专利名称：：作为妊娠相关病症嘚诊断标志物的循环mRNA的制作方法作为妊娠相关病症的诊断标志物的循环mRNA相关申请本申请要求在2003年1月17日提交的美国临时申请第60,440,906号的优先权夲发明引用其全文作为参考。发明背景通常采用诸如绒毛膜取样(CVS)或羊膜穿刺术的方法从胎儿中分离细胞来进行产前诊断尽管操作非常仔細，但这些常规方法均是侵袭性的并对母体和胎儿有一定的风险(Taboretal.,丄騰d1:86)。在发现母体循环中存在一些类型的胎儿细胞(Johansenetal.15:921-931,1995)之后，更重要的是茬发现母体血浆和血清中能够检测到循环的无细胞的胎儿DNA(Loetal.Lancet350:485-487,1997)之后，已经开发了替代这些侵袭性方法的产前筛查方法例如检测胎儿异常的方法。已证明母体血液中的胎儿DNA的含量足够用于遗传学分一斤，与分离和富集胎儿细胞的必需步骤相比并不需要对所述血浆或血清进荇复杂的处理。利用聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术通过检测母体血液中的胎儿DNA来实现胎儿rhesusD(RhD)基因型的检测(Loetal.,TV.五wg/.Me丄339:98)、月台儿性别的确定(Loetal.，//wm.G匿L90:483-488,1993)、鉯及一些胎儿病症的诊断(Amicuccietal"C"".CA亂46:301-3022000;Saitoetal"丄匿W356:;及Chiuetal.，360:998-10002002)。此外也有报道称在先兆子痫(Loetal"C//w.CA亂45:184-188，1999和Zhongetal"颠.丄G戸co/.184:414-419,2001)、月台儿21号染色体三体性(trisomy)(Loetal"dCZ缀.45:1999和Zhongetal.i^Vzgw.20:795-798,2000)和妊娠剧吐症(hyperemesisgravidarum)(Sekizawaetal"C"".C力e附.47:01)嘚母体血浆/血清中胎儿DNA含量异常的报道。美国专利第6,258,540号也公开了用于产前遗传分析的母体血液中胎儿核酸的检测在分析胎儿DNA时，检测者通常利用仅出现在男性胎儿中的Y染色体标志物作为胎儿的特异性标志物这种方法使此项技术的应用局限于50%的妊娠妇女，这些妊娠妇女怀囿男性胎儿此外，其它遗传多态性的利用也增加了胎儿DNA为基础的分析的复杂性。母体血浆中胎儿RNA的发现提供了超越这些限制的可能的噺方法(Poonetal.,C7/".C/^m.46:2000).最近，美国专利申请第09/876,005号公开了以母体血液中胎儿RNA检测为基础的非侵袭性技术本发明第一次公开了在母体血液中出现的某些mRNA种類的含量能够用作诊断、监测或预测诸如先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产的妊娠相关病症、以及4企测妊娠的标志物，所述mRNA种类包括編码人绒毛膜促性腺激素15亚基(hCG-l3)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、人胎盘促乳素(hPL)、KiSS-l转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)、胎盘特异1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的mRNA发明概述本发明提供了通过4会测母体血液中的一种或多种循环mRNA的含量来诊断、监测或预测诸如先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产的妊娠相关病症的新方法。本发明还4是供了基于相同方法学的检测妇女妊娠的方法所述的mRNA可以编码诸如人绒毛膜促性腺激素jS亞基(hCG-)S)、人胎盘催乳素(hPL)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、KiSS-l转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)、胎盘特异1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的胎儿或母体來源的蛋白。同时也提供本发明的一个方面涉及i貪断、监测或预测妊娠妇女的先兆子痫的方法此方法包括多个步骤第一步是定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定mRNA种类的含量。所述mRNA可编码hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH第二步是将第一步获得的mRNA含量与代表正常非先兆子痫的妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照进行比较。所述mRNA水平的增加或降〗氐表明存在先兆子痫或发展为所述疾病状态的风险增加在一些實施方案中，此方法中用作标志物的mRNA编码hCRH或GAPDH在一些实施方案中，所述方法的第一步通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行而在其它实施方案Φ，第一步可采用多核苷酸杂交方法或质谱方法来实施在一些实施方案中，所述妊娠妇女处于妊娠期的头三月而其它实施方案中，所述妇女处于妊娠期的中三月或末三月在一些实施方案中，所述妊娠妇女的血液在用于所述方法的第一步之前是无细胞的在一些实施方案中，在所述方法的第一步中使用血浆或血清在一些实施方案中，所述mRNA含量的增加高于标准对照2倍本发明的方法也可用于诊断、监测戓预测比先兆子痫更严重的诸如惊厥的临床病程。本发明还涉及诊断、监测或预测妊娠妇女的先兆子痫的试剂盒所述的试剂盒包括用于萣量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定mRNA种类的PCR引物。所述的mRNA可编码hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH所述试剂盒还包括代表正常非先兆子痫的妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照。本发明的试剂盒在所述PCR引物之外还可包括一种或多种用于定量测定编码hCG-/5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的探針或用其替代所述PCR引物。本发明的另一方面涉及用于检测妊娠妇女中诸如18号染色体三体性或21号染色体三体性的胎儿染色体非整倍性的方法:此方法包括多个步骤第一步是定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定mRNA种类的含量所述mRNA可编码hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。第二步是将第┅步获得的mRNA含量与代表怀有正常染色体胎儿的正常妊娠妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照进行比较所述mRNA水平的增加或降低表明懷有非整倍体胎儿的风险增加。在一些实施方案中此方法中用作标志物的mRNA编码hCG-/5。在一些实施方案中所述方法的第一步通过RT-PCR进行，而在其它实施方案中第一步可采用多核苷酸杂交方法或质谱方法来实施。在一些实施方案中所述妊娠妇女处于妊娠期的头三月，而在其它實施方案中所述妊娠妇女处于妊娠期的中三月或末三月。在一些实施方案中所述妊娠妇女的血液在用于所述方法的第一步之前是无细胞的。在一些实施方案中在所述方法的第一步中使用血浆或血清。在一些实施方案中所述增加至少为2倍，而所述降低至少为50%本发明還涉及用于检测妊娠妇女中胎儿染色体非整倍性(诸如18号染色体三体性或21号染色体三体性)的试剂盒。所述的试剂盒包括用于定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定种类的mRNA的PCR引物所述的mRNA可编码hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。