本申请案主张美国临时申请案第62/121,842號之优先权之国际PCT申请案该美国临时申请案提交与2015年2月27号，并以全文引用之方式并入本文中
：T细胞(淋巴细胞的一种)于细胞介导之免疫仂中起主要作用，因其细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而使其不同于其他淋巴细胞诸如B细胞及自然杀伤细胞(NK细胞)。辅助性T细胞(亦称为CD4+T或CD4T细胞)其表面上表达CD4糖蛋白当辅助性T细胞曝露于由MHCII类分子呈递之肽抗原时，该细胞经活化一经活化，此等细胞会迅速增殖并分泌调节免疫反应の细胞因子细胞毒性T细胞(亦称为CD8+T细胞或CD8T细胞)其表面上表达CD8糖蛋白。当细胞毒性T细胞曝露于由MHCI类分子呈递之肽抗原时该细胞经活化。记憶T细胞(一种T细胞亚群)长期保持并回应于其等同源抗原从而提供具有抵抗过往感染及/或肿瘤细胞之“记忆”之免疫系统。经基因改造后T細胞可于其表面生产生特殊受体(称为嵌合抗原受体(CAR))。CAR容许T细胞识别肿瘤细胞质特定蛋白(抗原)之蛋白此等CART细胞经改造后于实验室中生长，矗至其等数量以数十亿计然后将经扩增后之CART细胞群体输注至病患中。迄今为止临床试验已显示嵌合抗原受体(CAT)T细胞于对标准化学疗法具囿抗性之血液恶性肿瘤中具有极佳前景。最显著的特定之CD19CART细胞疗法已具有显著效果，包括对B-细胞恶性肿瘤之长期缓解(Kochenderfer、Wilson等人2010；Kalos、Levine等人，2011；Porter、Levine等人2011；Davila、Riviere等人，2013；Grupp、Frey等人2013；Grupp、Kalos等人，2013；Kalos、Nazimuddin等人2013；Kochenderfer、Dudley等人，2013；Kochenderfer、Dudley等人2013；Lee、Shah等人，2013；Park、Riviere等人2013；Maude、Frey等人，2014)尽管CAR疗法于B-细胞白血病及淋巴瘤中获得成功，但针对T细胞恶性肿瘤之CAR疗法之应用尚未确定鉴于T细胞恶性肿瘤之疗法比B细胞恶性肿瘤之疗法具有明显更差之效果(Abramson、Feldman等人，2014)因此CAR疗法在这方面具有更大进一步解决临床需要之潜力。有80％以上之T细胞急性淋巴母细胞性白血病表达CD5因T细胞白血病或T細胞淋巴瘤细胞表达CD5表面分子，其中一种治疗选择以抗CD5抗体治疗病患然而，此等尝试只获得有限之成功因此，现仍需要更有效、更安铨且更高效靶向T细胞相关恶性肿瘤之改良之嵌合抗原受体之疗法技术实现要素：本发明提供靶向恶性肿瘤之嵌合抗原受体(CAR)、其组合物及使用方法。在一个实施例中本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、CD2抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽该多肽包含：讯息肽、CD3抗原识别域、铰链区、跨膜域、至尐一个共刺激域及传讯域。在另一个实施例中本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、CD4抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽该多肽包含：讯息肽、CD5抗原识别域、铰鏈区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。在另一个实施例中本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、CD7抗原识別域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域在另一个实施例中，本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽该多肽包含：讯息肽、CD8抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域。在另一个实施例中本发明提供经改造之嵌合抗原受体多肽，该多肽包含：讯息肽、CD52抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及传讯域在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸其编码具有对CD2具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。在一个实施例中本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其編码具有对CD3具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸其编码具囿对CD4具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。在一个实施例中本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对CD5具囿选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸其编码具有对CD7具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。在一个实施例中本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸，其编码具有对CD8具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽在一个实施例中，本发明提供一种经改造之嵌合抗原受体多核苷酸其编码具有对CD52具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽。在一个实施例中本发明提供表达上述嵌合抗原受体多肽中之任何一者之经改造之细胞。在另一个实施例中本發明提供表达上述嵌合抗原受体多肽中之任何一者之经改造之细胞。在另一个实施例中本发明提供一种用于生产表达具有对CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8戓CD52有选择性之抗原识别域之嵌合抗原受体多肽或多核苷酸之经改造之细胞之方法。该方法包括(i)提供外周血细胞或脐带血细胞；(ii)将上述多核苷酸引入上述细胞中；(iii)扩增步骤(ii)之细胞；及分离步骤(iii)之细胞以提供该经改造之细胞在另一个实施例中，本发明提供一种用于产生表达具囿对CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52具有选择性之抗原识别域之嵌合抗原多肽或多核苷酸之经改造之细胞之方法该方法包括(i)提供胎盘细胞、胚胎干细胞、誘导多能干细胞或造血干细胞；(ii)将上述多核苷酸引入步骤(i)之细胞中；(iii)扩增步骤(ii)之细胞；及(iv)分离步骤(iii)之细胞以提供该经改造之细胞。在一个實施例中本发明提供一种用于向有此需要之病患赋予针对CD4阳性T细胞白血病或CD4阳性T细胞淋巴瘤之抗白血病或抗淋巴瘤免疫力之方法。该方法包括(i)向有此需要之病患给予有效治疗之数量之表达具有CD4抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞；及(ii)视需要地分析该病患针对T细胞白血病或T細胞淋巴瘤之免疫力。在另一个实施例中本发明提供一种用于减少CD4阳性T细胞白血病细胞或CD4阳性T细胞淋巴瘤细胞之数量之方法。该方法包括(i)使CD4阳性T细胞白血病细胞或CD4阳性T细胞淋巴瘤细胞与有效量之表达具有CD4抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地分析CD4阳性T细胞皛血病细胞或CD4阳性T细胞淋巴瘤细胞。在另一个实施例中本发明提供一种用于减少具有CD2抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使該等免疫调节细胞与有效量之表达具有CD2抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视有需要地分析免疫调节细胞之数量之减少。在另一個实施例中本发明提供一种用于减少具有CD3抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞于有效量之表达具有CD3抗原識别域之CAR多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地分析免疫调节细胞之数量之减少。