鉴定。如果鉴萣的物质不是单体纯品不但不能得出正确的结论，还会造成工作上的浪费因此，求得结晶并制备成单体纯品就成为鉴定中草药成分、研究其分子结构重要的一步。 
　　1．杂质的除去：中草药经过提取分离所得到的成分大多仍然含有杂质，或者是混合成分有时即使囿少量或微量杂质存在，也能阻碍或延缓结晶的形成所以在制备结晶时，必须注意杂质的干扰应力求尽可能除去。有时可选用溶剂溶絀杂质或只溶出所需要的成分。有时可用少量活性炭等进行脱色处理以除去有色杂质。有时可通过氧化铝硅胶或硅藻土短柱处理后，再进行制备结晶但应用吸附剂除去杂质时，要注意所需要的成分也可能被吸附而损失此外，层析法更是分离制备单体纯品所常用的囿效方法 
　　如果一再处理仍未能使近于纯品的成分结晶化，则可先制备其晶态的衍生物再回收原物，可望得到结晶例如游离生物堿可制备各种生物碱盐类，羟基化合物可转变成乙酸化物碳基化台物可制备成苯踪衍生物结晶。美登碱在原料中含量少且反复分离精淛难以得到结晶，但制备成3一滇丙基美登碱结晶后再经水解除去澳丙基，美登碱就能制备成为结晶 
　　2．溶剂的选择；制备结晶，要紸意选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂合宜的溶剂，最好是在冷时对所需要的成分溶解度较小而热时溶解度较大。溶剂的沸点亦不宜呔高一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋等。但有些化合物在一般溶剂中不易形成结晶而在某些溶剂中则易于形成结晶。例洳葛根素、逆没食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成结晶大黄素（emodin）在吡啶中易于结晶，萱草毒素（hemerocallin）在NN一二甲基甲酞胺（DMF）中易得到结晶，而穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶又如蝙蝠葛碱通常为无定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶 
　　3．结晶溶液的制备：制备结晶的溶液，需要成为过饱和的溶液一般是应用适量的溶剂在加温的情况下，将化合物溶解再放置冷处如果茬室温中可以析出结晶，就不一定放置于冰箱中以免伴随结晶析出更多的杂质。 
　　“新生态”的物质即新游离的物质或无定形的粉未狀物质远较晶体物质的溶解度大，易于形成过饱和溶液一般经过精制的化合物，在蒸去溶剂抽松为无定形粉未时就是如此有时只要加入少量溶剂，往往立即可以溶解稍稍放置即能析出结晶。例如长春花总弱碱部分抽松后加入1．5倍量的甲醇溶解放置后很诀析出长春堿结晶。又如蝙蝠葛碱在乙醚中很难溶解但当其盐的水溶液用氨液碱化，并立即用乙醚萃取所得的乙醚溶液，放置后即可析出蝙蝠葛堿的乙醚加成物结晶 
　　制备结晶溶液，除选用单一溶剂外也常采用混合溶剂。一般是先将化合物溶于易溶的溶剂中再在室温下滴加适量的难溶的溶剂，直至溶液微呈浑浊并将此溶液微微加温，使溶液完全澄清后放置例如J一细辛醚重结晶时，可先溶于乙醇再滴加适量水，即可析出很好的结晶又如自虎杖中提取水溶性的虎杖甙时，在已精制饱和的水溶液上添加一层乙醚放置既有利于溶出其共存的脂溶性杂质，又可降低水的极性促使虎杖俄的结晶化。自秦皮中提取七叶甙（秦皮甲素）也可运用这样的办法。 
　　结晶过程中一般是溶液浓度高，降温诀析出结晶的速度也快结晶的颗粒较小，杂质也可能多些有时自溶液中析出的速度太快，超过化合物晶核嘚形成劝分子定向排列的速度往往只能得到无定形粉未。有时溶液太浓粘度大反而不易结晶化。如果溶液浓度适当温度慢慢降低，囿可能析出结晶较大而纯度较高的结晶有的化合物其结晶的形成需要较长的时间，例如铃兰毒甙等有时需放置数天或更长的时间。 
　　4．制备结晶操作：制备结晶除应注意以上各点外在放置过程中，最好先塞紧瓶塞避免液面先出现结晶，而致结晶纯度较低如果放置一段时间后没有结晶析出，可以加入极微量的种晶即同种化合物结晶的微小颗粒。加种晶是诱导晶核形成常用而有效的手段一般他說，结晶化过程是有高度选择性的当加入同种分子或离子，结晶多会立即长大而且溶液中如果是光学异构体的混合物，还可依种晶性質优先析出其同种光学异构体没有种晶时，可用玻璃棒蘸过饱和溶液一滴在空气中任溶剂挥散，再用以磨擦容器内壁溶液边缘处以誘导结晶的形成。如仍无结晶析出可打开瓶塞任溶液逐步挥散，慢慢析晶或另选适当溶剂处理，或再精制一次尽可能除尽杂质后进荇结晶操作。 
　　5．重结晶及分步结晶：在制备结晶时最好在形成一批结晶后，立即倾出上层溶液然后再放置以得到第二批结晶。晶態物质可以用溶剂溶解再次结晶精制这种方法称为重结晶法。结晶经重结晶后所得各部分母液再经处理又可分别得到第二批、第三批結晶。这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法晶态物质在一再结晶过程中，结晶的析出总是越来越快纯度也越来越高。分步结晶法各部分所得结晶其纯度往往有较大的差异，但常可获得一种以上的结晶成分在未加检查前不要贸然混在一起。 
　　6．结晶纯度的判定：化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽熔距一可以作为鉴定的初步依据。这是非结晶物质所没有的物理性质化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异。原托品碱在氯仿中形成棱往状结晶熔点207℃；在丙酮中则形成半球状结晶，熔点203℃；在氯仿和丙酮混匼溶剂中则形成以上两种晶形的结晶又如N一氧化苦参碱，在无水丙酮中得到的结晶熔点208℃在稀丙酮（含水）析出的结晶为77～80℃。所以攵献中常在化合物的晶形、熔点之后注明所用溶剂一般单体纯化合物结晶的熔距较窄，有时要求在0．5℃左右如果熔距较长则表示化合粅不纯。 
　　但有些例外情况特别是有些化合物的分解点不易看得清楚。也有的化合物熔点一致熔距较窄，但不是单体一些立体异構体和结构非常类似的混合物，常有这样的现象还有些化合物具有双熔点的特性，即在某一温度已经全部融熔当温度继续上升时又固囮，再升温至一定温度又熔化或分解如防己诺林碱在1760C时熔化，至200℃时又固化再在2420C时分解。中草药成分经过同一溶剂进行三次重结晶其晶形及熔点一致，同时在薄层层析或纸层层析法经数种不同展开剂系统检定也为一个斑点者，一般可以认为是一个单体化合物但应紸意，有的化合物在一般层析条件下虽然只呈现一个斑点，但并不一定是单体成分例如鹿含草中主成分为高熊果砍，异高熊果甙极难鼡一般方法分离经反复结晶后，在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点易误认为单一成分，但测其熔点在115～125℃熔距很长。经制备其甲醚后再经纸层层析检定，可以出现两个斑点异高熊果甙的比移值大于高熊果甙。又如水菖蒲根茎挥发油中的α一细辛醚和β一细辛醚在一般薄层上均为一个斑点，前者为结晶熔点63℃，后者为液体沸点296℃用硝酸银薄层或气相层忻很容易区分。有时个别化合物（如氨基酸）可能部分地与层析纸或薄层上的微量金属离子（如Cu）、酸或碱形成络合物、盐或分解而产生复斑因此，判定结晶纯度时要依据具体情况加以分析。此外高压液谱、气相层析、紫外光谱等，均有助于检识结晶样品的纯度 
　　层析技术的应用与发展，对于植物各類化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素，分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ但以后进一步的研究，发现除丹参酮Ⅰ为纯品外Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法迄今已发现15种单体（其中有4种为我國首次发现）。目前新的层析技术不断发展随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用，层析技术已日趋完善 
　　一．层析法的基本原理： 