所述试剂盒还包括代表怀有染色体正常胎儿的正常妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照本发明的试剂盒除所述PCR引物之外还可包括一种或多种用于定量测定编码hCG-)S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其^务代所述PCR引物本发明的另一方面涉及诊断、监测或预测妊娠妇女的早产(pre-termlabor)的方法。此方法包括多个步骤第一步是定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定种类的mRNA的含量所述mRNA可编码hCG-j3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是将第一步获得的mRNA含量与代表如期分娩或将会如期分娩的正常妊娠妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照进行比较所述mRNA水平的增加或降低表明早产或发展为此状态的风险增加。在一些實施方案中所述方法的第一步通过RT-PCR进4亍，而在其它实施方案中第一步采用多核苷酸杂交方法或质谱方法来实施。在一些实施方案中所述妊娠妇女处于妊娠期的头三月，而在其它的实施方案中所述妊娠妇女处于妊娠期的中三月或末三月。在一些实施方案中所述妊娠婦女的血液在用于所述方法的第一步之前是无细力包的。在一些实施方案中在所述方法的第一步中使用血浆或血清。在一些实施方案中所述mRNA含量的增加高于标准对照2倍。在另一些实施方案中所述的降低至少为50%。本发明还涉及诊断、监测或预测妊娠妇女的早产的试剂盒所述的试剂盒包括用于定量测定所述妊娠妇女血液中的一种或多种特定种类的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可编码hCG-]S、hCRH、hPL、KISSl、TPFI2、PLACl或GAPDH所述试剂盒还包括玳表如期分娩或将会如期分娩的正常妊娠妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照。本发明的试剂盒除所述PCR引物之外还可包括一种或多種用于定量测定编码hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLACl或GAPDH的mRNA含量的探针或用其替代所述PCR引物。本发明的另一方面涉及检测妇女妊娠的方法此方法包括多个步-驟第一步是定量测定所述妇女血液中的一种或多种特定种类的mRNA的含量。所述mRNA可编码hCG-(S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLACl第二步是将第一步获得的mRNA含量与代表健康苴未妊娠的正常妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照进行比较。所述mRNA水平增加表明妊娠在一些实施方案中，所述方法的第一步通過RT-PCR进行而在其它实施方案中，第一步采用多核苷酸杂交方法或质谱方法来实施在一些实施方案中，所述妊娠妇女的血液在用于所述方法的第一步之前是无细胞的在一些实施方案中，在所述方法的第一步中使用血浆或血清在一些实施方案中，所述mRNA含量的增加高于标准對照2倍在另一些实施方案中，所述的降低至少为50%本发明还涉及检测妇女妊娠的试剂盒。所述的试剂盒包括用于定量测定所述妊娠妇女血液中一种或多种特定种类的mRNA的PCR引物所述的mRNA可编码hCG-/3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLACl。所述试剂盒还包括代表健康且未妊娠的正常妇女血液中编码相同蛋白的mRNA含量的标准对照本发明的试剂盒除所述PCR引物之外还可包括一种或多种用于定量测定编码hCG-^、hCRH、hPL、KISSl、TPFI2或PLACl的mRNA含量的探针，或用其替代所述PCR引物附图的简要描述图l所示为分娩后母体血浆中C///mRNA的清除状况(A)为分娩前和分娩后2小时母体血浆中CiZ/mRNA的浓度，(B)则为分娩前和分娩后2小时母体血浆中GJ屍i)//RNA的浓度每一条线代表从一个受试者获得的一份血浆样本。图2为先兆子痫和对照组母体血浆中CiZ/mRNA浓度的盒须图(boxplot)Ci//mRNA浓度以拷贝/mL表示。所述盒Φ的横线表示中位凄史所述盒标志25th与75th百分点之间的区间。所述须(whisker)表示10"与90th百分点之间的区间实心原点标志l(f与90th百分点区间以外的数据点。圖3所示为正常妊娠母体血浆中胎盘来源的mRNA的水平(A)为不同妊娠阶段母体血浆中hPLmRNA和母体血清中蛋白水平的盒须图。(B)为不同妊娠阶段母体血浆Φ/3hCGmRNA和母体血清中hCG蛋白水平的盒须图所述盒中的横线表示中位数。所述盒标志25111与75"百分点之间的区间所述须表示10th与90th百分点之间的区间。实惢原点标志10th与90th百分点区间以外的数据点(C)为母体血浆中hPLmRNA和母体血清中蛋白水平之间的相关性分析。(D)为母体血浆中/5hCGmRNA和母体血清中蛋白水平之間的相关性分析图4所示为分娩后母体血浆中hPLmRNA的清除状况。(A)为分娩前和分娩后24小时的母体血浆hPLmRNA水平而(B)为分4免前和分4免后24小时的母体血浆GAPDHmRNA沝平。显示了8例血浆样本的结果且每一条线代表从一个受试者获得的一份血浆样本。(C)为分娩前和分娩后2小时的母体血浆hPLmRNA水平而(D)为分4免湔和分4免后2小时的母体血浆GAPDHmRNA水平。显示了13例血浆样本的结果且每一条线代表从一个受试者获得的一份血浆样本。图5显示了母体血浆中GAPDHmRNA的含量样本1-12来自正常妊娠妇女，而样本28-37来自先兆子痫妇女图6显示了非整倍体和对照妊娠的妊娠期头三月中母体血清hCG/SmRNA的浓度。盒须图显示叻对照、21号染色体三体性(T21)和18号染色体三体性(T18)妊娠者的血清中的hCG/3mRNA浓度(常用对数取值)所述盒中的横线表示中位数。所述盒标志25"与75"百分点之间嘚区间所述须表示10th与90th百分点之间的区间。实心原点标志10th与90th百分点区间以外的数据点图7所示为用于母体血浆中妊娠特异胎盘表达的mRNA标志粅的系统鉴定的策略的概括。收集配对的胎盘组织和母体全血样本并对其进行寡核苷酸芯片分析。挑选相对于全血在所述胎盘组织中表達增加的转录本并且通过对母体血浆的定量反转录酶PCR(QRT-PCR)来评价其在母体血浆中的可检测性和妊娠特异性。图8所示为分娩后母体血浆中胎盘mRNA嘚清除状况通过QRT-PCR检测了分娩前和分娩后24小时母体血浆中(A)TFPI2mRNA、(B)KISS1mRNA和(C)PLAC1mRNA的浓度。每一条线代表从一个受试者获得的一份血浆样本图9显示了母体血漿和胎盘组织中标准化胎盘mRNA水平的相关性。(A)为头三月妊娠期血浆和CVS间的标准化胎盘mRNA水平的相关性(B)为末三月妊娠期血浆和末期胎盘间标准囮胎盘mRNA水平的相关性。通过QRT-PCR测定血浆和胎盘组织中的标准化的/3hCG(ni3hCG)、TFPI2(nTFPI2)、KISS1(nKISSl)、CRH(nCRH)和PLAC1(nPLACl)mRNA的水平并分别用图例中所说明的符号来表示。对于非胎盘表达的轉录本也显示了标准化的GAPDH(nGAPDH)和/3-球蛋白(n/3-球蛋白)的结果。定义本发明所用术语"先兆子痫"指在妊娠过程中发生的疾病状态其主要症状为多种形式的高血压并常伴有尿蛋白和水肿(浮肿)。先兆子痫有时称为妊娠毒血症与更严重的称为惊厥的病症有关，其为先兆子痫结合癫痫发作盡管其在出生后可立即发生或在妊娠20周之前发生，这些疾病状态通常在妊娠的后半程(20周后)发病本发明所用术语"染色体非整倍性"指染色体異常的状态，其中染色体数目不是通常单倍体数目的精确的多倍体经常是增加染色体或缺失一个染色体非整倍性的最常见的情况是三体性，其中出现单个增加的染色体例如18号染色体三体性是在细胞中出现第三条18号染色体的染色体异常，而细胞中存在第三条21号染色体的患鍺则患有21号染色体三体性疾病与非整倍性相反，"染色体正常"指染色体数目是所述单倍体数目的精确的多倍体的状态例如单倍体的染色體数目的两倍，且每种染色体以相同的数目存在(除例如男性人类的性染色体外其中两种不同的性染色体X和Y各以一个拷贝存在)。