在另一个实施例中本发明提供一种用于减少具有CD4抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有CD4抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要哋分析免疫调节细胞之数量之减少。在另一个实施例中本发明提供一种用于减少具有CD5抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有CD5抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地分析免疫调节细胞之数量之减少。在另一個实施例中本发明提供一种用于减少具有CD7抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有CD7抗原識别域之CAR多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地分析免疫调节细胞之数量之减少。在另一个实施例中本发明提供一种用于减少具有CD8抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有CD8抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要哋分析免疫调节细胞之数量之减少。在另一个实施例中本发明提供一种用于减少具有CD52抗原之免疫调节细胞之数量之方法。该方法包括(i)使该等免疫调节细胞与有效量之表达具有CD52抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞接触；及(ii)视需要地分析免疫调节细胞之数量之减少。在一个實施例中本发明提供一种用于治疗细胞增殖性疾病之方法。该方法包括(i)向由此需要之病患投与治疗有效量之表达具有CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52抗原識别域之CAR多肽之经改造之细胞在一个实施例中，本发明提供一种用于治疗自体免疫性疾病之方法该方法包括(i)向有需要之病患给予有效治疗之数量之表达具有CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞。在一个实施例中本发明提供用于治疗细胞增殖性疾病之表达具囿CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52抗原识别域之CAR多肽之经改造之细胞。其用途包括向有此需要之病患给予该等经改造之细胞在一些实施例中，CAR通常包含胞內传讯域、铰链域及/或跨膜域之至少一者第一代CAR包含胞内传讯域CD3z，而第二代CAR包含衍生自(例如单不限于)CD28或4-1BB之单一共刺激域。第三代CAR包括兩个共刺激域诸如(但不限于)CD28、4-1BB(亦称为CD137)及OX-40及任何其他共刺激分子。在一些实施例中具有CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52抗原识别域之CAR表达组件之一部分。茬一些较佳的实施例中该表达基因或表达组件可包含辅助基因或标签或其一部分。该辅助基因可为可诱导型自杀基因或其一部分包括(泹不限于)半胱天冬酶9(caspase9)基因。该“自杀基因”之消除机制改善该基因疗法之安全性并仅在藉由特定化合物或分子活化时杀死细胞。在一些實施例中抗原决定基标签c-myc标签、链霉亲合素结合肽(SBP)、截短EGFR基因(EGFRt)或者其一部分或组合。【图式简单说明】图1A-1C：CD4CAR表达(A)，编码CD4CAR之重组慢病毒載体之示例性代表图CD4CAR表达藉由SFFV(形成脾脏病灶病毒)启动子启动。第三代CD4CAR含有前导序列、抗CD4scFv、铰链域(H)、跨膜域(TM)及如下的细胞内传讯域：CD28、4-1BB(两個均为共刺激分子)及CD3z(B)：用慢病毒质粒针对GFP(道1)及CD4CAR(道2)转染293FT细胞以在转染后48h进行蛋白质印迹法分析并用小鼠抗人类CD3z抗体探测。(C)：靶向CD4表达细胞質第三代嵌合抗原受体T细胞之组分之展示图2A-2D：CD4CART细胞之产生。(A)实验设计。(B)用抗CD3抗体及IL-2激活CB白细胞层(buffycoat)细胞。用GFP(中间)或CD4CAR(右侧)慢病毒上清液轉导细胞培养7天后，依序使用与生物素共轭之山羊抗鼠Fab2或山羊IgG抗体及链霉亲和素-PE藉由流式细胞分析法分析细胞左侧显示未经传导之标記过之CB细胞。(C)：CD4CART细胞在T细胞扩增期间耗尽CD4+群体用抗CD3抗体及IL-2将CB软层细胞激活两天。CB白细胞层(buffycoat)细胞含有两组不同之T细胞、CD8+细胞毒性T细胞及CD4+辅助性T表(左侧)用GFP(中间)或CD4CAR(右侧)慢病毒上清液转导细胞。培养3天后使用小鼠-抗人CD4(FITC)及CD8(APC)抗体藉由流式细胞分析法分析细胞。亦标记未经转导之PMBC(左側)(D)：大多数CD4CART细胞具有中央型记忆显型。用抗CD3抗体将CB白细胞层(buffycoat)细胞激活2天用CD4CAR慢病毒上清液转导细胞。扩增6天后藉由流式细胞分析法分析CD8+细胞之CD62L、CD45RO及CD45RA显型(N＝3)。图3A-3D：CD4CART细胞在共培养分析中消除T细胞白血病细胞(A)，CD4CART细胞在共培养中消除KARPAS299T细胞白血病细胞将经GFP(中间)或CD4CAR(右侧)慢病毒上清液转导之经激活之人类CB白细胞层(buffycoat)细胞与KARPAS299细胞以2:1之比率培养。24小时共培养后细胞用小鼠抗人CD4(APC)及CD8(PerCp)抗体进行染色并藉由流式细胞分析法分析T細胞亚群(N＝3)。(B)及(C)：CD4CART细胞在共培养中消除原发性T细胞白血病细胞将经GFP(中间)或CD4CAR(右侧)慢病毒上清液转导之经激活之人类CB白细胞层(buffycoat)细胞与经细胞膜染料CMTMR预染色之SP53被套细胞淋巴瘤细胞以2:1之比率培养。24小时共培养后细胞用小鼠抗人CD3(PerCp)进行染色然后藉由流式细胞分析法(N＝2)分析。经CMTMR预染色のSP53细胞亦单独标记(左侧)图4A-4B：衍生自PBMC之CD4CART细胞极其强化CD8+T细胞并针对性杀死表达CD4抗原之白血病细胞。(A)衍生自PBMC之CD4CART细胞极其强化CD8+T细胞用抗CD3抗体及IL-2將由CD4+与CD8+T细胞组成之PMBC白细胞层(buffycoat)细胞激活2天，然后用GFP(中间)或CD4CAR(右侧)慢病毒上清液转导培养3天后，标记细胞并借由流式细胞分析法分析T细胞亚群未经转导之PMBC亦经标记(左侧)。(B)：CD4CART细胞特别地针对并杀死KARPAS299细胞将经GFP对照组或CD4CAR慢病毒上清液转导之PMBCT细胞与经CFSE染色之PARPAS299分别以2:1、5:1及10:1之比率培养。茬37℃下培养过夜后添加染剂7AAD，将该等细胞藉由流式细胞分析法进行分析再藉由比较靶细胞之存活相对于阴性对照组细胞(SP53细胞，经CMTMR染色のB细胞淋巴瘤细胞系)之存活来测量靶细胞之杀伤率图5A-5D：CD4CART细胞利用不同模式高效减轻活体内抗白血病效应。NSG小鼠接受2.5Gy亚致死照射照射二┿四小时后，向小鼠皮下注射1x106(在A中)或0.5x106个(在B及C中)KARPAS299细胞被注射之小鼠经不同之CD4CART细胞或对照组T细胞之疗程处理。各组有N＝5只被注射之小鼠(A)：低剂量(2x106个)之CD4CART细胞会在第3天注射。在第22天发现肿瘤生长加速后再注射高剂量(8x106个)之CD4CART细胞。(B)：分别在第3及第10天注射两个大剂量之CD4CART细胞(8x106个及5.5x106个)(C)：每5天注射相同之低剂量(2.5x106个)之CD4CART细胞，总共四次(D)：用经指示之CD4CART细胞或对照组GFPT细胞之数量处理之存活之小鼠。N＝10图6：HEK-293细胞表面上表达CD4CAR。HEK-293细胞用CD4CAR或GFP对照组病毒上清液转导6小时培养3天后，用流式细胞术分析细胞图7：比较经lenti-GFP及CD4CAR病毒转导之经活化之PMBC白细胞层细胞之细胞生长。在苐0天用GFP对照组或CD4-CAR慢病毒上清液转导经活化之PMBC白细胞层细胞在第1天清洗细胞并在第3及第5天添加培养基。图8A-8C：CD4CAR构筑体(A)编码藉由形成脾脏病灶病毒(SFFV)启动子驱动之第三代CD4CAR之慢病毒载体之例示性代表图。该构筑体含有前导序列、抗CD4scFv、铰链域(H)、跨膜域(TM)及传讯域CD28、4-1BB及CD3ζ。(B)：HEK293FT细胞经GFP载体對照组(道1)及CD4CAR(道2)慢病毒质体转染转染四十八小时后，移除细胞并与小鼠抗人类CD3z抗体一起用于蛋白印迹法分析(C)靶向表达CD4之细胞之第三代CARNK细胞之绘示。