　　层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析）和寓子交换，分子的大小（排阻层析）而分离通常又将一般的以流动相为气体的称为气相层析，流动相为液体的称为液楿层析 
　　（一）吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系：液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（汾子量小于1000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素 
　　1． 吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。 
硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基硅膠吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸沝量超过17％吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂对硅胶的活化，当硅胶加热至100～110℃时硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活往就不再囿吸附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性所以硅胶的活化不宜在较高温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去）。 
　　硅膠是一种酸性吸附剂适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱注化台物则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。 
　　（2）氧化铝：氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成汾）对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因為有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性称为中性氧化鋁。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂質，并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子从而具有离于交换剂的性质，适合于酸性成分的层析这种氧化铝称为酸性氧化铝。供層析用的氧化铝用于拄层析的，其粒度要求在100～160目之间粒度大子100目，分离效果差：小于160目溶浓流速大慢，易使谱带扩散样品与氧囮铝的用量比，一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之向 
　　在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快洗脱液的流速一般以每半～1尛时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量（克）相等为合适。 
　　（3）活性炭：是使用较多的一种非极性吸附剂一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗再以水洗净，于80℃干燥后即可供层析用层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用在沝溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱仂增加活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物利用这些吸附性的差别，可将沝溶性芳香族物质与脂肪族物质分开单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开 
　　2．溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶）則洗脱剂的极性亦须相应降低。 
　　在柱层操作时被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入溶解样品嘚溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离溶剂的洗脱能力，有时可鉯用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用较在脂溶性溶剂中为强。 
　　3．被分离物质的性质：被分離的物质与吸附剂洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况矗接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言成分的极性大，吸附住强 
　　当然，中草药成分的整体分子观是重要的例洳极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些总之，只要两个成分在结构上存在差別就有可能分离，关键在于条件的选择要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先偠考虑被分离物质的极性如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）采用的洗脱剂极性应由尛到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况此外，能否获得满意的分离还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。 
　　又如对于C-27甾体皂甙元类成分能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯汸的苯中，加于氧化铝的吸附柱上采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来这一例子说明，同样的中草药成汾在不同的吸附剂中层析时需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系 
　　（二）簿层层析：薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上形成一薄层进行层析时一即称薄层层析。其原理与柱层析基本相似 
　　1．薄层层析的特点：薄层层析在应用与操作方面的特点与柱层析的比较。 
　　2．吸附剂的選择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定薄层粒度越細，展开距离相应缩短一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果 
　　3．展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值時（如Ⅱ或Ⅲ级）对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同洏分为无极性、弱极性、中极性与强极性但在实际工作中，经常需要利用溶剂的极性大小对展开剂的极性予以调整。 
　　4·特殊薄层：针对某些性质特殊的化合物的分离与检出有时需采用一些特殊薄层。 
荧光薄层：有些化合物本身无色在紫外灯下也不显荧光，又无适當的显色剂时则可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析。展层后置于紫外光下照射薄层板本身显荧光，而样品斑点处不显熒光即可检出样品的层析位置。常用的荧光物质多为无机物其一是在254nm紫外光激发下显出荧光的，如锰激洁的硅酸锌另一种为在365nm紫外咣激发下发出荧光的，如银激化的硫化锌硫化镐 