本发明所鼡术语"早产"或"提前分娩，指在约40周的完全妊娠期届满前3周以上发生分娩的状态如果不处理常导致早产。相对的本申请所用的"如期分娩或将会如期分娩"的妊娠妇女指从怀胎至完全的孕期未发生早产的妊娠妇女。本发明所用术语"血液"指从妊娠妇女或妊娠可能性一企测的妇奻荻得的血液样本或制备产物该术语包括全血或血液的任何组分，其基本不含造血细胞或任意母体或胎儿来源的其它类型的细胞包括血小4反。"血液"通常不含有特定的物质该物质可含有母体或胎儿来源的RNA。"血液"的例子包括血浆和血清基本不含细胞的血液样本也称为"无細胞的，，其中通常不存在血小板本文用于描述非先兆子痫、怀有染色体正常胎儿或没有且不会出现早产的妊娠妇女的术语"正常，指某些特征，例如编码在母体血液中发现的一种或多种特定胎儿蛋白的mRNA水平其在一組随机选择的非先兆子痫、怀有染色体正常胎儿或没囿且不会出现早产的妇女中具有代表性。所选择的这组应包括充足数量的妇女从而使这些妇女中编码特定胎儿蛋白的平均mRNA水平以适当的精确度反映怀有健康胎儿的健康妊娠妇女的整个群体的mRNA水平。此外所选"f奪的这组妇女应与那些抬r测血液中先兆子痫、胎儿染色体非整倍性或早产指征的妇女有相似的妊娠龄。根据欲筛查的病症用于本发明实践的优选的妊娠龄可以不同。例如筛查先兆子痫风险的妊娠妇女優选在妊娠期中三月期间进行而优选尽可能早地对胎儿染色体非整倍性进行筛查和诊断。而且检测的优选妊娠龄也依赖于检测中所用嘚mRNA标志物。例如hPLmRNA在所有三个三月妊娠期中均可检测，而随着妊娠进程hCRHmRNA的可检测性逐步增加术语"正常"也同样用于指特定mRNA种类的含量代表茬一组随机:沐选的非妊娠健康妇女血液中的含量。本发明所用的人绒毛膜促性腺激素)8亚基(hCG-Z3)、人胎盘催乳素(hPL)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、KiSS-l转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)、胎盘特异1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(0六0印，指示例性地其序列分别如GenBank登录号NM—、NM—022640、NM—000756、U43527、NM_006528、BC022335和BC014085所给絀的基因(包括其变体和突变体)和其多核苷酸转录本在一些描述中，这些术语也指这些基因编码的蛋白本发明所用"标准对照"指适合在本發明方法中使用来定量测定编码特定蛋白，例如hCG-i8、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的样本这些样本含有已知含量的编码特定蛋白的mRNA，其非常逼近反映囸常妊娠妇女中此种mRNA的平均水平如上所述该妊娠妇女是非先兆子痫、怀有染色体正常胎儿或没有且不会出现早产的妇女。类似地"标准對照"也可来自正常的健康非妊娠妇女。本发明所用"mRNA含量比标准对照增加或降低，指含量相对于标准对照发生阳性或阴性变化增加优选為至少2倍，更优选为至少54咅并最优选为至少10倍。相似地降低优选为至少50%，更优选为至少80%,并最优选为至少90%本发明所用的"多聚核苷酸杂茭方法"指依据其形成Watson-Crick碱基配对的能力，在适合的杂交条件下利用已知序列的多聚核苷酸探针来检测多聚核苷酸存在和/或数量的方法。这種杂交方法的例子包括Southern印记和Northern印记杂交本发明所用"PCR探针"指寡核苷酸，其在聚合酶链式反应(PCR)中用于扩增源于编码诸如hCG-)8、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目标疍白的mRNA的核苷酸序列至少一种用于扩增编码上述指定蛋白的核苷酸序列的PCR引物对所述蛋白是序列特异的。发明的详细描述I.引言本发明第┅次提供了通过分析存在于妇女血液中的一种或多种编码hCG-/5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA来诊断、监测或预测妊娠妇女中先兆子痫、胎儿染色体非整倍性(諸如18号染色体三体性和21号染色体三体性)和早产以及才企测妇女妊娠的方法和试剂盒。根据本发明能够定量测定母体血液样本中编码hCG-|3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的含量，优选通过扩增方法来进行例如反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。随后将一种或多种上述指定的mRNA种类与具有相同种类的mRNA的標准对照的水平进行比妇女mRNA水平的增加或降低表明存在所述病症或发展为所述病症的风险增加。因而本发明提供了诊断先兆子痫、胎兒染色体非整倍性和早产的新方法，其是非侵袭性的并且是非性别和多态性依赖的根据相同的方法学，通过将妇女血液中编码hCG-Z5、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2戓PLAC1的一种或多种mRNA种类的水平与来自正常非妊娠妇女的对照值进行比较本发明也可用于检测妊娠。II.血液样本的制备A.获得血液样本妊娠妇女Φ或从才企测妊娠可能性的妇女中获取血液才羊本如上所述，依据所检测的病症有时依据所用的mRNA标志物，所述适合的妊娠龄可以不同根据医院和临床通常采用的标准程序进行妇女血液的收集。收集适量的外周血例如5-20ml，并可在进一步制备之前根据标准的步骤进行储存B.制备无细胞血液样本妇女血液的血清或血浆适合于本发明，并可通过公知的方法来获得例如，将妇女血液放入含有EDTA或诸如VacutainerSST(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)的商业销售嘚专用产品的管中来防止血液凝集随后通过离心可从全血中获得血浆。另一方面血液凝集后通过离心可获得血清。通常在冷却的环境唎如约4-10C的温度中，采用适合的速度例如1,500-3,000xg下进行离心。在转移至新管中进行RNA换:取前可对血浆或血清进行额外的离心步骤。III.妇女血液中mRNA含量的定量测定A.mRNA的提取有多种从生物样本中提取mRNA的方法可依据通常的mRNA制备方；去(i"列^口Sambrook禾口Russell,Afo/eciz/arC7ow/gv爿丄fl60rato7Mawwa/第三版，2001中所述)来进行；也可利用各种商業销售的试剂或试剂盒例如Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)、OligotexDirectmRNA试剂盒(Qiagen，Valencia,CA)、RNeasyMinii式剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)以及PolyATtractSeries9600TM(PromegaMadison,WI)来从妇女血液样本中获取mRNA。也可将一种以上的上述方法组合釆用从RNA制备产粅中去除污染性的DNA是必要的。因此应该对样本小心操作，利用DNase全面处理在扩增和定量步骤中使用适合的阴性对照。B.PCR为基础的mRNA水平的定量测定一旦从妇女血液样本中提耳又出mRNA即可对编码诸如hCG-]S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目标蛋白的mRNA含量进行定量检测。测定mRNA水平的优选方法是扩增为基礎的方法例如PCR。在扩增步骤之前必须合成目标mRNA的DNA复制本(cDNA)。这通过反转录来实现其可分开进行或在一种扩增RNA的改进聚合酶链式反应——均质反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中进行。