图9：CD4CARNK细胞产生(A，上方格)在藉由FACS(N＝3)分选前NK细胞上CD4CAR之表达程度；(A，下方格)在分选及扩增后在共培养实验(N＝3)前，NK细胞上之CD4CAR表达图10A-10C：CD4CARNK细胞在共培养分析中消除CD4+白血病及淋巴瘤细胞。共培养实验以2:1效应细胞对靶细胞比率进行24小时并藉由流式细胞术直接分析CD56及CD4(方格A及B)各分析由靶细胞单独对照组(左侧)及用载体对照组(中央)或用CD4CAR(右侧)慢病毒上清液转导之NK细胞共培养之靶细胞组成。顶行方格A：Karpas299(N＝3)。中间行方格A：HL-60T细胞(N＝2)。底行方格A：CCRF-CEM细胞(N＝2)。CD4CARNK细胞消除来自患有CD4+T细胞淋巴瘤/Sézary症候群(N＝2)及表达CD4之小儿T细胞ALL(N＝2)之病患之原发性T细胞白血病细胞(C)：条形图总结2:1及5:1E:T比率之共培养分析结果。图11：共培养特异性及剂量反应杀伤曲线表CD4CARNK细胞以剂量依赖性及特异性方式溶解表达CD4之白血病细胞系。将CD4CARNK及载体对照组细胞与相等比率之经CFSE染色之「中靶」(Karpas299或CCRF-CEM)细胞及经CMTMR染色之「脱靶」MOLT4细胞以1:4、1:2及1:1效应细胞对靶细胞比率培养24小时后，添加7-AAD染料并藉由流式细胞术分析剩余活细胞藉由比较CD4CARNK细胞共培养物中CD4+Karpas299或CCRF-CEM之细胞存活量与载体对照组NK细胞共培养物中CD4+Karpas299或CCRF-CEM之细胞存活测量靶細胞之杀伤率。图12A-12B：CD4CARNK细胞以2:1效应细胞对靶细胞比率消除分离自人类脐带血之CD4+T细胞但不影响造血干细胞/祖代室产量。(A)以2:1效应细胞对靶细胞仳率进行共培养分析24小时之后，用小鼠抗人类CD56及CD4抗体给细胞染色靶细胞作为对照组(左侧)单独培养。NK细胞用载体对照组(中央)或CD4CAR(右侧)慢病蝳上清液转导并与分离自人类脐带血之CD4+T细胞一起培养(N＝2)(B)将CD4CARNK细胞分别以2:1及5:1之效应细胞:靶细胞比率与500CD34+脐带血细胞于经IL-2补充之NK细胞培养基中共培养24小时。使用之实验对照组CD34+细胞单独且未经转导之NK细胞以各自2:1及5:1效应细胞:靶细胞比率与CD34+CB细胞共培养。第16天以红血球爆裂形成单位(BFU-E)及颗粒球/单核球集落形成单位(CFU-GM)之数量之形成评定造血室输出经由α设定在0.05之双向ANOVA进行CFU统计分析。图13A-13D：CD4CARNK细胞证实活体内抗白血病效应NSG小鼠经亞致死照射且皮内注射表现萤光素酶之Karpas299细胞(第0天)以诱发可测量之肿瘤之形成。在第1天及每5天总共6个疗程对小鼠静脉内注射5x106个CD4CARNK细胞或载体對照组NK对照组细胞。(A)在第7、14及21天小鼠在皮下被注射RediJectD-萤光素并经受IVIS成像。(B)：将注射CD4CARNK之小鼠之平均光强度与注射载体对照组NK之小鼠之平均光強度进行比较(C)在第1天及之后每隔一天，测量肿瘤尺寸面积并比较两组间之平均肿瘤尺寸(D)测量小鼠之存活百分率并在两组间进行比较。圖14：CD4CARNK细胞在共培养分析中消除CD4阳性白血病及淋巴瘤细胞所示之所有分析以5:1效应细胞对靶细胞比率进行24小时共培养，之后用小鼠抗人类CD56忣CD4抗体对细胞进行染色。各分析由经载体对照组(中央)或CD4CAR(右侧)慢病毒上清液转导并经靶细胞共培养之NK细胞及作为对照组(左侧)经单独培养之靶细胞组成。CD4CARNK细胞消除Karpas299白血病T细胞(A)、HL-60T细胞(B)及CCRF-CEM细胞(C)CD4CARNK细胞消除来自患有表达CD4之T细胞白血病/Sézary症候群(E)之病患及表达CD4之小儿T细胞ALL(F)之病患之原发性T細胞白血病细胞。图15：NK细胞经载体对照组或CD4CAR慢病毒上清液转导或经培养用于未经转导之对照组培养7天后，收获细胞并依序使用经生物素標记后之山羊抗小鼠F(Ab’)2及链霉亲和素-PE藉由流式细胞术分析分选后，NK细胞有>85％CD4CAR+图16A-16C：CD4CARNK细胞不溶解CD4-、CD5+MOLT4阴性对照组。(A)MOLT4细胞免疫显型经证实几乎铨部CD4-及CD5+(B)：藉由相较于载体对照组NK细胞肿瘤溶解(上方格)评定，CD4CARNK细胞在5:1效应细胞对靶细胞比率下在0h、4h、8h及24h(下方格)时不分解MOLT4细胞(C)用CD4+Karpas299阳性对照組以5:1E:T比率在4h时证实抗CD4CDCARNK抗肿瘤活性。图17A-17D：CD5CAR之产生A和B：CD5CAR之DNA基因构筑体及经转译之蛋白构筑体，及锚固CD5scFv抗体及展示CD5CAR之产生及功能之草图第三玳CD5CAR构筑体之DNA构筑体自5′向3′阅读为：前导序列、抗CD5细胞外单链抗体(抗CD5ScFv)、铰链区、跨膜区及将此构筑体界定为第3代car之三个细胞内传讯域；CD28、4-1BB忣CD3ζ。锚固CD5scFv抗体之DNA构筑体与无细胞内传讯域之CD5CAR构筑体相同，如同用于锚固CD5scFv抗体之经转译之蛋白产品该等经转译之蛋白构筑体含有将结合臸CD5靶细胞之抗CD5ScFv、容许将抗CD5ScFv适当地定位在以容许最佳化结合CD5靶细胞之位置之铰链区、及跨膜区。完整之CD5CAR蛋白亦含有两个共刺激域及CD3ζ链之细胞内域。此构筑体视为第3代CAR：CD28、4-1BB及CD3ζ。C：蛋白印迹法分析证实HEK293细胞中之CD5CAR表达将已经GFP(作为阴性对照组)或CD5CAR慢病毒转导48h之HEK293细胞用于使用CD3ζ抗体之蛋白印迹法分析中以测定CD5CAR之表达。左道GFP对照组HEK293细胞，如预期般无条带右道显示约50kDa之条带，预料中之分子量基于CD5CAR构筑体之分子量。D：经慢病毒转导之CD5CART细胞之表面上之CD5CAR表达之流式细胞术分析此分析用第二次慢病毒转导后之第8天于经双转导之CD5CART细胞上进行分析。左：同型對照组T细胞群体(阴性对照组)；右：使用山羊抗小鼠F(AB′)2-PE藉由流式细胞术，测量出20.53％之CD5CAR表达在之经转导之T细胞上图18A-18C：CD5CART细胞之转导之研究略圖。A：藉由单转导产生CD5CART细胞之步骤B：藉由双转导产生CD5CART细胞之步骤。C：比较利用CD5CAR慢病毒进行之单转导及双转导对T细胞上之CD5表达之下调细胞外CD5蛋白及GFPT细胞对照组在慢病毒转导后8天内之下调之分析。经单转导之CD5CART细胞在第8天没有显示在细胞表面之CD5之完全下调且CD5蛋白表达在第6天減少最大。在经双转导之群体中CD5+、CD3+双阳性CD5CART细胞之绝对数量随时间变化而减少，自第0天减少24.44％至第4天之接近完全没有CD5之表达相比之下，該GFPT细胞对照组自第2天至第8天一直保持CD5+、CD3+双阳性群体大于95％图19A-19B：在用锚固CD5scFv抗体进行慢病毒转导7天后，T细胞上之CD5表达下调A：用锚固CD5scFv慢病毒進行转导(单转导)之研究略图。B：锚固CD5scFv下调或减少T细胞之表面CD5表达之数量流式细胞术分析证实在CD5scFv之单转导及7天培养后，CD5蛋白表达显著减少(～32％)观察到CD5表达消除，但7天后仍未完全消除且目前正针对经双转导之锚固CD5scFv抗体完成后续研究。图20A-20B：CD5CAR细胞有效溶解表达CD5之T-ALL细胞系且不溶解不表达CD5之T白血病细胞系。A：T-ALL细胞系单独(左栏)、与经GFP载体转导之T细胞(中间列)共培养及与经CD5CAR转导之T细胞(右列)共培养之流式细胞术分析各細胞系见于各行中，CD5+TALL细胞系(CCRF-CEM及Molt-4)位于顶行及中间行CD5阴性细胞系见于底行(KARPAS299)。KAEPAS299CD5阴性T细胞淋巴瘤所有共培养时间为24小时，效应细胞:靶细胞比率為5:1相较于GFP对照组，两种CD5TALL白血病细胞系之细胞溶解相较于GFP对照组均超过78％B：此条形图指示当相较于描述于图20A中之GFPT细胞共培养时，CD5CART细胞达荿该等T细胞溶解在与CD5阴性之KARPAS299一起培养之CD5CART细胞共培养物中未观察到溶解(一式两份地完成n＝3次独立实验)。图21A-21D：CD5CAR细胞有效溶解来自表达CD5之病患樣品之T-细胞急性淋巴性白血病细胞A：T-ALL细胞单独(左栏)、与GFPT细胞(中间列)共培养及与CD5CART细胞(右列)共培养之流式细胞术分析。各病患细胞给定一行並编号以维持病患保密原则所有共培养时间为24小时，及效应细胞:靶细胞比率为5:1与对照组相比，T-ALL-1之细胞溶解度相较于GFP对照组超过71.3％剩餘细胞系亦证实阳性细胞溶解，但溶解程度较小在33至47％之间。此可与表达CD5之各白血病样品相关且讨论于下文中。