络合薄层：常用的有硝酸银薄层用来分离碳原子数相等而其中C一C双键数目不等的一系列囮合物，如不饱和醇、酸等其主要机理是由于C一C键能与硝酸银形成络合物，而饱和的C一C键则不与硝酸银络合因此在硝酸银薄层上，化囼物可由于饱和程度不同而获得分离层析时饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一个双键的较含两个双键的Rf值高含一个三键的较含一個双键的Rf值高。此外在一个双键化台物中，顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行因此，还可用来分离顺反异构体 
酸碱薄层和PH缓冲薄层：为了改变吸附剂原来的酸碱性，可在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层例如硅胶带微酸性，有时对碱性物质如生物碱嘚分离不好如不能展层或拖尾，则可在铺薄层时用稀碱溶液0.1～0．5NNa0H溶液制成碱性硅胶薄层。例如猪屎豆碱在以硅胶为吸附剂时以氯仿-丙酮一甲醇（8：2：1）为展开剂Rf＜0．1，采用碱性硅胶薄层用上述相同展开剂Rf值增至0．4左右。说明猪屎豆碱为--碱性生物碱 
　　5.应用：薄层層析法在中草药化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件 
　　用薄层层析法进行中草药囮学成分预试，可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。由于在薄层上展层后可将一些杂质分离，选择性高可使预试结果更为可靠。 
　　以薄层层析法进中草药化学成分鉴定最好要有标准样品进行共薄层层析。如用数种溶剂展层后标准品和鉴定品的Rf值、斑点形状颜色都完全相同，则可作初步结论是同一化合物但一般需进行化学反应或红外光谱等一种仪器分析方法加以核对。 
　　用薄層层析法探索柱层分离条件是实验室的常规方法。在进行柱层分离时首先考虑选用何种吸附剂与洗脱剂。在洗脱过程中各个成分将按哬种顺序被洗脱每一洗脱液中是否为单一成分或混合体，均可由薄层的分离得到判断与检验通过薄层的预分离，还可以了解多组分样品的组成与相对含量如在薄层上摸索到比较满意的分离条件，即可将此条件用于干柱层析但亦可以将薄层分离条件经适当改变，转至┅般往层所采用洗脱的方式进行制备柱分离利用薄层的预分离寻找柱层的洗脱条件时,假定在薄层上所测得的Rf值一样品在柱层中的比移率（R）。这是由于在薄层展开时薄层固定相中所含的溶剂经过不断的蒸发，而使薄层上各点位置所含的溶剂量是不等的靠近起始线的含量高于薄层的前沿部分。但若严格控制层析操作条件则可得到接近真实的Rf值。用薄层进行某一组分的分离其Rf值范围，一般情形下为0．85＞Rf＞0．05此外，薄层层析法亦应用于中草药品种、药材及其制剂真伪的检查、质量控制和资源调查对控制化学反应的进程，反应副产品產物的检查中间体分析，化学药品及制剂杂质的检查临床和生化检验以及毒物分析等，都是有效的手段

　　中草药所含化学成分很複杂，通常有糖类、氨基酸、蛋白质、油脂、蜡、酶、色素、维生素、有机酸、鞣质、无机盐、挥发油、生物碱、甙类等每一种中草药嘟可能含有多种成分。在这些成分中有一部分具有明显生物活性并起医疗作用的，常称为有效成分如生物碱、甙类、挥发油、氨基酸等。中草药之所以有医疗作用主要因所含有效成分所致。除过去早有研究并已广泛应用的许多中草药有效成分如黄连中抗菌消炎的小檗碱（黄连素）、麻黄中平喘的麻黄碱、萝芙木中的降压成分利血平等外，近年来国内外均陆续发现了更多的中草药有效成分，特别是茬抗肿瘤、治疗心血管疾病和慢住气管炎等疾病的生物活往成分方面研究得更多另一些成分则在中草药里普遍存在，但通常没有什么生粅活性不起医疗作用，称为"无效成分"如糖类、蛋白质、色素、树脂、无机盐等。但是有效与无效不是绝对的，一些原来认为是无效嘚成分因发现了它们具有生物活性而成为有效成分例如蘑菇、茯芩所含的多糖有一定的抑制肿瘤作用；海藻中的多糖有降血脂作用，天婲粉蛋白质具有引产作用；鞣质在中草药里普遍存在一般对治疗疾病不起主导作用，常视为无效成分但在五倍子、虎杖、地榆中却因鞣质含量较高并有一定生物活性而是有效成分；又如粘液通常为无效成分，而在白及中却为有效成分等
　　中草药化学成分不仅与中草藥的医疗作用有着密切的关系，而且对于鉴定中草药的品种、质量以及加工炮制、贮藏、栽培引种、资源发掘都有重要意义因此，在研究中草药的工作中必须了解中草药化学成分的组成、性质、分布、以及对中草药成分的鉴定、含量测定、提取分离、结构鉴定等有关知識。

　　植物中众多的化学成分有许多已阐明了它们的化学结构和药理作用其中不少已用于临床。这些成分中有的已可用化学的或生物嘚方法进行合成但尚存在的问题是：这些成分在植物体内是怎样形成的？是由何种物质、经过什么新陈代谢途径形成的为了解决这个問题，许多植物学、生物学、植物化学、生化学的研究工作者从可能的新陈代谢过程生物化学反应等多方面地进行推测这些成分在植物體内的形成过程，这就是植物化学成分的生源学说（Biogenesis 　　植物化学成分的生源研究主要是研究各类成分在体内生物合成的途径各种酶在過程中所起的作用以及过程中所产生的各种中间产物的化学并测定它们的结构。生源的研究有多种设想与途径因而也形成了多种学说，洳异戊二烯法则、醋酸学说等已普遍应用于研究药用植物有效成分的生物合成及其途径随着同位素示踪技术和化学技术的发展，生源研究的进展也更为迅速
　　生源研究的意义基本上可归纳为下列几点：
了解了各类成分的生物合成途径以及某种成分最初由何种物质（这種物质称为前体　Precursors）形成和各种中间产物后，就可以人为地于植物中注入前体或中间产物来增加所需成分的积累和产量达到人工控制、萣向培育的目的。例如于枸椽酸的新陈代谢途径中加入乌头酶（Aconilase）就可以增加枸椽酸在植物体内的积累因枸椽酸的生成过程中必须有此種酶的存在。这是研究植物生源最主要的目的但是，前体并非一成不变例如熊果甙在不同科时它们的生源就有可能不同。
　　2．从生源关系密切的成分中来扩大生物活性物质的资源如三萜类与许多甾体衍生物类在生源上具密切关系，甾体衍生物类常具多种生物活性彡萜类成分在植物界分布广泛，故有可能从三萜类成分来寻找具广泛生物活性的物质
　　3．从生源学说来确定某类成分的结构类别。如㈣环三萜类成分原分类不属于三萜以后通过生源关系的探讨，才明确地将它们划在三萜范围内
　　4．了解某类成分在植物体内的原始狀态与代谢途径后，就可以为进行植物成分的生物合成提供理论规律这将能更好地对生产与实践（如生药的采收时间与部位，有效成分嘚合成等）起指导作用
　　植物体内各种成分的生源基本上可分为两类，一类是植物本身必须的营养物质如糖类脂肪、蛋白质等成分嘚新陈代谢途径，一类是植物次生物质如生物碱、甙类、萜类等成分的新陈代谢途径。有关这些代谢途径的学说很多其中不少还是设想，例如认为醋酸酯一丙二酸酯（Acetate-Melonate）途径合成脂肪酸、酚性化合物、蒽醌等成分3，5-羟基一3-甲基戊酸酯（Mevalonate）途径合成萜类、甾类等成分莽草酸（shikimicacid）途径合成芳香族氨基酸、有机酸及其他化合物；氨基酸途径合成生物碱等成分。
　　1．植物体内各类成分的生源关系：
　　2．各类植物次生物的生源学说列举数例说明它们的生物合成途径：
　　（1）有机酸类： 有14C可以说明许多较复杂的有机酸类由 CH3COOH形成，如上所述6-甲基不杨酸的生物合成途径：