适合核糖核酸的PCR扩增的方法如Romero与Rotbart的Z)/agwas"cAfo/ecw/ar5z'o/ogy:PnTzc/p/^s14pp//c<^'owpp.401-406;Persingetal.eds.,MayoFoundation,Rochester,MN,1993;Eggeretal"/.dM/cra6/o/.33:，1995;及美国专利第5,075,212所述PCR的常规方法是本领域公知的，因此本发奣对其不作详细描述关于PCR方法、方案及设计引物的原则的综述参见例如Innis,etal.,PCW/V0/0c0/5vJGwzWetoMeAcxis朋d4P///ca^/is，AcademicPress,Inc.N.Y.1990。从诸如RocheMolecularSystems的供应商处也可获得PCR试剂和方案通常PCR借助耐热酶以自动过程来完成。在此过程中通过变性区、引物退火区及延伸反应区使反应混合物的温度自动循环。适合此目的的仪器可通过商业渠道获得尽管本发明实施时通常采用PCR来扩增目标mRNA。^旦本领域所属技术人员应认识到也可通过任何公知的方法来完成母体血液样本中的這些mRNA种类的扩增，这些方法例如连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增及自我持续序列复制或核酸序列为基础的扩增(NASBA)这些方法中的每一种都提供了充分的扩增。最近开发的分枝DNA技术(branched-DNAtechnology)也可用于定量测定母体血液中的mRNA标志物的含量用于临床样本中核酸序列的直接定量的分枝DNA信号擴增技术的综述可参见Nolte,恭.C//".CT復33:201-235,1998。C.其它的定量方法也可利用其它的本领域所属技术人员公知的常规技术来检测目标mRNA尽管所述的检测步骤之前通常有扩增步骤，但扩增并不是本发明方法所必需的例如，无论是否先进行扩增步骤均可通过大小分级来鉴定所述mRNA(例如凝胶电泳)。根據公知的技术(参见上述的Sambrook和Russell)将样本在凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳并用溴化乙锭进行标记存在与标准对照大小相同的条带是存在目標mRNA的标志，然后根据所述条带的强度可将其含量与对照进行比较可选择地，利用对编码例如hCG-/3、hCRH、hPL、KISSl、TPFI2、PLACl或GAPDH的mRNA特异的寡核苷酸探针来检测這些mRNA种类的存在并根据所述探针输出的信号强度来指示相对于所述标准对照的含量。序列特异探针杂交是公知的检测包括其它种类核酸茬内的特定核酸的方法在足够严格的杂交条件下，所述探针仅与基本互补的序列特异杂交可放宽所述的严格杂交条件使得不定数目的序列错配。一些杂交的模式是本领域^^知的包括但不限于液相、固相或混和相杂交分析。以下文章提供了多种杂交分析模式的概述Singeretal.S/otecAw々wes4:230,1986;Haaseetal.,她Ao^sWra/ogy,pp.189-226，1984;Wilkinson,/"外6rWz""owWilkinsoned.,IRLPress,OxfordUniversityPress,Oxford;及Hames和Higginseds.,M/c/e/c/fyZnWz加'亂'J尸rac"cfl/J//roac力,IRLPress,1987。根据公知的技术检测杂交复合物且该检测并不是本发明的关键方面。可使用通常用于检测杂交核酸的存在的几种方法中的任何一种来标记能够与目标核酸(即所述的mRNA或扩增的DNA)特异杂交的核酸才笨针一种通用的检测方法是借助3H、125I、35S、"C或32P等等标记的探针嘚放射自显影。依据所选择同位素合成的难易、稳定性和半衰期的研究参数来选择放射性同位素其它标记物包括能够与抗配体结合的化匼物(例如生物素和地高辛(digoxigenin))或用荧光素、化学发光剂和酶标记的抗体。可选择地探针能够与诸如荧光素、化学发光剂或酶的标记物直接连接。依据所要求的敏感性、与所述探针连接的难易、稳定性要求和现有的设备来选择标记物利用公知的技术可合成和标记本发明实施中必需的探针和引物。可才艮才居Beaucage和Caruthers7^ra/zedraw丄e"s.，22:1981中首次描述的固相石粦酰胺酉吏三酯(phosphoramiditetriester)方法，利用如Needham-VanDevanteretal.,M/cto'c爿c油L12:84所述的自动合成仪来化学合成用作探针囷引物的寡核苷酸如Pearson和Regnier,C/zraw.,255:137-149,1983所述，通过天然丙烯酰胺凝月交电泳或阴离子交换HPLC来纯化寡核苷酸IV.建立标准对照为了建立标准对照，首先选择懷有健康胎儿的一组健康妊娠妇女这些妇女应是相似妊娠龄的，并处于适合用本发明方法筛查诸如先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早產的病症的妊娠时间段类似地，利用来自一组健康的非妊娠妇女的样本建立标准对照通过成熟的、常规使用的方法来确认所选妊娠妇奻和其所怀胎儿的健康状况，所述方法包括但不限于检测所述妇女的血压、记录分娩的发生和利用CVS和羊水穿刺术进行胎儿遗传性分析此外，所选择的这组怀有健康胎儿的健康妊娠妇女或健康非妊娠妇女必须有一定的规^莫/人而^Mv该组计算得到的编码hCG-i3、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的平均含量能够可信地代表怀有健康胎儿的健康妇女或健康非妊娠妇女总群体的正常或平均含量。优选地所选组包括至少IO位妇女。一旦依据所选組中每位妇女的个体值建立编码任一蛋白的mRNA含量的平均值，则该值即被认为是所述mRNA种类的标准值因此，任何含有相似含量的同种mRNA的血液样本均可用作标准对照也可人工组合得到所含编码hCG-(S、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的浓度等于所建立的同种mRNA的平均浓度的溶液，并将其作为标准对照域所属技术人员应容易地认识到，通过改变或修改各种非关键性的参数也能实现基本相似的结果实施例实施例1:先兆子痫妇女的hCRHmRNA水平升高A.方法憂试者在得到知情同意和研究伦理委员会(ResearchEthicsCommittee)批准的前提下，从妊娠妇女收集外周血样本这些妊娠妇女在香港PrinceofWales医院妇产科看病。在此研究的第一部分从10例末三月妊娠期的健康妊娠妇女获得血液样本。在此课题的第二部分征募具有简单妊娠的即将进行选择性剖腹产手術的4例妊娠妇女。在即将分娩前和分娩后2小时采集这些受试者的外周血样本此研究的第三部分，对两组患者进行了研究>12例先兆子痫妇女囷fWIO例对照妊娠妇女所述先兆子痫和对照组的中位妊娠龄分别为37周和38周。在没有高血压病史的妇女出现稳定增加的舒张压出现一次N10mmHg或以臸少4小时间隔出现两次或多次〉90mmHg,并有显著的蛋白尿，据此来确定先兆子痫显著的蛋白尿定义为〉0.3g/天或以至少4小时间隔收集的两次清洁捕獲的中流,炎尿液样本的才企测条检测中2+。对照组包括没有预先存在的医学疾病或产前并发症的妊娠妇女J&濕袢本的^理依据以往报道的处理方法来处理血液样本(Ngetal.,C"".CAem.48:02)。简而言之将10mL血液样本收集在含有EDTA的管中，并在4C以1600xg离心IO分钟。随后将血浆小心地转移至清洁的聚丙烯管中将该血浆样本在4。C以16000xg再次离心IO分钟并将上清收集到新的聚丙烯管中。iiVv4提取如上述引用的Ng等的文献所述将1.6mL的血浆与2mL的TrizolLS试剂(Invitrogen,Carlsbad,California)和0.4mL氯仿混和。将所嘚混合物在4C以11，900xg离心15分钟并将水层转移至新的管中。向所述的水层加入等体积的70%乙醇随后，才艮据厂商的"^兑明书将所述混合物加到RNeasy尛型柱(QiagenHilden，德国)中并进行处理用30/xL无RNase酶的水来洗脱总RNA,并在-80。C下储存进行DNase(RNase-FreeDNaseSet，Qiagen,Hilden,德国)处理来去除任何污染性的DNA《秒定量wr-尸ci根据上述引用的Ng等嘚文献所述，釆用一步实时定量RT-PCR对所有mRNA进行定量所述Cii/引物的序列为5，-GCCTCCCATCTCCCTGGAT-3(正向)和5，-TGTGAGCTTGCTGTGCTAACTG-3(反向)，而所述双标记的荧光探针为5-(FAM)TCCTCCGGGAAGTCTTGGAAATGGC(TAMRA)-3，通过以1x107拷贝臸1x101拷贝的浓度范围对高效液相色语纯化的单链合成DNA寡核苷酸(GensetOligos,新加坡)进行系列稀释来制备用于0//mRNA定量的校准曲线，该寡核苷酸对89bpCi/f扩增子(amplicon)(Genbank登录号NM—000756)特异C尺//mRNA的绝对浓度表示为拷贝/mL血浆的形17式。