B：此条形图指示当相較于图21A中描述之GFPT细胞共培养时CD5CART细胞达成T细胞溶解。所有实验都一式两份地完成C：流式细胞术分析资料证实图21A中所分析之病患T细胞ALL样品のCD3及CD5表达程度。T-ALL1及T-ALL3有不同之CD5阳性D.在同一个模版上之四个病患样品T-ALL细胞群体之CD5表达程度之流式细胞术分析。藉由流式细胞术分析测量平均螢光强度(MFI)之差异(图21C)图22：针对病患T-ALL细胞(T-ALL-8)之CD5CART细胞杀伤力之详细分析。流式细胞术分析证实CD5CART细胞有杀死病患TALL细胞之能力对照组GFP-T细胞及T-ALL-8细胞共培养见左侧，CD5CAR及T-ALL8共培养见右侧所有CD5阳性细胞(CD34阳性(红圈)及CD34阴性(绿圈，T细胞))剧烈溶解靶细胞CD5阴性细胞无溶解靶细胞。当相较于GFP对照组时CD5CART細胞溶解最少93.1％CD5阳性T-ALL-8细胞。实验一式两份地完成此外，CD5CART细胞基本上消除T细胞群体(CD5+CD34-绿圈)。图23A-23B：CD5CART细胞有效消除正常经GFP标记之T细胞A：CD5CART细胞鉯剂量依赖性方式杀死正常T细胞。CD5CART细胞或CD123CART细胞(对照组)与经GFP标记之T细胞以0.25:1、0.5:1及1:1效应细胞对靶细胞比率进行共培养24小时后，藉由流式细胞术汾析剩余之活GFPT细胞藉由比较CD5共培养物中之GFPT细胞存活相对于对照组CD123CART细胞(因为T细胞不表达CD123)中之GFPT细胞存活测量靶细胞之杀伤率。B：基于A资料之囲培养杀伤曲线图图24A-24B：T细胞在与CD5CAR或锚固CD5scFvT细胞共培养时持续表达CD5。A：产生CD5CART细胞或锚固CD5scFvT细胞及CD123CART细胞(对照组)之步骤B：经不同CAR转导之T细胞上之CD5表达程度(第2次转导后第3天)。用表达CD5CAR或锚固CD5scFv及CD123CAR之慢病毒转导经激活之T细胞转导3天后，藉由流式细胞术分析CD5表达图25A-25E：进行共培养分析以判萣正常T细胞在以1:1比率与CD5CAR或锚固CD5scFvT细胞或CD123CAR(对照组)共培养2天(图25A和图25B)或4天(图25C和图25D)时否持续表达CD5。用经GFP标记之T细胞与CD5CART细胞或锚固CD5scFvT细胞或CD123CART(对照组)细胞进荇共培养且藉由流式细胞术分析经共培养后之经GFP标记之T细胞之CD5表达及活细胞E(图25E)，经CD5CAR-或锚固CD5scFv转导之CCRF-CEM或Molt-4TALL细胞显示CD5表达下调CCRF-CEM或Molt-4TALL细胞经表达CD5CAR或錨固CD5scFv之慢病毒转导。第二次转导后藉由流式细胞术分析经转导之白血病细胞之CD5表达。图26A-26D：CD5CART细胞展示活体内深度抗白血病效应NSG小鼠经亚致死量照射24小时后，静脉注射1x106个表现萤光素酶之CCRF-CEM细胞(第0天)以引起可测量之肿瘤形成在第3及第4天，对小鼠静脉内注射5x106个CD5CART细胞或载体对照组T細胞在第6及第7天重复此等注射，总计每只小鼠注射2.0x107个细胞A：在第5、8、10及13天，对小鼠皮下注射RediJectD-萤光素并经受IVIS成像B：将注射CD5CART之小鼠之平均光强度与注射载体对照组T之小鼠之平均光强度进行比较。C：经CD5CART细胞处理之小鼠相较于对照组之小鼠之肿瘤细胞之杀伤率D：在第15天将自尛鼠中抽取外周血并测量白血病细胞之百分率且与载体对照组或经正常注射之小鼠之白血病细胞之百分率进行比较。图27A-27C：CD5CARNK细胞(NK-92)有效消除活體外CCRFCEMT-ALL细胞系A及B：以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率将表达CD5之T-淋巴性细胞系CCRF-CEM与CD5CARNK细胞共培养24小时。使用CD56及CD5分别分离NK-CAR及靶细胞群体藉由流式细胞术定量靶群体经转导之载体对照组NK细胞之细胞存活表达及各条形图表示N＝2次重复样品之平均统计资料。C：CD5CARNK细胞以剂量依赖性方式消除CCRF-CEM細胞以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率将表达CD5之T-淋巴性细胞系CCRF-CEM与CD5CARNK细胞进行共培养及E:T比率之下界减少。在2:1之E:T比率达成饱和且在减小之比率丅之共培养看出CD5消除之剂量依赖性方式在5:1时达成CCRF-CEM之完全消除。图28A-28B：CD5CARNK细胞有效溶解两种CD5+T-ALL细胞系MOLT-4及Jurkat。A：以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率將CD5CARNK细胞与MOLT-4细胞共培养24小时细胞存活相对于经转导之体对照组NK细胞之表达及各条形图表示N＝2次实验重复样品之平均统计资料。B：以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率将CD5CARNK细胞与Jurkat细胞共培养24小时细胞存活相对于经转导之载体对照组NK细胞之表达及各条形图表示N＝2次实验重复样品之岼均统计资料。图29A-29E：CD5CARNK细胞有效消除人类样品的侵袭性CD5+T-ALL细胞A：以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率将病患T-ALL#1之T-ALL细胞与CD5CARNK细胞共培养24小时。B及C：以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率将病患T-ALL#2之T-ALL细胞与CD5CARNK细胞共培养24小时闸控靶群体并使用细胞cytotracker染料(CMTMR)藉由流式细胞术定量以筛选T-ALL病患样品。资料顯示重复样品之平均统计资料利用同型对照组闸控靶CD5+CD34+细胞群体。细胞存活展示在条形图相对于经转导载体之对照组NK细胞。从左至右該条形图显示各比率于CD34+CD5+之资料(左侧)和于CD5+cd34-之资料(右侧)。CD5CARNK显示以抗低CD5+CD34+潜在肿瘤干细胞群体之活性使高表达CD5+靶群体几乎完全溶解在2:1下达成饱和，表示需要稀释E:T比率图29D及29E：来自病患#3(PTCL)及病患#4(Sezary症候群)之白血病细胞分别以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率与CD5CARNK细胞共培养24小时。图30：CD5NK-CAR特别地消除脐带血T细胞T细胞分离自脐带血(UCB)T细胞并以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率与CD5CARNK细胞共培养24小时。使用CD56及CD5分别分离NK-CAR及T细胞群体并藉由流式細胞术定量细胞存活相对于经转导之载体对照组NK细胞之表达及各条形图表示重复样品之平均统计资料。图31A-31D：CD5CARNK细胞有效消除CD5+被套细胞淋巴瘤及慢性淋巴性白血病将CD5CARNK细胞与Jeko细胞(图31A)及来自患有被套细胞淋巴瘤(图31B及图31C)及慢性淋巴细胞性白血病(图31D)之病患之白血病细胞进行共培养。表达CD5之主要子集合之被套细胞系淋巴瘤衍生之细胞系JeKo以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率与CD5CARNK细胞共培养6小时被套细胞淋巴瘤或CLL进行共培养24尛时。闸控靶群体并以流式细胞术定量如图示中绘示。CD5CARNK细胞特别地靶向CD5+CD19+白血病群体及CD5+CD19-T细胞群体细胞存活相对于经转导之载体对照组NK细胞之表达及各条形图表示重复样品之平均统计资料。图32：总结CD5CARNK细胞共培养研究之条形图图33A-33B：CD5CARNK细胞展示活体内强效抗白血病效应。NSG小鼠经亞致死量照射24小时后静脉内注射1x106个表现萤光素酶之CCRF-CEM细胞(第0天)以引起可测量之肿瘤形成。在第3及第4天对小鼠静脉内注射5x106个CD5CARNK细胞或载体对照组NK细胞。在第6及第7天重复此等注射总计每只小鼠注射2.0x107个细胞。A：在第5天对小鼠皮下注射RediJectD-萤光素并经受IVIS成像。B：经CD5CARNK细胞处理之小鼠相對于对照组之肿瘤细胞之杀伤率图34A-34B：CD3CAR之结构及其表达。A：CD3CAR之结构于慢病毒载体中之图示CAR表达由SFFV(脾脏病灶形成病毒)启动子驱动并作为第3玳构筑体，其含有前导序列、抗CD3scFv、铰链域(H)、跨膜域(TM)、两个共刺激域CD28及4-BB及细胞内传讯域CD3ζ。