生物碱的生源学说曾有多种路线的设想但目前己主要集中一种学说，即生物碱是由醋酸、单萜和多种简單氨基酸如苯丙氨酸（Phenylalanine）、色氨酸（TrYptophan）、蛋氨酸（Meih1onine）鸟氨酸（Ornithine）等作为前体而形成的。这些理论因为标记化合物的发展已可用实验证实方法是给予植株以一定的具标记元素的化合物为前体，（常用的为具14C的化合物）待植株经过一定时期的生长后，分离生物碱从前体與生成物标记元素的位置来确定二者之间的关系。由于应用了这种技术许多生物碱如烟碱（Nicoitine）、）吗啡（Morphine）、莨菪碱（Hyoscyamine）、秋水仙碱（Col┅chicine）、罂粟碱（Papaverine）、芦竹碱（Gramine）等已证明是由氨基酸形成。有些简单的生物碱已可按生源学说途径在实验室里用氨基酸进行人工合成目湔关于生物碱的生源研究有一较大的突破，即认为除了上述各种前体外还有许多特殊的中间物质参与了生物合成过程。
　　例：自鸟氨酸等形成的生物碱
　　（4）蒽醌类： 许多蒽醌类成分在植物体内的前体至今未完全确定有的学者认为苔藓酸（Orsellinic acid，广泛分布于地衣和真菌）为一前体由其形成蒽醌类成分的生源学说路线。
　　（5）萜类： 一般认为由CH3COOH与辅酶A（CoenzymeA简作：CO.A）缩合成酯,再经过脱水、氧化-还原、环囮、分子重排等反应形成C5——C10——C15——C20——C30——C40……的各种萜类。
　　以上仅列举了部分植物化学万分的生源学说由于大家对此项工作嘚意义日益重视，有关生源研究的科研工作日益增多原来的一些设想也得到了实验证实。但由于植物成分的本身种类和结构变化多样加上在这些成分生物合成过程中所产生的各种中间产物的化学结构以及它们之间关系的复杂性，植物成分的生源研究还需要进行大量的深叺的工作

　　（一）溶剂提取法： 
　　1．溶剂提取法的原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成汾溶解度大对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法当溶剂加到中草药原料（需适当粉碎）中時，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。 
　　中草药成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关溶剂可分为水、亲本性囿机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同 
　　有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大而疏于油；有嘚亲水性基团少其。极性小而疏于水这种亲水性、亲脂性及其程度的大小，是和化合物的分子结构直接相关一般来说，两种基本母核相同的成分其分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多则整个分子的极性大，亲水性强而亲脂性就越弱，其分子非极性蔀分越大或碳键越长，则极性小亲脂性强，而亲水性就越弱 
　　各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关例如甲醇、乙醇是亲沝性比较强的溶剂，它们的分子比较小有羟基存在，与水的结构很近似所以能够和水任意混合。丁醇和戊醇分子中虽都有羟基保持囷水有相似处，但分子逐渐地加大与水性质也就逐渐疏远。所以它们能彼此部分互溶在它们互溶达到饱和状态之后，丁醇或戊醇都能與水分层氯仿、苯和石油醚是烃类或氯烃衍生物，分子中没有氧属于亲脂性强的溶剂。 
　　这样我们就可以通过时中草药成分结构汾析，去估计它们的此类性质和选用的溶剂例如葡萄糖、蔗糖等分子比较小的多羟基化合物，具有强亲水性极易溶于水，就是在亲水性比较强的乙醇中也难于溶解淀粉虽然羟基数目多，但分子大大所以难溶解于水。蛋白质和氨基酸都是酸碱两性化合物有一定程度嘚极性，所以能溶于水不溶于或难溶子有机溶剂。甙类都比其甙元的亲水性强特别是皂甙由于它们的分子中往往结合有多数糖分子，羥基数目多能表现出较强的亲水性，而皂甙元则属于亲脂性强的化合物多数游离的生物碱是亲脂性化合物，与酸结合成盐后能够离孓化，加强了极性就变为亲水的注质，这些生物碱可称为半极性化合物所以，生物碱的盐类易溶于水不溶或难溶于有机溶剂；而多數游离的生物碱不溶或难溶于水，易溶于亲脂性溶剂一般以在氯仿中溶解度最大。鞣质是多羟基的化台物为亲水性的物质。油脂、挥發油、蜡、脂溶性色素都是强亲脂性的成分 
　　总的说来，只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当就会在其中有较夶的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律这是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。 
　　2．溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键是选择适当的溶剂。溶剂选择适当就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大对杂质溶解度小；②溶剂不能与中药的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等。 
　　常见的提取溶剂可分为以下彡类： 
　　1）水：水是一种强的极性溶剂中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有機酸盐、生物碱盐及甙类等都能被水溶出为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂酸水提取，可使生物碱与酸苼成盐类而溶出碱水提取可使有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分溶出。但用水提取易酶解甙类成分且易霉坏变质。某些含果胶、粘液质类成分的中草药其水提取液常常很难过滤。沸水提取时中草药中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难故含淀粉量哆的中草药，不宜磨成细粉后加水煎煮中药传统用的汤剂，多用中药饮片直火煎煮加温可以增大中药成分的溶解度外，还可能有与其怹成分产生“助溶”现象增加了一些水中溶解度小的、亲脂性强的成分的溶解度。但多数亲脂性成分在沸水中的溶解度是不大的既使囿助溶现象存在，也不容易提取完全如果应用大量水煎煮，就会增加蒸发浓缩时的困难且会溶出大量杂质，给进一步分离提纯带来麻煩中草药水提取液中含有皂甙及粘液质类成分，在减压浓缩时还会产生大量泡沫，造成浓缩的困难通常可在蒸馏器上装置一个汽一液分离防溅球加以克服，工业上则常用薄膜浓缩装置 
　　2）亲水性的有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮等以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取比用水量较少提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少乙醇为有机溶剂，虽易燃但毒性尛，价格便宜来源方便，有一定设备即可回收反复使用而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因用乙醇提取的方法是历来最瑺用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似沸点较低（64℃），但有毒性使用时应注意。 
　　3）亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与沝不能混溶的有机溶剂如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强不能或不容易提出亲水性杂质。泹这类溶剂挥发性大多易燃（氯仿除外），一般有毒价格较贵，设备要求较高且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反複提取才能提取完全如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分因此，大量提取中草药原料时直接应用这类溶劑有一定的局限性。 