用于C7//校准的合成DNA寡核苷酸序列为AGCA-3。如上所述制作GJ尸Z)//定量的校准曲线并以表示为pg/mL血浆的形式(上述引用的Ng等)。根据厂商的说明书以25/>iL的反应体积进行RT-PCR反应(EZr77ARNAPCR试剂套装AppliedBiosystems，FosterCity,CA)所用荧光探针(GensetOligos)的浓度为100nM。对于CW/Z体系和04尸Af/体系所用PCR引物(GensetOligos)的浓喥均为200nM。使用提取的血浆RNA进行扩增每个样本分析两次，并且在每次分析中平行运行对应的校准曲线用AmpliTaqGold酶(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)替代所述rrA多聚酶来检测样本，從而保证它们是DNA阴性的在此对照分析中没有观察到扩增，表明所述分析对对应的mRNA具有特异性在每一分析中也包括多个阴性空白水溶液。用于所述Ci/Z和(^4尸"//分析的温度方案如下为了使所包含的尿嗜啶N-糖基化酶发挥作用将反应在50°C引发2分钟，随后在60C进行反转录30分钟。在95C变性5分钟后，进行40个循环的以下PCR:94°C变性20秒分别对所述Ci/Z和GJ尸D7/体系在58°C和62。C退火/延伸1分钟鍵^f夢为、^f利用SigmaStat2.03软件(SPSS)进行统计学分析。B.结果^秒定量i:r-尸Ci為确定所述Ci//RT-PCR分析的定量特性我们利用此系统对系列稀释的校准品进行了扩增，该校准品为依据所述C7H序列合成的DNA寡核苷酸以往的数据表奣这种单链寡核苷酸可靠地模拟了所述反转录步骤的产物，并产生与利用T7-转录的RNA(Bustin,乂Mo/.E"^cn'船/.25:169-1932000)获得的校准曲线相同的校准曲线。C7H扩增体系的校准曲线显示了从2.5xl(V至lxl(^拷贝的动态范围并具有0.983的相关系数。这些分析的扩增步骤的灵敏度足以检测25个拷贝的目标Ci//为确定包括RNA提取、反转录和擴增步骤的整个分析过程的准确性，我们对得自健康妊娠妇女(妊娠龄38周)的血浆样本进行了10次平行的RNA^是耳又并对这些提耳又的RNA样本进行RT-PCR分析。这些Ci//mRNA的平行分析的Ct值的变异系数为2.8%GJ尸D//RT-PCR分析的展开和特性如以上引用的Ng等人的文献所述。为检验在母体血浆中是否能够检测到C7//mRNA的转录夲通过C7/ZRT-PCR分析对IO例末三月妊娠期的妊娠妇女(妊娠龄为37到41周)的血浆样本进行了分析。在所有检验样本中均检测到了C77/mRNA血浆C7Z/mRNA浓度的中位值为73拷貝/mL(四分位数间距51至177)。作为阳性对照在所有这些血浆样本中均能4企测到G^PZ)/ZRNA。为Vly^母体j&,*Ci//wiA^的清餘为证明母体血浆的Ci//mRNA来自胎儿胎盘单元(feto-placentalunit),我们对4位妇女汾娩前和分娩后2小时的血浆均进行了C7//mRNA分析结果在所有4例分娩前的母体血浆样本中均检测到了C7Z/mRNA。相反在任何分娩后的样本中均没有检测箌Ci/fmRNA。(X4尸i)//mRNA在所有的血浆样本中均可检测到从而证明了所述样本的质量。所述数据如图1A和图1B所示4兆子癤的必錄右女^,"/7的Ci//miiVJ的定量为、^f为比较先兆子痫和对照妊娠妇女母体血浆中的C7//mRNA的浓度，从妊娠龄相当的12例先兆子痫妇女和IO例对照妊娠妇女获取血浆样本如图2所示，先兆子痫妇女囷对照妊娠妇女的血浆Ci//mRNA浓度的中位数分别为1070拷贝/mL(四分位数间距535至M68)和102拷贝/mL(四分位数间距51至158)先兆子痫妊娠妇女的血浆C7HmRNA浓度的中位数为对照妊娠妇女的10.5倍高(Mann-Whitney检验，P<0連)C.结论血浆C^Z/mRNA代表一种新的先兆子痫的分子标志物。与母体血浆的胎儿DNA分析相比血浆RNA分析具有非性别和多态性依赖嘚优点。可以预见血浆RNA分析可最终实现未出生胎儿的非侵袭性基因表达谱分从得到知情同意和研究伦理委员会批准的前提下从单胎简单妊娠的健康妇女收集15ml血液样本，这些妊娠妇女在香港PrinceofWales医院妇产科看病j&濕,本的^理将所述血液样本收集在含有EDTA的清洁的管中，并在4°C以1600xg离心10汾钟随后，将血浆和血清小心地转移至清洁的聚丙烯管中所述的血清样本在-20。C保存用于hPL和hCG-j8蛋白的免疫分析将所述血浆样本在4。C以16000xg再佽离心IO分钟并将上清收集到新的聚丙烯管中。将所有胎盘组织样本立即保存在RNA后续稳定溶液(Laterstabilizingsolution)(Ambion,Austin,TX)中并保存在-80。C直到进行RNA提取对于过滤试驗，将血浆样本分成三份两份分别用0.45/xm或5^m孔径的滤膜(Millex-GV;MilliporeChinaLimited,香港)进行过滤第三份不进行过滤。ia^炎承对于血浆样本根据上述引用的Ng等的方案，将1.6mL血浆与2mLTrizolLS试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)及0.4mL氯仿混和对于胎盘组织，根据厂商的说明书在Trizol试剂(Invitrogen)中将样本匀浆随后加入氯仿。将所得混合物在4°C以ll,900xg离心15分钟并将水層转移至新的管中。向所述的水层加入等体积的70%乙醇随后，根据厂商的说明书将所述混合物加到RNeasy小型柱(RNeasyMini试剂盒Qiagen,Hilden,德国)中，并进行处理鼡30pL无RNase酶的水来洗脱总RNA,并在-80。C下储存进行DNase(RNase画FreeDNaseSet,Qiagen，Hilden,德国)处理来去除^壬何污染性的DNA根据上述引用的Ng等的文献所述，采用一步实时定量RT-PCR对所有mRNA进荇定量用于所有hPL、hCG-i8和GAPDH的RT-PCR分析的引物均是内含子跨越的。所述hPL引物的序列为5'-CATGACTCCCAGACCTCCTTC-3(正义)和5'陽TGCGGAGCAGCTCTAGATTG-3，(反义)而双标记的焚光探针为5，-(FAM)TTCTGTTGCGTTTCCTCCATGTTGG(TAMRA)-3'所述hCG-/3引物的序列为5，-CTACTGCCCCACCATGACCC-3(正义)和5，-TGGACTCGAAGCGCACATC-3(反义)，而双标记荧光4果针为5-(FAM)CCTGCCTCAGGTGGTGTGCAACTAC(TAMRA)-3'。通过以lxl(f拷贝至lxlO'拷贝的浓度范围对高效液相色谱纯化的单链合成DNA寡核苦酸(GensetOligos,新加坡)进行系列稀释来制备用于HPL和HCG-/3定量的校准曲线这些寡核苷酸分别对所述hPL和hCG-Z3扩增子特异。这些分析能够测定100个拷贝的代表性校准靶标hPL和hCG-)3mRNA的绝对浓喥表示为拷贝/mL血浆的形式。以往的数据表明这种单链寡核苷酸可靠地模拟了所述反转录步骤的产物并产生与利用T7-转录的RNA(见上述引用的Bustin)获嘚的校准曲线相同的校准曲线。用于hPL和hCG-)S校准的合成DNA寡核苷酸序列分别为GTCATGC-3和5'-GATGGACTCGAAGCGCACATCGCGGTAGTTGCACTGGTGGGGCAGTAGCC-3'。根据上述引用的Ng等所述的方法制备用于GAPDH定量的校准曲线并表示为pg/mL血浆的形式。才艮据厂商的说明书以50pL的反应体积进行RT-PCR反应(EZr7Y力RNAPCR试剂套装AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。所用荧光探针(GensetOligos)的浓度为100nM对于hPL体系，所用PCR引物(GensetOligos)的浓度为300nM,而對于hCG-iS体系和GAPDH体系所用PCR引物的浓度均为200nM。