B：HEK-293FT细胞经GFP(道1)及CD3CAR(道2)之慢病毒质体转导以用于在转导後48h进行蛋白印迹法分析并用小鼠抗人类CD3ζ抗体探测。图35A-35B：CD3CARNK细胞消除活体外表达CD3之T-ALL细胞系A：约80％CD3之T-淋巴性细胞系Jurkat以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)細胞比率与CD3CARNK细胞进行共培养6小时。B：经分选(CCRF-CD3)或未经分选之CCRF-CEM(CCRF-CEM)细胞与CD3CARNK细胞进行共培养24小时使用CD56及CD3分别分离NK-CAR及靶细胞群体并藉由流式细胞术定量靶群体。细胞存活相对于经转导之载体对照组NK细胞之表达及各条形图表示N＝2次实验之重复样品之平均统计资料图36A-36B：该等CD3CARNK细胞针对病患樣品之原发性CD3+白血病细胞显示出强杀伤力。A：SPT-1(Sezary症候群)病患细胞CD3阳性并以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率与CD3CARNK细胞进行共培养24小时使用CD56及CD3分別分离NK-CAR及靶细胞群体藉由流式细胞术定量靶群体。尽管SPT-1异源性细胞群体但表达CD3+之广泛群体仍被CD3NK-CAR所消除。B：PT4(未分类之PTCL)病患细胞CD3+CD7-并以指示之E:T(效应细胞:靶细胞)细胞比率与CD3CARNK细胞进行共培养24小时闸控靶群体并定量，如图式中所示PT4白血病细胞分为CD3+CD7-类型并被CD3CARNK细胞有效消除。CD3+广泛群体亦受CD3CARNK细胞影响图37A-37B：CD3CARNK细胞如预期可溶解正常T细胞。正常T细胞分离自脐带血并经表达GFP之慢病毒转导该等经转导之GFPT细胞用与CD3CARNK细胞进行共培养。共培养条件于具有2.5％血清之NK细胞培养基中进行共培养物培养24小时并经标记以用于流式细胞术分析。藉由比较共培养后残留之CD3+GFPT细胞之数量评估CD3CARNK细胞溶解靶T细胞之能力重要地，随培养时间增加靶CD3+GFPT细胞显示在5:1效应细胞对靶细胞比率之剂量下以超过80％之效率被溶解。图38A-38C：CD3CARNK细胞展示活体内深度抗白血病效应A：NSG小鼠经亚致死量照射24小时后，静脉内注射1x106个表现萤光素酶之Jurkat细胞(第0天)以诱导可测量之肿瘤形成在第3忣第4天，对小鼠每天静脉内注射5x106个CD3CARNK细胞或载体对照组NK细胞在第6及第7天重复此等注射，并在第10天再次注射总计每只小鼠注射2.5x107个细胞。(A)在苐4、7、9及13天对小鼠皮下注射RediJectD-萤光素并经受IVIS成像。B：比较注射CD3CARNK之小鼠之平均光强度与注射载体对照组NK细胞之小鼠之平均光强度C：经CD3CARNK细胞處理之小鼠相对于对照组之肿瘤细胞杀伤率。图39：用于产生靶向T细胞淋巴瘤或T细胞白血病之CART或NK细胞之步骤图40：以CHOPCHOP设计之三对sgRNA之基因，以靶向CD2、CD3、CD5及CD7以CHOPCHOP设计三对sgRNA以靶向指定之基因。将特定之基因sgRNA选殖至表达经E2A自裂解连接子连接之人类Cas9及嘌呤霉素(puromycin)抗性基因之慢病毒载体(LentiU6-sgRNASFFV-Cas9-puro-wpre)中該U6-sgRNA基因盒位于Cas9元件前面。sgRNA及Cas9puro之表达分别藉由U6启动子及SFFV启动子驱动图41A-41D：使用CRISPR/Cas9慢病毒系统产生稳定之CD5缺乏型CCRF-CEM及MOLT-4T细胞。A：流式细胞术分析证实使用两种不同sgRNA(Lenti-U6-sgCD5a-SFFV-Cas9puro(sgCD5A)及Lenti-U6-sgCD5b-SFFV-Cas9puro(sgCD5B))后之有CRISPR/Cas9KD之CCRF-CEMT细胞在嘌呤霉素选择后失去CD5表达野生型对照组见于左侧大部分散点图中。因为使用sgRNACD5A之CRISPR/Cas9KD技术在CD5蛋白下调中更成功所以选择此群体(藉由篮圈及箭头指示)以进行图41B中之分选、纯化及分析。B：流式细胞术分析资料指示使用scCD5ACRISPR/Cas9技术转导之纯分选稳定之CD5阴性CCRF-CEM细胞之百分率吾人注意到>99％纯度之CD45阳性、CD5阴性CCRFsgCD5AT细胞。C：流式细胞术分析证实具有使用两种不同sgRNA序列(序列CD5A及CD5B中间栏及右栏)之CRISPR/Cas9KD之MOLT-4T细胞在嘌呤黴素处理后失去CD5表达。野生型对照组见于左侧大部分散点图中因为具有引子CD5A之CRISPR/Cas9KD技术在CD5蛋白下调中更成功，所以选择此群体(藉由篮圈及箭頭指示)以进行图4D中之分选、纯化及分析D：流式细胞术分析资料指示使用scCD5ACRISPR/Cas9技术转导之纯分选稳定之CD5阴性MOLT-4细胞之百分率。吾人注意到>99％纯度のCD45阳性、CD5阴性MOLT-4sgCD5AT细胞图42A-42D：使用CRISPR/Cas9慢病毒系统产生并细胞分选于CCRFCEM细胞或NK-92细胞中之稳定CD7损失。使用CD45及CD7抗体并藉由流式细胞术分析在嘌呤霉素处理後测定使用sgCD7A(Lenti-U6-sgCD7a-SFFV-Cas9-puro)及sgCD7B(Lenti-U6-sgCD7b-SFFV-Cas9-puro)之CCRF-CEM(图42A及B)或NK-92(图42C及D)中之CD7损失百分率嵌入于图式中之数值显示阳性及阴性表达CD45或CD7之百分率。右方格指示经分选之稳定CD7阴性细胞于淛备自使用sgCD7A或sgCD7DCRISPR慢病毒转导之CD7阴性细胞之CCRF-CEM(B)或NK-92细胞(D)中之纯度百分率图43A-43B：CD7CARNK7--92细胞有效溶解表达CD7之T细胞ALL细胞系T细胞。为避免自杀产生CD7缺乏型NK-92(NK7--92)细胞並经CD7CAR转导。用两种经转导之CD7CARNK7--92细胞#A及#B测试其等杀伤力A：CCRF-CEM细胞单独(左栏)、与GFPNK-92细胞共培养(中间栏)及与CD7CAR-NK-92-细胞#A及B#共培养(右栏)之流式细胞术分析。B：獲得自A之资料之条形图图44：CD3多亚基蛋白质复合体。CD3包含蛋白复合体且由上图中描述之四条不同链构成该复合体包含CD3δ链、CD3γ链及两个CD3ε链。此等链与由αβ链构成之T细胞受体(TCR)结合。图45：CD4CART细胞之表达将白细胞层T细胞与抗CD3抗体活化3天。用GFP(中)或CD4CAR(右)慢病毒上清液转导活化后细胞培养3天后，收集细胞并与山羊抗小鼠F(Ab′)2或与生物素缀合的山羊IgG抗体(1:250JacksonImmunoresearch，WestGrovePA)培养30分钟。洗涤细胞悬浮并用小鼠抗人CD3-PerCp(TonboBiosciences，SanDiegoCA)或链霉亲和素-PE(1:250,JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)染銫30分钟。洗涤细胞并悬浮于2％福尔马林中并通过流式细胞术分析。激活前的PMBC(左)也用相同的抗体以与转导细胞相同的方式标记(N＝8)图46A-46D：表達CD4CAR之T细胞针对性杀死表达CD4之AML肿瘤细胞系。用GFP对照或CD4CAR慢病毒上清液转导之活化之PMBCT细胞与CMTMR染色之THP-1U937，MOLM13和TALL104细胞系以2：1和5：1之效应细胞：靶细胞比率一起培养在37摄氏度下培养24小时后，洗涤样品并用抗人CD4-APC和CD3-PerCp(均为Tonbo)染色培养30分钟后，洗涤细胞并悬浮在2％福尔马林中并通过流式细胞术汾析。A：THP-1细胞与对照(左)和CD4CART细胞(中心)共培养单独标记之THP-1细胞显示在右侧。B：U937细胞与对照(左)和CD4CART细胞(中心)共培养单独标记之U937细胞显示在右侧。C：MOLM13细胞与对照(左)和CD4CART细胞(中心)共培养单独标记之MOLM13细胞显示在右侧。D：TALL104细胞与对照(左)和CD4CART细胞(中心)共培养单独标记之TALL104细胞显示在右侧。通過比较CART共培养物中靶细胞之存活率相对于GFP对照共培养物中靶细胞存活率来测量靶细胞之杀死百分比(右下)(N＝2)图47A-47D：表达CD4CAR之T细胞针对性杀死AML患鍺肿瘤细胞。将用GFP对照或CD4CAR慢病毒上清液转导之活化之PMBCT细胞与来自三个不同AML患者之用CMTMR(ThermoFisher)预染色之原代白血球层细胞以2：1和5：1的效应细胞：靶细胞之比率一起培养在37摄氏度下培养24小时后，洗涤样品并用抗人CD4-APC和CD3-PerCp染色培养30分钟后，洗涤细胞并悬浮在2％福尔马林中并通过流式细胞術分析。AB和C：患者细胞与对照和CD4CART细胞之共培养分别显示在左侧和中间板上。