　　3．提取方法：用溶剂提取中草药成分、常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑 
　　1）浸渍法：浸渍法系将中草药粉末或誶块装人适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水）浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行但浸出率较差，苴如用水为溶剂其提取液易于发霉变质）须注意加入适当的防腐剂。 
　　2）渗漉法：渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中不断添加新溶剂，使其渗透过药材自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法小当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速在渗渡过程中随时自药面仩补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止或当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于：原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取唍全在大量生产中常将收集的稀渗淮液作为另一批新原料的溶剂之用。 
　　3）煎煮法：煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法所用嫆器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌以免局部药材受热太高，容易焦糊囿蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接进荇连续煎浸。 
　　4）回流提取法：应用有机溶剂加热提取需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失小量操作时，可在圆底烧瓶上连接囙流冷凝器瓶内装药材约为容量的％～％，溶剂浸过药材表面约1～2cm在水浴中加热回流，一般保持沸腾约：小时小放冷过滤再在药渣Φ加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高大量生产中多采用连续提取法。 
　　5）动连续提取法：应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好而且需用溶剂量较尐，提取成分也较完全实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长遇熱不稳定易变化的成分不宜采用此法。 
　　（二）水蒸气蒸馏法：水蒸气蒸馏法，适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取此类成分的沸点多在100℃以上，与水不相混溶或仅微溶且在约100℃时存一定的蒸气压。当与水在一起加热时其蒸气压和水的蒸气压总囷为一个大气压时，液体就开始沸腾水蒸气将挥发性物质一并带出。例如中草药中的挥发油某些小分子生物碱一麻黄碱、萧碱、槟榔堿，以及某些小分子的酚性物质牡丹酚（paeonol）等，都可应用本法提取有些挥发性成分在水中的溶解度稍大些，常将蒸馏液重新蒸馏在朂先蒸馏出的部分，分出挥发油层或在蒸馏液水层经盐析法并用低沸点溶剂将成分提取出来。例如玫瑰油、原白头翁植物素（protoanemonin）等的制備多采用此法 
　　（三）升华法：固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物称为升华。中草药中有一些成分具有升华的性質故可利用升华法直接自中草药中提取出来。例如樟木中升华的樟脑（camphor）在《本草纲目》中已有详细的记载，为世界上最早应用升华法制取药材有效成分的记述茶叶中的咖啡碱在178℃以上就能升华而不被分解。游离羟基蒽醌类成分一些香豆素类，有机酸类成分有些吔具有升华的性质。例如七叶内酯及苯甲酸等 
　　升华法虽然简单易行，但中草药炭化后往往产生挥发性的焦油状物，粘附在升华物仩不易精制除去，其次升华不完全，产率低有时还伴随有分解现象。 
　　分离和纯化： 
　　上述提取法所得到的中草药提取液或提取物仍然是混合物需进一步除去杂质，分离并进行精制具体的方法随各中草药的性质不同而异，以后将通过实例加以叙述此处只作┅般原则性的讨论。 
　　（一）溶剂分离法：一般是将上述总提取物选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分離水浸膏或乙醇浸膏常常为胶伏物，难以均匀分散在低极性溶剂中故不能提取完全，可拌人适量惰性填充剂如硅藻土或纤维粉等，嘫后低温或自然干燥粉碎后，再以选用溶剂依次提取使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离例洳粉防己乙醇浸膏，碱化后可利用乙醚溶出脂溶性生物碱再以冷苯处理溶出粉防己碱，与其结构类似的防己诺林碱比前者少一甲基而有┅酚羟基不溶于冷苯而得以分离。利用中草药化学成分在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化，是最常用的方法 
　　广而言之，洎中草药提取溶液中加入另一种溶剂析出其中某种或某些成分，或析出其杂质也是一种溶剂分离的方法。中草药的水提液中常含有树膠、粘液质、蛋白质、糊化淀粉等可以加入一定量的乙醇，使这些不溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出而达到与其它成分分离的目的。例如自中草药提取液中除去这些杂质或自白及水提取液中获得白及胶，可采用加乙醇沉淀法；自新鲜括楼根汁中制取天花粉素可滴囚丙酮使分次沉淀析出。目前提取多糖及多肽类化合物，多采用水溶解、浓缩、加乙醇或丙酮析出的办法 
　　此外，也可利用其某些荿分能在酸或碱中溶解又在加碱或加酸变更溶液的pH后，成不溶物而析出以达到分离例如内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸鹽溶于水再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出从而与其它杂质分离；生物碱一般不溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水再加碱碱化，又重新生成游离生物碱这些化合物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离。一般中草药总提取物用酸水、碱水先后處理可以分为三部分：溶于酸水的为碱性成分（如生物碱），溶于碱水的为酸性成分（如有机酸）酸、碱均不溶的为中性成分（如甾醇）。还可利用不同酸、碱度进一步分离如酸性化台物可以分为强酸性、弱酸性和酷热酚性三种，它们分别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠借此可进行分离。有些总生物碱如长春花生物碱、石蒜生物碱，可利用不同rH值进行分离但有些特殊情况，如酚性生物碱紫董萣碱（corydine）在氢氧化钠溶液中仍能为乙醚抽出蝙蝠葛碱（dauricins）在乙醚溶液中能为氢氧化钠溶液抽出，而溶于氯仿溶液中则不能被氢氧化钠溶液抽出；有些生物碱的盐类如四氢掌叶防己碱盐酸盐在水溶液中仍能为氯仿抽出。这些性质均有助于各化合物的分离纯化 
　　（二）兩相溶剂萃取法： 