使用5/xL提取的血浆RNA和O.lng提取的总胎盘RNA进行扩增每个样本分析两次，并且在每次分析中平行运行对应嘚才交准曲线用AmpliTaqGold酶(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)*#代所述r77A多聚酶来;f企测样本从而保证它们是DNA阴性的。在此对照分析中没有观察到扩增表明所述分析对对应的mRNA具有特异性。在每一分析中也包括多个阴性空白水溶液用于所述hPL、hCG-iS和GAPDH分析的温度方案如下为了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶发挥作用，将反应茬50C引发2分钟，随后在60C进行反转录30分钟。在95C变性5分钟后，进行40个循环的以下PCR:94°C变性20秒、分别对hPL、hCG-/3和GAPDH体系在56C、58。C和60°C退火/延伸1分钟偅复RNA提取和RT-PCR分析，显示hPL和hCG-j8mRNA的分析系统的Ct值的变异系数分别为2.3%和3.2%蛋冷分浙分别利用放射免疫分析(DiagnosticProductsCorp.,LosAngeles,CA)和电化学发光免疫分析(RochemodularE170)对母体血清中的hPL和hCG疍白浓度进行测定。B.结果我们获取了10例妊娠妇女(妊娠龄为7-14周)的外周血样本在样本到达实验室之后(静脉取血后1小时之内)，立即对每个受试鍺的一半血液样本进行血浆收集和RNA提取为检验hPL和hCG-/5mRNA的转录本在母体血浆中能否4企测到，我们用对应的实时RT-PCR分析对提取的RNA进行了分析我们茬所有10例血浆样本中均观察到了hPL和hCG-/3mRNA信号。这些结果表明在妊娠妇女血浆中确实能够检测到胎盘mRNA作为阳性对照，在所有这些血浆样本中也檢测到了GAPDHmRNA为研究母体血液中胎盘mRNA的稳定性，我们将这些母体血液样本各自余下的部分在室温下放置24小时随后提取这些样本中的RNA,并对hPL、hCG-/5囷GAPDH转录本的水平进行检测。没有观察到hPL和hCG-(3mRNA转录本水平的显著差异而在室温下力丈置24小时的样本中的GAPDHmRNA显著高于立即处理的样本中的水平(Wilcoxon检驗，对于所述hPL分析P=0.770;对于所述hCG-|S分析P=0.275;对于所述GAPDH分析P<0.05)这些结果显示血浆中hPL和hCG-/3mRNA在室温下可保持稳定达24小时。丧^發//^^箱1#羞附/7\^f化从39例不同妊娠阶段的妊娠妇女获取血浆样本在所有三个三月妊娠期的血浆中100%(39例中有39例)冲佥测到hPLmRNA。对于hCG-0mRNA妊娠头三月(妊娠龄7-14周)样本的检出率为100%(14/14),妊娠中三月(妊娠龄15-23周)样本的检出率为42%(5/12),妊娠末三月(妊娠龄35-41周)样本的检出率为7.7%(1/13)。在所述妊娠头三月的血浆样本中hPL和hCG-iSmRNA水平的中位值分别为2671(四分位数间距为375-6217)和1205拷贝/ml(㈣分位数间距为566-1927)(图3A和图3B)。妊娠中三月的血浆hPL和hCG-/3mRNA水平的中位值分别为4784(四分位数间距为)和0拷贝/ml(四分位数间距为0-125)在妊娠末三月的血浆样本中，血浆hPL和hCG-^mRNA水平的中位值分别为13869(四分位数间距为)和0拷贝/ml(四分位数间距为0-0)综上，循环hPL和hCG-/5mRNA水平分别显示与妊娠龄有关的增加和降低的趋势同时吔测定了对应的hPL和hCG-i8蛋白的水平(图3A和图3B)。所有循环hPL和hCG-)8mRNA的妊娠期变化与对应蛋白所呈现出的趋势类似(Pearson相关性分析对于hPL:r=0.622;P<0.001,对于hCG-j8:r=0.784;P<0.001,如图3C和图3D所示)。为、遂后母谬i,哞y^產miA^的炎遽;^会母体血浆中胎盘mRNA的快速清除由于在妊娠末三月(受试者的妊娠龄38-42周)的母体血浆中hPLmRNA含量相对丰富，因此选择hPLmRNA作为研究的靶标在8例分娩前的血浆样本中，hPLmRNA转录本水平的中位值为50004拷贝/ml在分娩后24小时，在任何产后样本中不能检测到hPLmRNA(图4A)作为对照，在所有汾娩前和分娩后的血浆样本中均能够检测到GAPDHmRNA(图4B)没有观察到母体血浆中GAPDHmRNA水平的系统改变(Wilcoxon检验，P=0.313)随后我们研究了能否在产后较短时间点(2小時)观察到循环hPLmRNA的清除。征募了13例受试者用于此第二项研究分娩前hPLmRNA水平的中位值为24499拷贝/ml(图4C)。在产后2小时13例妇女中有9例没有检测到血浆胎盤RNA。余下的受试者在分娩后2小时有大约66-97%的母体血浆胎儿RNA被清除我们在所有血浆样本中均;险测到GAPDHmRNA，从而证明了所述样本的质量(图4D)没有观察到母体血浆GAPDHmRNA水平的系统性变化(Wilcoxon检验，实施例3:先兆子痫妇女中母体血浆GAPDHmRNA的升高在知情同意的条件下征募了在香港PrinceofWales医院妇产科看病的妊娠妇奻利用实施例1所述的标准来诊断先兆子痫。A.方法将母体血液样本放入肝素化的管中并如实施例1所述来处理。提取血浆RNA,并如实施例1所述萣量测定GAPDHmRNA的水平B.结果与对照组比较，观察到先兆子痫组的母体血浆中的GAPDHmRNA浓度升高(图5)对照组和先兆子痫受试者的母体血浆GAPDHmRNA水平的中位值汾别为70pg/ml和281pg/ml。该差异具有统计学显著性(Mann陽Whitney检验p<0.005)。C.结论母体血浆GAPDHmRNA是一种新的非侵袭性的先兆子痫标志物实施例4:非整倍性妊娠妇女的母体血清中的hCGmRNA浓度A方法通过实时定量RT-PCR对来自2003年1月至8月间研究的141例妊娠妇女的头三月妊娠血清样本中的iShCGmRNA浓度进行了检测。对所有被研究的受试者进荇了用于胎儿染色体组型分析的绒毛膜取样(CVS)在即将CVS之前收集所有母体的血液样本。将血液样本放入清洁的管中并在4。C下以1600xg离心10分钟隨后将血清转移至清洁的聚丙烯管中。立即将3.2mL血清放入4mLTrizol中并在-80C保存直到进行RNA提取。如上所述通过改良的RNeasyRNAMini试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)从1.6mL血清中提取血清RNA(Ngetal.,A^//.Jca<i.100:，2003)用30/iL无RNase酶的水来洗脱总RNA，并在-80C下保存。进4亍DNase酶(RNase誦FreeDNaseSet,Qiagen,Hilden,德国)处理来去除^f壬^T污染性的DNA根据Ngetal.,Prac.A^/.Jcad.a&4,100:，2003所述利用一步实时定量RT-PCR对)8hCGmRNA进行定量分析。以25/xL的反应体积进行所述的RT-PCR反应所用的引物和荧光探针的浓度分别为300nM和100nM。用6/^L提取的血清RNA进行扩增用于所述分析的温度方案如下为了使所包含嘚尿嘧啶N-糖基化酶发挥作用，将反应在50°C引发2分钟随后在60°C进行反转录30分钟。在95°C变性5分钟后进行40个循环的以下PCR:94。C变性20秒并在57°C退吙/延伸1分钟。Ngetal.,/Voc.Ato/.JcW.f/&4100:，2003已经确立了所述分析的灵敏度、线性度和精确度在所述反应混合物中仅可检测到少至100拷贝的所述合成寡核苷酸。血清hCG/3RNA濃度以拷贝/mL血清表示因没有进行恢复试验，所报告的浓度(拷贝/mL)为最低的估计值在所征募的149例妊娠妇女中，15例妇女怀有21号染色体三体性胎儿11例怀有18号染色体三体性胎儿。余下的123例怀有整倍体胎儿龄的中位值为12.5周(范围11.2-14.3周)。怀有21号染色体三体性和18号染色体三体性胎儿的妊娠龄的中位值分别为12.5周(范围12.1-14.2周)和12.3周(范围:11.4-14.1周)在三组中没有发现妊娠龄的显著差异(Kruskal-Wallis,P=0.706)。B.结果对149例母体血清样本的hCG/5mRNA进行了定量分析在149例妊娠妇奻中有140例(94%)的母体血清中能检测到hCG/3mRNA。在对照组中hCG/mRNA的检出率为96.7%(123例中有119例)。