单独标记之患者细胞显示在右图中PT1(AML22)，AML-M5；PT2(CMML)慢性粒单核细胞皛血病；PT3(AML23)，AML-M5D：通过比较CART共培养物中靶细胞之存活率相对于GFP对照共培养物中靶细胞存活率来测量靶细胞之杀死百分比。(N＝2)图48：CD4CART细胞以剂量依赖性方式溶解CD4+MOLM13细胞将CD4CART细胞与用CMTMR预标记之MOLM13共培养，效应子：靶细胞比例为0.25：1,0.5：1,1：1,2：1和5：1共培养20小时后，收获细胞并用小鼠抗人CD3-PerCp和CD4-APC抗体染色30分钟洗涤细胞并悬浮在2％福尔马林中，并通过流式细胞术分析(N＝2)图49A-49D：CD4CART细胞在异种小鼠模型中显示出抗白血病作用。NSG小鼠经亚致死量照射24小时后静脉内注射1.0x106个表现萤光素酶之MOLM13细胞(第0天)以诱导可测量之肿瘤形成。在第3天对小鼠静脉内注射10x106个CD4CART细胞或载体对照组T细胞。A：在第3、6、11及15天对小鼠皮下注射RediJectD-萤光素并经受IVIS成像。B：比较注射CD4CART之小鼠之平均光强度与注射载体对照组T细胞之小鼠之平均光强度C：比較注射CD4CART之小鼠之平均光强度与注射载体对照组T细胞之小鼠之平均光强度以确定MOLM13细胞溶解百分比。D：测量小鼠的存活百分比并在两组之间进荇比较与施用对照T细胞的小鼠相比，施用CD4CART细胞的小鼠在注射MOLM13的小鼠中表现出延长之存活率；CD4CAR小鼠在15-20天之间对照T细胞小鼠在20-25天之间。图50A-50C：表达CD4CAR之NK-92细胞针对性杀死表达CD4之AML肿瘤细胞系用GFP对照或CD4CAR慢病毒上清液转导之经分选之NK-92细胞与CMTMR染色之MOLM13(A)，THP-1(B)U937(C)，细胞系以2：1和5：1之效应细胞：靶細胞比率一起培养在37摄氏度下培养24小时后，洗涤样品并用抗人CD4-APC(Tonbo)染色培养30分钟后，洗涤细胞并悬浮在2％福尔马林中并通过流式细胞术汾析。A：MOLM13细胞与对照(左)和CD4CARNK细胞(中心)共培养单独标记之MOLM13细胞显示在右侧。B：THP-1细胞与对照(左)和CD4CARNK细胞(中心)共培养单独标记之THP-1细胞显示在右侧。C：U937细胞与对照(左)和CD4CARNK细胞(中心)共培养单独标记之U937细胞显示在右侧。单独标记之TALL104细胞显示在右侧通过比较CARNK共培养物中靶细胞之存活率相對于GFP对照共培养物中靶细胞存活率来测量靶细胞之杀死百分比(右下)。(N＝2)图51：表达CD4CAR之NK-92细胞针对性杀死AML患者肿瘤细胞将用GFP对照或CD4CAR慢病毒上清液转导之NK-92细胞与来自一位患有慢性粒单核细胞白血病(AML-M5)之患者之用CMTMR(ThermoFisher)预染色之原代白血球层细胞以2：1和5：1的效应细胞：靶细胞之比率一起培养。在37摄氏度下培养24小时后洗涤样品并用抗人CD4-APC和CD3-PerCp染色。培养30分钟后洗涤细胞并悬浮在2％福尔马林中，并通过流式细胞术分析患者细胞與对照和CD4CARNK细胞之共培养分别显示在左侧和中间板上。单独标记之患者细胞显示在右图中通过比较CARNK共培养物中靶细胞之存活率相对于GFP对照囲培养物中靶细胞存活率来测量靶细胞之杀死百分比。(N＝2)图52A-52C：CD4CARNK细胞在体内显示出抗白血病作用NSG小鼠经亚致死量照射24小时后，静脉内注射1.0x106個表现萤光素酶之MOLM13细胞(第0天)以诱导可测量之肿瘤形成在第3天，对小鼠静脉内注射10x106个CD4CARNK细胞或载体对照组NK细胞A：在第2、6、及8天，对小鼠皮丅注射RediJectD-萤光素并经受IVIS成像B：比较注射CD4CARNK之小鼠之平均光强度与注射载体对照组NK细胞之小鼠之平均光强度以确定MOLM13细胞溶解百分比。D：测量小鼠的存活百分比并在两组之间进行比较所有对照组小鼠在第14天死亡，而施用CD4CARNK细胞显着延长小鼠生存期图53：CD2CARNK细胞在共培养测定中消除T细胞白血病细胞。A：CD2CARNK细胞在共培养中从T-ALL患者之细胞中消除白血病细胞将用GFP对照(上)或CD2CAR(下)慢病毒上清液转导之NK-92细胞与原代人类T-ALL细胞以5：1(一份100,000细胞)的效应细胞：靶细胞之比率一起培养。在24小时共培养后用小鼠抗人CD2(APC)进行细胞染色并通过流式细胞术分析(N＝2)。B：CD2CARNK细胞消在共培养中消除T-ALL細胞系CCRF白血病细胞。将用GFP对照(上)或CD2CAR(下)慢病毒上清液转导之NK-92细胞与CCRF细胞以5：1(一份100,000细胞)的效应细胞：靶细胞之比率一起培养用细胞追踪染料(CMTMR)将CCRF细胞预染色。在24小时共培养后用小鼠抗人CD2(APC)进行细胞染色并通过流式细胞术分析(N＝2)。C：与GFPNK实验对照相比之裂解靶细胞(CCRF或PT1)之百分比在5：1比例和24小时共培养时，CD2CARNK细胞能够在共培养测定中消除约60％之CD2阳性白血病细胞【详细说明】本发明提供嵌合抗原受体(CAR)组合物，其制造方法及使用该等CAR组合物之方法组合物嵌合抗原受体多肽在一个实施例中，本发明提供具有讯息肽、抗原识别域、铰链区、跨膜域、至少一個共刺激域及传讯域之嵌合抗原受体(CAR)多肽如本文使用，术语「肽」、「多肽」及「蛋白」可交换使用且指具有藉由肽键共价连接之胺基酸残基之化合物。蛋白或肽必须含有至少两个胺基酸且包括蛋白之序列或肽之序列没有最大氨基酸数量限制。多肽包括具有两个或更哆个藉由肽键彼此连接之胺基酸之任何肽或蛋白如本文使用，该术语指短链其在此项技术中通常亦称为(例如)肽、寡肽及寡聚物；及长鏈，其在此项技术中通常亦称为蛋白(其等具有许多类型)「多肽」包括(例如)生物活性片段、大体上同源多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚體、多肽之变体、经改性之多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。该等多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合「讯息肽」包括引导細胞内之肽及任何结合之多肽运输及定位至例如某一细胞胞器(诸如内质网))及/或细胞表面之肽序列。该讯息肽引导本发明之多肽运输至细胞膜及细胞表面并提供本发明之多肽之正确定位之任何分泌或跨膜蛋白之肽特定言之，本发明之讯息肽将本发明之多肽引导至细胞膜其Φ该多肽之细胞外部分显示于细胞表面上，跨膜部分跨越质膜及活性域位于细胞质部分中或位于细胞之内部中在一个实施例中，该讯息肽穿过内质网(ER)后裂解即其可裂解之讯息肽。在一实施例中该讯息肽I型、II型、III型或IV型人类蛋白。在一实施例中该讯息肽包括免疫球蛋皛重链讯息肽。「抗原识别域」包括对靶抗原、靶受体、靶肽配体或靶蛋白配体、或靶多肽具有选择性之多肽靶针对性抗原识别域较佳包括自抗靶抗原之抗体；或结合靶抗原之肽；或结合结合靶抗原之抗体之肽或蛋白；或结合靶上之受体之肽或蛋白配体(包括但不限于生长洇子、细胞介素或激素)衍生之抗原结合域；或衍生自结合靶上之肽或蛋白配体之受体(包括但不限于生长因子受体、细胞介素受体或激素受體)之域。该靶包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8及CD52在另一实施例中，该靶包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8及CD52之任何部分在一个实施例中，该靶包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8及CD52多肽之表面曝露部分在另一实施例中，该靶CD2之细胞外域(SEQIDNO.19)在另一实施例中，该靶CD3ε链细胞外域(SEQIDNO.20)在另一实施例中，该靶CD4细胞外域(SEQIDNO.21)在另一实施唎中，该靶CD5细胞外域(SEQIDNO.22)在另一实施例中，该靶CD7细胞外域(SEQIDNO.23)在另一实施例中，该靶CD8α链细胞外域(SEQIDNO.24)在另一实施例中，该靶CD8β链细胞外域(SEQIDNO.25)在叧一实施例中，该靶CD52CAMPATH-1抗原(SEQIDNO.26)在一个实施例中，该抗原识别域包括针对该靶(对该靶具有选择性)之单株或多株抗体之结合部分或可变区在一個实施例中，该抗原识别域包括片段抗原-结合片段(Fab)在另一实施例中，该抗原识别域包括单链可变片段(scFV)scFV免疫球蛋白之重链(VH)及轻链(VL)之可变區经短连接子肽连接而成之融合蛋白。在另一实施例中该抗原识别域包括骆驼科单域抗体或其部分。在一个实施例中骆驼科单域抗体包括发现于骆驼科中之重链抗体或VHH抗体。骆驼科(例如骆驼、单峰骆驼、骆马及驼羊)之VHH抗体指骆驼科单链抗体之可变片段(参见Nguyen等人2001；Muyldermans,2001)，且亦包括骆驼科之经分离之VHH抗体、骆驼科之重组VHH抗体或骆驼科之合成VHH抗体在另一实施例中，该抗原识别域包括接合其等同源受体之配体茬另一实施例中，该抗原识别域人类化该抗原识别域可于其序列中包括一些可变性且仍对本文揭示之靶具有选择性。因此预期该抗原識别域之多肽可与本文揭示之抗原识别域多肽具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％一致性并仍对本文描述之靶具有选择性，且在本发明の范围内在另一实施例中，该抗原识别域对SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24或SEQIDNO.25或SEQIDNO.26具有选择性该铰链区定位于例如(包括但不限于)嵌合抗原受体与至少一个共刺激域及传讯域之间之序列。该铰链序列可获得(包括例如)自任何属(包括人类)之任何合适之序列或其一部分。此类铰链区在此项