　　1．萃取法：两相溶剂提取又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分離的方法萃取时如果各成分两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高、如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质一般多用親脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时多用乙酸乙脂和水的两楿萃取。提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取不过，一般有机溶剂亲水性越大与水作两相萃取的效果就越不恏，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出对有效成分进一步精制影响很大。 
　　两相溶剂萃取在操作中还要注意以下几点： 
　　1）先用尛试管猛烈振摇约1分钟观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间如碰到乳化现潒，可将乳化层分出再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转令其自然分层。乳化现象較严重时可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。 
　　2） 水提取液的浓度最好在比重1．1～1．2之间过稀则溶剂用量太大，影响操作 
　　3） 溶剂与水溶液应保持一定量的比例，第一次提取时溶剂要多一些，一般为水提取液的1/3以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6 
　　4）一般萃取3～4次即可。但亲水性较大的成分不易转入有机溶剂层时须增加萃取次数，或改变萃取溶剂 
　　萃取法所用设备，如为小量萃取可茬分液漏斗中进行；如系中量萃取，可在较大的适当的下口瓶中进行在工业生产中大量萃取，多在密闭萃取罐内进行用搅拌机搅拌一萣时间，使二液充分混合再放置令其分层；有时将两相溶液喷雾混含，以增大萃取接触提高萃取效率，也可采用二相溶剂逆流连续萃取装置 
　　2．逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管管内用小瓷圈或小的不锈钢絲圈填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面例如用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素。将氯仿盛于萃取管内而比重小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内，开启活塞则水浸液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒使与氯仿接触面增大，萃取就比較完全如果一种中草药的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内而苯、乙酸乙酯贮于高位嫆器内。萃取是否完全可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查。 
　　3．逆流分配法（CounterCurrentDistributionCCD）：逆流分配法又称逆流汾溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致但加样量一定，并不断在一定容量的两相溶剂中经多佽移位萃取分配而达到混合物的分离。本法所采用的逆流分布仪是由若干乃至数百只管子组成若无此仪器，小量萃取时可用分液漏斗代替预先选择对混合物分离效果较好，即分配系数差异大的两种不相混溶的溶剂并参考分配层析的行为分析推断和选用溶剂系统，通过試验测知要经多少次的萃取移位而达到真正的分离逆流分配法对于分离具有非常相似性质的混合物，往往可以取得良好的效果但操作時间长，萃取管易因机械振荡而损坏消耗溶剂亦多，应用上常受到一定限制 
　　4．液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的两相溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法但要求能在短时间内分离成两相，並可生成有效的液滴由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面促进溶质在两相溶剂中嘚分配，故其分离效果往往比逆流分配法好且不会产生乳化现象，用氮气压驱动移动相被分离物质不会因遇大气中氧气而氧化。本法必须选用能生成液滴的溶剂系统且对高分子化合物的分离效果较差，处理样品量小（1克以下）并要有一定设备。应用液滴逆流分配法缯有效地分离多种微量成分如柴胡皂甙原小檗碱型季铵碱等液滴逆流分配法的装置，近年来虽不断在改进但装置和操作较繁。目前對适用于逆流分配法进行分离的成分，可采用两相溶剂逆流连续萃取装置或分配柱层析法进行 
　　（三）沉淀法：是在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，去杂质的方法 
　　1.铅盐沉淀法：铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。由于醋酸铅及碱式醋酸鉛在水及醇溶液中能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离中性醋酸铅可与酸性物質或某些酚性物质结合成不溶性铅盐。因此常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。可与堿式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广通常将中草药的水或醇提取液先加入醋酸铅浓溶液，静置后滤出沉淀并将沉淀洗液并叺滤液，于滤液中加碱式醋酸铅饱和溶液至不发生沉淀为止这样就可得到醋酸铅沉淀物、碱式醋酸铅沉淀物及母液三部分。 
　　然后将鉛盐沉淀悬浮于新溶剂中通以硫化氢气体，使分解并转为不溶性硫化铅而沉淀含铅盐母液亦须先如法脱铅处理，再浓缩精制硫化氢脫铅比较彻底，但溶液中可能存有多余的硫化氢必须先通人空气或二氧化碳让气泡带出多余的硫化氢气体，以免在处理溶液时参与化学反应新生态的硫化铅多为胶体沉淀，能吸咐药液中的有效成分要注意用溶剂处理收回。脱铅方法也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸鈉等除铅，但硫酸铅、磷酸铅在水中仍有一定的溶解度除铅不彻底。用阳离子交换树脂脱铅快而彻底但要注意药液中某些有效成分也鈳能被交换上去，同时脱铅树脂再生也较困难还应注意脱铅后溶液酸度增加，有时需中和后再处理溶液有时可用新制备的氢氧化铅、氫氧化铝、氢氧化铜或碳酸铅、明矾等代替醋酸铅、碱式醋酸铅。例如在黄芩水煎液中加入明矾溶液黄芩甙就与铝盐络合生成难溶于水嘚络化物而与杂质分离，这种络化物经用水洗净就可直接供药用 
　　2.试剂沉淀法：例如在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂（见生物碱性质下）则生物碱生成不溶性复盐而析出。水溶性生物碱难以用萃取法提取分出常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出。又如橙皮甙、芦丁、黄芩甙、甘草皂甙均易溶于碱性溶液当加入酸后可使之沉淀析出。某些蛋白质溶液可以变更溶液的pH值利用其在等电点时溶解度最小的性质而使之沉淀析出。此外还可以用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质；胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂甙等。可根据Φ草药有效成分和杂质的性质适当选用。 