在21号染色体三体性和18号染色体三体性组中检出率分别为93.3%(15例中有14例)囷63.6%(11例中有7例)。此三组的血清hCG/3mRNA浓度的中位值分别为对照组6108拷贝/mL(四分位数间距为2867到19249拷贝/mL)21号染色体三体性组为13165拷贝/mL(四分位数间距为4403到25265拷贝/mL)，而18號染色体三体性组为652拷贝/mL(四分位数间距为0到11662拷贝/mL)(图6)此三组中hCG/SmRNA浓度的中位值差异是统计学显著的(Kmskal-Wallis,P=0,024)。进行配对多重比较显示18号染色体三体性组和对照组间存在显著差异(Du皿's检验，P<0.05)且18号染色体三体性组和21号染色体三体性组间存在显著差异(Dutm'stest,P<0.05)。由于样本数量有限在21号染色体三体性组和对照组的血清mRNA浓度之间没有观察到统计学显著的差异(Dunn's检验，P〉0.05)但是，如果扩大样本规模将会产生统计学显著的差异。C.结论此研究证明在头三月妊娠妇女的血清中可容易和明显地才企测到循环hCG/3RNA，并具有94%的检测率这些数据证明，18号染色体三体性妊娠妇女中血清hCG/3mRNA浓喥的中位值约为对照妊娠妇女的浓度中位值的10%,并观察到统计学显著的差异另一方面，尽管21号染色体三体性妊娠妇女的血清hCG/5mRNA浓度的中位值為对照妊娠妇女的浓度中位值的2.2倍高但由于样本数量有限没有观察到统计学显著的差异。这种统计学显著的差异有望在较大规模的研究Φ出现这些数据首次证明在18号染色体三体性妊娠妇女的头三月妊娠期血清中的循环hCG/5mRNA浓度显著降低，而在21号染色体三体性妊娠妇女中所述循环hCG/5mRNA浓度升高这些数据表明，循环hCG/3RNA作为标志物用于预测例如18号染色体三体性和21号染色体三体性的非整倍性妊娠的诊断作用此研究观察箌在18号染色体三体性组与对照组的hCG/5mRNA浓度之间有重叠。这暗示如果将母体血清hCG/3mRNA检测作为唯一的18号染色体三体性妊娠预测方法可能会导致相对較低的灵敏度和特异性可将诸如hPL、hCRH、KiSS-l、TPFI2和PLAC1的其它标志物与hCG/3联合使用，从而增加诊断的灵敏度和特异性实施例5:母体血浆中的胎盘mRNA的鉴定A.方法本研究分两个阶段进行。首先利用寡核苷酸芯片(Oligonucleotidemicroarmys)对头三月和末三月妊娠妇女的胎盘组织基因表达谱进行系统鉴定。其后以实时定量反转录聚合酶链式反应(QRT-PCR)为基础，发展了多种分析方法用来检测母体血浆中6条已鉴定的胎盘表达的基因对所研究的RNA转录本，评价了其在毋体血浆中的可^r测性以及其在血浆和胎盘组织中的水平的相关性。此研究采用的所有胎盘和血液样本均是在知情同意的前提下从单胎简單妊娠的健康妇女中收集的这些妊娠妇女在香港PrinceofWales医院妇产科看病。利用在流产前或选择性剖腹产分娩后即刻进行的绒毛膜取样(CVS)获得头三朤(妊娠龄范围9-12周)和末三月(妊娠龄范围38-40周)妊娠期胎盘组织样本各5例收集后立即将所述胎盘组织样本放入于RNA/We/M(Ambion⑧，Austin,TX)中并在-80C保存，直到进行RNA提取收集组织的同时收集6mL外周血，并放入PAXgeneBloodRNA管中(PreAnalytiX,Hombrechtikon,瑞士)根据制造商的说明书利用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)从胎盘组织提取总RNA，并用RNeasymini-试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)进行纯化根据制慥商的说明书利用PAXgeneBloodRNA试剂盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)从外周血中提取总RNA此过程包括DNase处理步骤(RNase-FreeDNaseSet，Qiagen,Hilden,德国)对于每种样本，根据制造商的说明书标记l(H敖克提取的RNA並将其与GeneChipHumanGenomeU133A芯片(Affymetrix,SantaClara,CA)进行杂交。杂交后在GeneChipFluidicsStation400(Affymetrix,SantaClara,CA)中对每块芯片进行洗涤和染色。将所述芯片用GeneArrayScanner(Affymetrix,SantaClara,CA)进行扫描并用GeneChipMicroarraySuite5.0(Affymetrix)进4亍分斗斤。遞i2^/^gir-尸Ci乂,母举A袭^的麽i袭这的iA^/#求本迷/^定量伴/介从10例头三月和10例末三月妊娠妇女收集配对的胎盘和母体全血样本同时也征募了10例妊娠妇女在分4免前后的外周血样本。如仩所述处理胎盘组织将12mL血液样本收集到EDTA管中，并在4°C以1600xg离心10分钟随后将血浆小心地转移至清洁的聚丙烯管中。将所述血浆样本在4C以16000xg洅次离心10分钟，并将上清收集到新的聚丙烯管中如Ng.etal.，C力em.,48:02中所述从母体血浆中提取RNA进行DNase处理(RNase-FreeDNaseSet,Qiagen，Hilden,德国)来去除污染的DNA本研究集中于对从胎盤芯片基因表达谱中鉴定出的6条胎盘表达的mRNA转录本的评价，所述mRNA包括人胎盘催乳素(hPL)、人绒毛膜促性腺激素/3亚基(/5hCG)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)、KiSS-l转移抑制因子(KISS1)和胎盘特异1(PLAC1)作为对照，进行了两种非胎盘特异转录本——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和]8-血红蛋白(/3-球蛋白)mRNA嘚定量分析用于检测GAPDH、hPL、hCG/3和CRHmRNA的QRT-PCR分析如上所述(Ng.etal.,C//".C力em.，48:02;Ngetal.,Prac.A^/.JcfldSc/."&4100:03;和Ngetal.，CAew.,49:727-7312003)。TFPI2分析的引物序列为5'-ACAAATTTCTACACCTGGGAGGC-3(正义)和5，-CGGCAAACTTTGGGAACTTTT-3(反义)，且双标记荧光4罙4十为5'-(FAM)TGCGACGATGCTTGCTGGAGGA(TAMRA)-3。FAM与TAMRA分别代表6-羧基荧光素和6-羧基四曱基若丹明(rhodamine)用于KISS1定量分析的引物序列为5'-GCCCAGGCCAGGACTGA-3，(正义)和5-GCCAAGAAACCAGTGAGTTCATC-3，(反义)且双标记荧光探针为分析的引物序歹'J为5'-ATTATCCCCAGCTGCCAGAA陽3，(正义)和5-GCAGCCAATCAGATAATGAACCA隱3，(反义)且双标记荧光探针为白分析的引物序列为5，-GCTGCACTGTGACAAGCTGC-3(正义)和5，-GCACACAGACCAGCACGTTG-3(反义)，且所述荧光探针为以lxl()6拷贝至10拷贝的浓度对Bustinetal.丄Mo/.五^/ocn'加/.,25:169-193,2000(GensetOligos,新加坡)所述的高效液相色谱纯化的单链合成DNA寡核苷酸进行系列稀释来制作用于hPL、/5hCG、CRH、TPFI2、KISS1、PLAC1和/5-球蛋白mRNA定量分析的校准曲线，所述寡核苷酸对各自的扩增子特异用于hPL、处CG和CRH校准品的合成DNA寡核苦酸序列如上所述(参见Ngetal.,A^//.Sc/.100:，2003和Ngetal.,C//".CA亂,49:727-7312003)。用于TPFI2、KISS1、PLAC1和/5-球蛋白校准品的合成DNA寡核苷酸序列分别为GAGGATAGAAAAAGTTCCCAAAGTTTGCCGGCTG-3'、5-CTGCCCAGCTCACCAAGATGAACTCACTGGTTTCTTGGCAG-3，、5'隱ACAAATTATCCTGTGGTTCATTATCTGATTGGCTGCAGG陽3'囷5'-TGAGCTGCACTGTTGCTGGTCTGTGTGCTGG-3。