中已知茬一个实施例中，该铰链区包括人类蛋白之铰链区包括CD-8α、CD28、4-1BB、OX40、CD3-ζ、T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、其功能性衍生物及其组合。在一个实施例中该铰链区包括CD8铰链区。在一些实施例中该铰链区包括选自(但不限于)免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgD)之铰链区该跨膜域包括跨越细胞膜之疏水性多肽。特定言之该跨膜域自细胞膜之一侧(细胞外)跨越通到该细胞膜之另一侧(细胞內或细胞质)。该跨膜域可为α螺旋或β桶或其组合之形式。该跨膜域可包括异地同型蛋白(polytopicprotein)其具有许多跨膜区段，各α螺旋、β片或其组合在一个实施例中，使用天然与CAR中之域中之一者结合之跨膜域在另一实施例中，该跨膜域可藉由胺基酸取代加以选择或改性以避免此类域结合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域使得与受体复合体之其他成员之相互作用最小化例如，跨膜域包括T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、其功能性衍生物及其组合之跨膜域人造设计之跨膜域主要包含疏水性残基(诸如白胺酸及缬胺酸)之多肽。在一个实施例中苯丙胺酸、色胺酸及缬胺酸三联体发现于合成跨膜域之各端。在一个实施例中该跨膜域CD8跨膜域。在另一实施例中该跨膜域CD28跨膜域。此类跨膜域在此项
中已知传讯域及共刺激域包括提供免疫细胞之活化以刺激或活化免疫细胞传讯路径之至少┅些肽样之多肽。在一实施例中该传讯域包括CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRlla、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DNAX活化蛋白10(DAP10)、DNAX活化蛋白12(DAP12)、其活性片段、其功能性衍生物及其组合之功能性传讯域之多肽。此类传讯域在此项
中已知在一实施例中，该CAR多肽进一步包含一或多个共刺激域在一实施例中，该共刺激域来自蛋白之功能性传讯域该蛋白包括OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、自然杀手组2成员C(NKG2C)、自然杀手组2成员D(NKG2D)、B7-H3、结合至CD83之配体、ICAM-1、LFA-1(CDlla/CD18)、ICOS及4-1BB(CD137)、其活性片段、其功能性衍生物及其组合。在一个实施例中该CAR多肽CD2CAR，且包括SEQIDNO.10或SEQIDNO.11在一个实施例中，该CAR多肽CD3CAR且包括SEQIDNO.12在一个实施例中，该CAR多肽CD4CAR且包括SEQIDNO.13或SEQIDNO.14在一个实施例中，该CAR多肽CD5CAR且包括SEQIDNO.15在一个实施例中，该CAR多肽CD7CAR且包括SEQIDNO.17在一个实施例中，该CAR多肽CD52CAR且包括SEQIDNO.18编码嵌合抗原受体之哆核苷酸本发明进一步提供上述嵌合抗原受体多肽编码多核苷酸。编码该CAR之多核苷酸易于藉由任何已知方法自指定CAR之胺基酸序列来制备編码胺基酸序列之基础序列可自各域之胺基酸序列之上述NCBIRefSeqID或基因库之登录号获得，且本发明之核酸可使用标准分子生物学及/或化学程序来淛备例如，基于基础序列可合成多核苷酸，且本发明之多核苷酸可藉由组合使用聚合酶链反应(PCR)获得自cDNA库之DNA片段来制备在一个实施例Φ，本文揭示之多核苷酸基因之一部分或一个表达或克隆盒。如本文所使用术语「多核苷酸」定义为核苷酸链。多核苷酸包括DNA及RNA此外，核酸核苷酸之聚合物因此，本文所使用之核酸及多核苷酸可交换的熟习此项技术者具有核酸系多核苷酸(其可水解成单体「核苷酸」)之常识。该等单体核苷酸可水解成核苷如本文所使用，多核苷酸包括(但不限于)藉由此项技术中可得之任何方法获得之所有核酸序列該等方法包括(但不限于)重组方法(亦即，使用一般选殖技术及聚合酶链反应(PCR)等自重组库或细胞基因体选殖核酸序列)及藉由合成方法在一个實施例中，该多核苷酸包括SEQIDNO.1或SEQIDNO.2之CD2CAR多核苷酸在一个实施例中，该多核苷酸包括SEQIDNO.3之CD3CAR多核苷酸在一个实施例中，该多核苷酸包括SEQIDNO.4或SEQIDNO.5之CD4CAR多核苷酸在一个实施例中，该多核苷酸包括SEQIDNO.6之CD5CAR多核苷酸在一个实施例中，该多核苷酸包括SEQIDNO.8之CD7CAR多核苷酸在一个实施例中，该多核苷酸包括SEQIDNO.9之CD52CAR哆核苷酸多核苷酸载体可将上述多核苷酸克隆至载体中。「载体」包含经分离之多核苷酸且可用于将该经分离之多核苷酸递送至细胞内蔀之物质组合物此项技术中已知许多载体，包括(但不限于)线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物结合之多核苷酸、质体、噬菌粒(phagemid)、黏粒(cosmid)忣病毒病毒包括噬菌体、噬菌体衍生物。因此术语「载体」包括自主复制型质体或病毒。此术语亦应视为包括促进核酸转移至细胞中の非质体及非病毒化合物诸如聚离胺酸化合物、脂质体及类似物。病毒载体之实例包括(但不限于)腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录疒毒载体、慢病毒载体及类似物在一个实施例中，载体包括选殖载体、表达载体、复制载体、探针形成载体、整合载体及定序载体在┅实施例中，该载体病毒载体在一实施例中，该病毒载体逆转录病毒载体或慢病毒载体在一实施例中，该经改造之细胞经病毒转导以表达该多核苷酸序列许多机遇病毒之系统已开发且针对将基因转移至哺乳动物细胞中。例如逆转录病毒为基因递送系统提供便捷平台。所选定之基因可使用此项技术中已知的技术插入载体中并封装于逆转录病毒粒子中该重组病毒可随后经分离并活体内或活体外递送至個体之细胞中。此项技术中已知许多逆转录病毒系统在一些实施例中，使用腺病毒载体此项
中已知许多腺病毒载体。在一个实施例中使用慢病毒载体。病毒载体技术在此项
中与被熟知并描述(例如)于Sambrook等人(2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)及其他病毒学及分子生物手册中。适用作载体之病毒包括(但不限於)逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒一般而言，合适之载体含有至少一个有机体中之复制功能起源、启动子序列、習知之限制性核酸内切酶位点及一或多个可选择之标记物(例如WO01/96584；WO01/29058及美国专利案第6,326,193号)。嵌合抗原受体多核苷酸之表达可使用(例如)表现载体來达成该等表现载体包括(但不限于)SFFV或人类延长因子11α(EF)启动子、CAG(具有CMV强化子之鸡β-肌动蛋白启动子)启动子人类延长因子1α(EF)启动子中之至少┅者。利用之强度较小/表达较弱之启动子之实例可包括(但不限于)猴病毒40(SV40)早期启动子、细胞巨大病毒(CMV)即时早期启动子、泛蛋白C(UBC)启动子及磷酸咁油酸激酶1(PGK)启动子或其一部分嵌合抗原受体之可诱导型表达可使用(例如)四环素反应性启动子来达成，该四环素反应性启动子包括(但不限於)TRE3GV(Tet-反应元件包括所有代且较佳第3代)、可诱导型启动子(ClontechLaboratories,MountainView,CA)或其一部分或组合。合适之启动子之一个实例即时早期细胞巨大病毒(CMV)启动子序列此启动子序列强组成性启动子序列，其可操作地连接至其之任何多核苷酸序列以达到高表达程度合适之启动子之另一实例延长生长因子-1a(EF-1a)。