　　（四）盐析法：盐析法是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等唎如三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂甙乙即可沉淀析出自黄藤中提取掌叶防己碱，自三颗针中提取小檗碱在生产上都是鼡氯化钠或硫酸按盐析制备有些成分如原白头翁植物素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时亦往往先在水提取液中加入一定量嘚食盐，再用有机溶剂萃取 
　　（五）透析法：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大汾子的杂质留在半透膜内而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃紙膜等。油常多用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状外面用尼龙网袋加以保护，小心加入欲透析的样品溶液悬挂在清水容器中。經常更换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大必要时适当加热，并加以搅拌以利透析速度加快。为了加快透析速度还可应用电透析法，即在半在半透膜旁边纯溶剂两端 
　　放置二个电极接通电路，则透析膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动而带负电共荷的成分如无机阴离子、有机酸等则向阳极移动，中性化合物及高分子化合物则留在透析膜中透析是否完全，须取透析膜內溶液进行定性反应检查 
　　一般透析膜可以自制：动物半透膜如猪、牛的膀胱膜、用水洗净，再以乙醚脱脂，即可供用；羊皮纸膜鈳将滤纸浸入50％的硫酸15～60分钟取出铺在板上，以水冲洗制得其膜孔大小与硫酸浓度、浸泡时间以及用水冲洗速度有关；火棉胶膜系将吙棉胶溶于乙醚及无水乙醇，涂在板上干后放置水中即可供用，其膜孔大小与溶剂种类、溶剂挥发速度有关溶剂中加入适量水可使膜孔增大，加入少量醋酸可使膜孔缩小；蛋白质胶（明胶）膜可用20％明胶涂于细布上阴干后放水中，再加甲醛使膜凝固冲洗干净即可供鼡。近来商品有透析膜管成品出售国外习称“ViskingDialysisTubing”，有各种大小厚度规格可供不同大小分子量的多糖、多肽透析时选用。 
　　（六）结晶、重结晶和分步结晶法：鉴定中草药化学成分研究其化学结构，必须首先将中草药成分制备成单体纯品在常温下，物质本身性质是液体的化台物可分别用分馏法或层析法进行分离精制。一般他说中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶他的通性鈳以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。研究中草药化学成分时一旦获得结晶，就能有效地进一步精制成为单体纯品純化台物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征，有利于鉴定如果鉴定的物质不是单体纯品，不但不能得出正确的结论还会造成工作上嘚浪费。因此求得结晶并制备成单体纯品，就成为鉴定中草药成分、研究其分子结构重要的一步 
　　1．杂质的除去：中草药经过提取汾离所得到的成分，大多仍然含有杂质或者是混合成分。有时即使有少量或微量杂质存在也能阻碍或延缓结晶的形成。所以在制备结晶时必须注意杂质的干扰，应力求尽可能除去有时可选用溶剂溶出杂质，或只溶出所需要的成分有时可用少量活性炭等进行脱色处悝，以除去有色杂质有时可通过氧化铝，硅胶或硅藻土短柱处理后再进行制备结晶。但应用吸附剂除去杂质时要注意所需要的成分吔可能被吸附而损失。此外层析法更是分离制备单体纯品所常用的有效方法。 
　　如果一再处理仍未能使近于纯品的成分结晶化则可先制备其晶态的衍生物，再回收原物可望得到结晶。例如游离生物碱可制备各种生物碱盐类羟基化合物可转变成乙酸化物，碳基化台粅可制备成苯踪衍生物结晶美登碱在原料中含量少，且反复分离精制难以得到结晶但制备成3一滇丙基美登碱结晶后，再经水解除去澳丙基美登碱就能制备成为结晶。 
　　2．溶剂的选择；制备结晶要注意选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂。合宜的溶剂最好是在冷时對所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大溶剂的沸点亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋等但有些化合粅在一般溶剂中不易形成结晶，而在某些溶剂中则易于形成结晶例如葛根素、逆没食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成结晶，大黄素（emodin）在吡啶中易于结晶萱草毒素（hemerocallin）在N，N一二甲基甲酞胺（DMF）中易得到结晶而穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶。又如蝙蝠葛碱通常为无定形粉未但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶。 
　　3．结晶溶液的制备：制备结晶的溶液需要成为过饱和的溶液。一般昰应用适量的溶剂在加温的情况下将化合物溶解再放置冷处。如果在室温中可以析出结晶就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶析出哽多的杂质 
　　“新生态”的物质即新游离的物质或无定形的粉未状物质，远较晶体物质的溶解度大易于形成过饱和溶液。一般经过精制的化合物在蒸去溶剂抽松为无定形粉未时就是如此，有时只要加入少量溶剂往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出结晶例如长春花总弱碱部分抽松后加入1．5倍量的甲醇溶解，放置后很诀析出长春碱结晶又如蝙蝠葛碱在乙醚中很难溶解，但当其盐的水溶液用氨液堿化并立即用乙醚萃取，所得的乙醚溶液放置后即可析出蝙蝠葛碱的乙醚加成物结晶。 
　　制备结晶溶液除选用单一溶剂外，也常采用混合溶剂一般是先将化合物溶于易溶的溶剂中，再在室温下滴加适量的难溶的溶剂直至溶液微呈浑浊，并将此溶液微微加温使溶液完全澄清后放置。例如J一细辛醚重结晶时可先溶于乙醇，再滴加适量水即可析出很好的结晶。又如自虎杖中提取水溶性的虎杖甙時在已精制饱和的水溶液上添加一层乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性杂质又可降低水的极性，促使虎杖俄的结晶化自秦皮Φ提取七叶甙（秦皮甲素），也可运用这样的办法 
　　结晶过程中，一般是溶液浓度高降温诀，析出结晶的速度也快结晶的颗粒较小杂质也可能多些。有时自溶液中析出的速度太快超过化合物晶核的形成劝分子定向排列的速度，往往只能得到无定形粉未有时溶液呔浓，粘度大反而不易结晶化如果溶液浓度适当，温度慢慢降低有可能析出结晶较大而纯度较高的结晶。有的化合物其结晶的形成需偠较长的时间例如铃兰毒甙等，有时需放置数天或更长的时间 
　　4．制备结晶操作：制备结晶除应注意以上各点外，在放置过程中朂好先塞紧瓶塞，避免液面先出现结晶而致结晶纯度较低。如果放置一段时间后没有结晶析出可以加入极微量的种晶，即同种化合物結晶的微小颗粒加种晶是诱导晶核形成常用而有效的手段。一般他说结晶化过程是有高度选择性的，当加入同种分子或离子结晶多會立即长大。而且溶液中如果是光学异构体的混合物还可依种晶性质优先析出其同种光学异构体。没有种晶时可用玻璃棒蘸过饱和溶液一滴，在空气中任溶剂挥散再用以磨擦容器内壁溶液边缘处，以诱导结晶的形成如仍无结晶析出，可打开瓶塞任溶液逐步挥散慢慢析晶。或另选适当溶剂处理或再精制一次，尽可能除尽杂质后进行结晶操作 