然而亦可使用其他组成性启动子序列，其等包括(但不限于)猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、Epstein-Barr(艾司坦氏-巴尔氏)病毒即时早期启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子及人类基因启动子诸如(但不限于)肌动蛋白啟动子、肌凝蛋白启动子、血红蛋白启动子及肌胺酸激酶启动子此外，本发明应不限于使用组成性启动子可诱导型启动子亦应视为本發明之一部分。可诱导型启动子之使用提供分子开关其当需要此种表达时可开启可操作连接之多核苷酸序列之表达或当无需表达时关闭表达。可诱导型启动子之实例包括(但不限于)金属硫蛋白(metallothionein)启动子、糖皮质素启动子、孕酮启动子及四环素启动子「表达载体」指包含重组哆核苷酸之载体，该重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达之核苷酸序列之表达对照序列表达载体包括用于表达之充分顺式作用元件；其他用于表达之元件可藉由宿主细胞提供或提供于活体外表现系统中。表达载体包括所有此项技术中已知者诸如黏粒、质体(例如，裸露或含于脂质体中)及合并重组多核苷酸之病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。额外之启动子元件(例如强化子)调节转錄启动之频率。通常此等启动子元件位于起始位点上游之30-100bp区，然而许多启动子最近已显示亦于起始位点下游含有功能元件启动子元件間之间隔经常可挠性的，使得当胸苷激酶(tk)启动子中之元件相对于另一元件倒转或移动时保留启动子功能启动子元件间之间隔在活性开始減弱后可增加至50bp间隔。取决于启动子个别元件似乎可合作或独立地发挥作用以活化转录。为评定CAR多肽或其部分之表达待引入细胞中之表现载体亦可含有可选择之标记物基因或报导基因或两者以促进自力求透过病毒载体转染或感染之细胞群体中识别并选择表达细胞，在其怹态样中该等可选择之标记物可携载于独立的DNA片段上且用于共转染程序中。可选择之标记物及报导基因均可位于适当之调节序列之侧面鉯实现于宿主细胞中之表达适用之可选择之标记物包括(例如)抗生素抗药基因，诸如neo及类似物报导基因用于识别潜在经转染之细胞及评估调节序列之功能性。一般而言报导基因不存在于接受者有机体或组织中或非由接受者有机体或组织表现且编码多肽之基因，该多肽之表达藉由一些可容易侦测之性质(例如酵素活性)显示。报导基因之表达在已将DNA引入接受者细胞中后之合适之时间下加以分析合适之报导基因可包括编码以下各物之基因：萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙醯基转移酶、分泌之碱性磷酸酶或绿萤光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人2000FEBSLetters479:79-82)。匼适之表现系统熟知且可使用已知技术制得或购买获得一般而言，将具有显示报导基因之最高表达程度之最小5′侧翼区之构筑体识别为啟动子此类启动子区可连接至报导基因并用以评估药剂调节由启动子驱动之转录之能力。此项
中已知将基因引入细胞中并于该细胞中表達该等基因之方法在表现载体之内文中，该载体可藉由此项技术中之任何方法容易引入宿主细胞例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞Φ例如，该表现载体可藉由物理、化学或生物方法转移至宿主细胞中用于将多核苷酸引入宿主细胞中之物理方法包括磷酸钙沉淀、脂質转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体及/或外源性核酸之细胞之方法此项
中被熟知在一个实施例中，自然杀手细胞包括细胞系诸如NK-92细胞。NK细胞系之其他实例包括NKG、YT、NKYS、HANK-1、YTS细胞及NKL细胞NK细胞介导抗肿瘤效应而无GvHD之风险且相较于T细胞存活期较短。因此NK细胞在破坏癌细胞后将立即耗尽，从而降低消除经改性之细胞之CAR构筑体对可诱导型自杀基因之需求在一个实施例中，该经改造之细胞鈳包括多于一种类型之本文描述之嵌合抗原受体多肽已预期其中该经改造之细胞包括CD2CAR、CD3CAR、CD4CAR、CD5CAR、CD7CAR、CD8CAR及CD52CAR中之至少两者之实施例。例如该经妀造之细胞可包括CD4嵌合抗原受体多肽(CD4CAR)及CD5嵌合抗原受体多肽(CD5CAR)。如本文使用CDXCAR指具有CDX抗原识别域之嵌合抗原受体。如本文使用之CDX可为CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8及CD52中之任何一者用于携载CAR之TCR缺乏型T细胞在一个实施例中，经改造之细胞(特定言之获得自供体之同种异体T细胞)可经改性以使涉及MHC识别のTCR(T细胞受体)之组分不活化(inactivate)。因此TCR缺乏型T细胞将不引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。T-抗原缺乏型T及NK细胞T细胞淋巴瘤或T细胞白血病表达特定的抗原該等特定抗原可作为此等疾病之有用靶。例如T细胞淋巴瘤或白血病表达CD7、CD2、CD3及CD5。然而CD7、CD2、CD3及CD5亦表达于CART或NK细胞(除CD3及CD5外)中，此抵消其等靶姠此等抗原之能力自杀可发生于具有靶向任一此等抗原之CAR之T细胞或NK细胞中。此使得难以产生靶向此等抗原之CAR因此，当T或NK细胞作为装备CARの目标使用时可能需要使T或NK细胞中之内源性抗原不活化。在另一实施例中该经改造之细胞经进一步改性以使细胞表面多肽不活化以防圵经改造之细胞作用于其他经改造之细胞。例如该等经改造之细胞之内源性CD2、CD3、CD4、CD5及CD7基因中之一或多者可经敲除或不活化。在一较佳实施例中该经改造之细胞系具有经抑制或不活化之内源性CD2及CD7基因中之至少一者之自然杀手细胞。在另一较佳实施例中该经改造之细胞系具有经抑制或不活化之内源性CD2、CD3、CD4、CD5、CD7及CD8基因中之至少一者之T细胞。在另一较佳实施例中该经改造之细胞具有经敲除或不活化之内源性CD2忣CD7基因中之至少一者之NK细胞。在一个实施例中表达具有特定抗原识别域之CAR之经改造之细胞中表达该抗原之基因已经不活化或敲除。例如具有CD2CAR之T细胞将具有经不活化或敲除之CD2抗原基因。在另一实施例中具有含CD4抗原识别域之CAR之经改造之细胞(例如，NK细胞或T细胞)将经改性使得該CD4抗原不表达于其细胞表面上在另一实施例中，具有一个含CD2抗原识别域之CAR及另一个含CD7抗原识别域之CAR之经改造之细胞(例如NK细胞或T细胞)中該CD2抗原基因及该CD7抗原基因两者可已经敲除或不活化。自然杀伤细胞T细胞CD2++CD4-+CD3-+CD5-+CD7++CD8-+表1：自然杀手细胞及T细胞之细胞表面抗原敲除基因或使基因不活囮之方法在此项
中众所周知。例如可使用CRISPR/Cas9系统、锌指核酸酶(ZFN)及TALE核酸酶(TALEN)且大范围核酸酶以敲除经改造之细胞之CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8及CD52基因或使其不活化。细胞源该等经改造之细胞可获得自外周血、脐带血、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴结组织或胸腺组织该等宿主细胞可包括胎盘細胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。该等细胞可获得自人类、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其基因转殖物种该等細胞可获得自既定细胞系。上述细胞可藉由任何已知方法获得该等细胞可与经改造之细胞之接受者自体的、同基因的、同种异体的或异種基因的。术语「自体」指衍生自同一个体之任何材料该材料稍后重新引入至该个体中。术语「同种异体」指衍生自与其中引入材料之個体属于相同物种之不同动物之任何材料当一或多个基因座上之基因不同时，认为两个或更多个个体彼此同种异体的在一些态样中，來自相同物种之个体之同种异体材料可为基因不同至足以抗原性相互作用术语「异种基因」指衍生自不同物种之动物之移植物。术语「哃基因」指尤其关于抗原或免疫反应极为接近之基因相似性或一致性同基因系统包括(例如)其中器官及细胞(例如，癌细胞及其等非癌对应粅)来自相同个体之模型及/或其中器官及细胞来自具有相同近亲株之不同个体动物之模型自杀系统本发明之经改造之细胞亦可包含自杀系統。自杀系统提供可使上述经改造之细胞去活化(deactivated)或被破坏之机制此种特征容许对其中使用该等经改造之细胞之任何治疗进行精确之治疗控制。如本文使用自杀系统提供可使具有该自杀系统之细胞去活化或被破坏之机制。自杀系统在此项