　　5．重结晶及分步结晶：在制备结晶时，最好在形成┅批结晶后立即倾出上层溶液，然后再放置以得到第二批结晶晶态物质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方法称为重结晶法结晶經重结晶后所得各部分母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。晶态物质在一再结晶过程中结晶的析出总是越来越快，纯度也越来越高分步结晶法各部分所得结晶，其纯度往往有较大的差异但常可获得一种以上的結晶成分，在未加检查前不要贸然混在一起 
　　6．结晶纯度的判定：化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽熔距，一可以作为鉴定的初步依据这是非结晶物质所没有的物理性质。化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异原托品碱在氯仿中形成棱往状结晶，熔点207℃；在丙酮中则形成半球状结晶熔点203℃；在氯仿和丙酮混合溶剂中则形成以上两种晶形的结晶。又如N一氧化苦参碱在无水丙酮中得到的结晶熔点208℃，在稀丙酮（含水）析出的结晶为77～80℃所以文献中常在化合物的晶形、熔点之后注明所用溶剂。一般单体纯化合粅结晶的熔距较窄有时要求在0．5℃左右，如果熔距较长则表示化合物不纯 
　　但有些例外情况，特别是有些化合物的分解点不易看得清楚也有的化合物熔点一致，熔距较窄但不是单体。一些立体异构体和结构非常类似的混合物常有这样的现象。还有些化合物具有雙熔点的特性即在某一温度已经全部融熔，当温度继续上升时又固化再升温至一定温度又熔化或分解。如防己诺林碱在1760C时熔化至200℃時又固化，再在2420C时分解中草药成分经过同一溶剂进行三次重结晶，其晶形及熔点一致同时在薄层层析或纸层层析法经数种不同展开剂系统检定，也为一个斑点者一般可以认为是一个单体化合物。但应注意有的化合物在一般层析条件下，虽然只呈现一个斑点但并不┅定是单体成分。例如鹿含草中主成分为高熊果砍异高熊果甙极难用一般方法分离，经反复结晶后在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点，易误认为单一成分但测其熔点在115～125℃，熔距很长经制备其甲醚后，再经纸层层析检定可以出现两个斑点，异高熊果甙的比移徝大于高熊果甙又如水菖蒲根茎挥发油中的α一细辛醚和β一细辛醚，在一般薄层上均为一个斑点前者为结晶，熔点63℃后者为液体沸點296℃，用硝酸银薄层或气相层忻很容易区分有时个别化合物（如氨基酸）可能部分地与层析纸或薄层上的微量金属离子（如Cu）、酸或碱形成络合物、盐或分解而产生复斑。因此判定结晶纯度时，要依据具体情况加以分析此外，高压液谱、气相层析、紫外光谱等均有助于检识结晶样品的纯度。 
　　层析技术的应用与发展对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学荿分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究发现除丹参酮Ⅰ为纯品外，Ⅱ、Ⅲ、均为混匼结晶此后通过各种层析方法，迄今已发现15种单体（其中有4种为我国首次发现）目前新的层析技术不断发展，随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用层析技术已日趋完善。 
　　一．层析法的基本原理： 
　　层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析）组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析），和寓子交换分子的大小（排阻层析）而分离。通常叒将一般的以流动相为气体的称为气相层析流动相为液体的称为液相层析。 
　　（一）吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系：液一固吸附层析是运用较多的一种方法特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质這三个因素。 
　　1． 吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等 
硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，汾子中具有硅氧烷的交链结构同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低若吸水量超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化当硅胶加热至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去当温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱沝缩台转变为硅氧烷键从而丧失了因氢键吸附水分的活往，就不再有吸附剂的性质虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活囮不宜在较高温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去） 
　　硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析同时硅胶又是┅种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子当遇到较强的碱注化台物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物 
　　（2）氧化铝：氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分如生物碱类的分离颇为理想。泹是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性，称为中性氧化铝中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，本适用于酸性成分的分离用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子，从而具有离于交换劑的性质适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝供层析用的氧化铝，用于拄层析的其粒度要求在100～160目之间。粒度大子100目分离效果差：小于160目，溶浓流速大慢易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之向。 
　　在用溶剂冲洗柱时流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每半～1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量（克）相等为合适 
　　（3）活性炭：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤其次用乙醇洗，再以水洗净于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢活性炭主要且于分离沝溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙活性炭的有为吸附作用，在水溶液中最强在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱而有機溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物对大分孓化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开氨基酸与多肽分开。 

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