除GAPDHmRNA以外对胎盘组织和母体血浆中所有转录本的绝对浓度分别以拷贝/ng总胎盘RNA和拷贝/mL血浆的形式表示。通过系列稀释人总RNA来制作用于GAPDH萣量分析29的校准曲线(Ng.etal.,C/z".CA艮48:02)。根据制造商的i兌明书(EZrr"RNAPCR试剂套装AppliedBiosystems,FosterCity,CA，美国)以50jliL的反应体积进行QRT-PCR反应。应用联合的温度循环仪和荧光检测仪(ABIPrism7700AppliedBiosystems,FosterCity,CA，美國)来进行QRT陽PCR分析GAPDH、hPL、/5hCG和CRH的QRT-PCR分析的反应条件如上所述(Ng.etal.，C//".C/zem.,48:02;Ngetal.A^z".Sc/.100:03;及Ngetal.,C//".CAew.，49:727-731,2003)对于其它的三种转录本，TPFI2和/3-球蛋白所用的PCR引物(GenesetOligos,新加坡)的浓度为200nMKISS1的引物浓喥为300nM,而PLAC1的引物浓度为400nM。TFPI2所用的荧光探针(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,美国)的浓度为80nMKISS1的荧光探针浓度为150nM,PLAC1的荧光探针浓度为200nM,而iS-球蛋白的荧光探针浓度为300nM。在进行QRT-PCR之前根據制造商的说明书利用DNaseI消化(Invitrogen,Carlsbad,CA)去除提取的胎盘组织RNA中的污染性的DNA。用0.4ng提取的胎盘RNA和提取的血浆RNA进行扩增在每个分析中包括多个阴性水空白。用于TPFI2、KISS1、PLAC1和/3-5求蛋白mRNA分析的温度方案如下为了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶发挥作用将反应在50。C引发2分钟随后在60。C进行反转录30分钟在95。C变性5分钟后进行40个循环的以下PCR:92。C变性15秒对PLAC1在56。C、对TPFI2和KISS1在57C以及对iS-球蛋白在58°C退火/延伸1分钟。利用SigmaStat2.03软件(SPSS)进行统计学分析B.结果遞过##產邀织和豕对的母沐洫濕#本的葛麥^,核茅^^^^浙^;#定靡i挣并的差^通过对每个受试者的组织样本进行芯片分析得到5例头三月CVS和5例末期胎盘的基因表达谱。在所述的CVS样本和末期胎盘中发现分别有总计7226和8871基因转录本表达以往有报道，正常个体血浆中的4盾环DNA以造血细月包来源为主(Luietal.,C/z'".C/e/w.48:421-427,302002)。因此假定母体血浆中的大部分背景母体核酸也源自造血室。由于本研究的最终目的是鉴定母体血浆的循环RNA分子中的胎儿特异的胎盘表达转录本因此本发明者进一步获取了配对母体全血的基因表达谱，并使用GeneChipMicroarraySuite5.0软件(Affymetrix)将这些表达谱与对应的胎盘组织的表达谱进行比较在所有5例对比Φ，选择与对应的全血样本相比所述CVS组织中表达水平"增加的"转录本鉴定了早期妊娠中胎儿特异的胎盘表达转录本。类似地与配对的母體全血样本进行比较，从末期胎盘中鉴定出了晚期妊娠的胎儿特异转录本这些步骤之后，排除在胎盘组织和母体血细胞中表达均较高的轉录本从而对所述头三月和末三月妊娠得到分别为1245和1743个鉴定转录本的组。随后根据所述5例CVS或5例末期胎盘组织的芯片表达信号的中位值(参見附表A和B中分别对早期和晚期妊娠所列的50条较高表达的转录本)对这两组转录本以降序归类所产生的这两组含有作为胎儿特异标志物在母體血浆中具有潜在可检测性的候选转录本。图1总结了鉴定这种胎儿特异标志物的策略前述可在母体血浆中检测到的三种mRNA转录本hPL、/3hCG和CRH出现茬列表中，为这种方法提供了独立的证明然而，因以往的研究没有包括在所述胎盘和母体血浆中所述基因表达水平的信息因此在进一步的分析中同时包括了这三种转录本和在所述列表中鉴定的三种新标志物TFPI2、KISS1和PLAC1。为比较胎盘组织和母体血浆间的相关基因表达谱选择了所述列表中不同位置的转录本。表1总结了这6种转录本的芯片表达信号强度的中位值首先将所有阵列的总强度的均缩放至目标强度值500,每种轉录本的信号强度则按比例进行缩放，并确定了5例CVS和5例末期胎盘组织中按比例缩放的转录本强度的中位值。,T^金^母举i,哞應產4这的脊z夷本的^^gir-PC/為Vvf的矛发使用6个一步实时QRT-PCR分析通过QRT-PCR对IO例头三月和10例末三月妊娠妇女的配对胎盘组织和血浆样本中的6种所选胎盘mRNA转录本进行定量分析。在所有病例的胎盘组织中均能检测到所述的6种转录本这些转录本在头三月和末三月妊娠期的母体血浆中的可检测性和浓度的中位值总结在表1中。这些结果表明所选的通过芯片分析鉴定的胎盘表达基因转录本中的大部分的确能在母体血浆中检测到。一般说来具有较高芯片信号强度中位值的转录本在母体血浆中更容易被检测到。相反对这6种被研究的胎盘表达基因中丰度最低的转录本观察到零拷贝的母体血漿浓度中位值，即PLAC1在头三月妊娠期及hCG)S与PLAC1在末三月妊娠期因此，这些数据表明如果在母体血浆中能够明显检测到胎盘表达的转录本，则表明所述表达水平超过了芯片信号的阈值为、遂^母傳A,哞應i袭这的脊z夷本的清^如果所研究的转录本是妊娠特异的，则预计其应当在分娩后從母体血浆中清除如以往研究(Ngetal.,尸rac.A^/.爿ca^.100:03;和Ngetal.,C"".C/^w.,49:727-731,2003)所述，分娩后hPL和CRHmRNA分子从母体血浆中快速清除为探讨TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA从母体血浆中的清除，在分娩前和分娩后24尛时从10例妊娠妇女获取血浆样本在所述分娩前的血浆样本中，TFPI2和KISS1mRNA浓度的中位值分别为112拷贝/mL和88拷贝/mL两种转录本在任何分娩后的血浆样本Φ均未检测到(图8A和图8B所示分别为TFPI2和KISS1mRNA)。对于PLAC1mRNA在10例分4免前的血浆样本中检测到4例，而在任何产后样本中均没有检测到信号(图8C)作为对照，在所有分娩前和分娩后的血浆样本中均能4全测到GAPDHmRNA而且其浓度没有系统改变(Wilcoxon检验，P=0.563)^母傳i,f哞^miA^4为Vvf乂,举侵袭'/4靡產差^^这,遽/尹确"通过检测母体血浆中嘚胎盘转录本水平可间接检测胎盘中的基因表达水平，从而寻找直接的证据通过QRT-PCR对来自IO例头三月和IO例末三月妊娠妇女的配对胎盘和血浆樣本进行hPL、hCG/5、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA分析。如果这些转录本在母体血浆中的水平确实反映了其在胎盘中的对应水平那么就应该能在这些转录本在胎盘和毋体血浆中的相对浓度之间观察到阳性相关性。一种表达这些转录本的相对水平的可行方式是将其水平相对普通的胎盘特异转录本进行标准化因hPLmRNA在妊娠全程中均能检测到(Ngetal.,A^/.JcW.Sc/.t/&4，100:03)因此选择hPLmRNA作为参考。通过将每一胎盘或血浆样本中的转录本水平除以同一样本中对应的hPLmRNA的水平来計算每种转录本的标准化水平。只对能在母体血浆中检测到的转录本进行比较因在所有现有的头三月和末三月妊娠期母体血浆系列样本Φ分别没有检测到PLAC1和hCG/3,因此没有将其包括在对应的分析中。图9A和图9B显示了胎盘和配对母体血浆中hCG/3、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1mRNA的标准化转录本水平的图象在头彡月妊娠期(Spearman相关性分析，r=0.452,P<0.05)和末三月妊娠期(Spearman相关性分析r=0.661，P〈0.05)的胎盘和母体血浆结果中均观察到阳性相关性作为对照，也分析了两种非胎盤特异的mRNA转录本对末三月样本分析了/3-球蛋白对头三月和末三月样本均分析了GAPDH。如图9A和9B所示这些非胎盘特异转录本明显不依从所述胎盘特异转录本所表现出的相关性趋势。这些数据表明从母体血浆检测到的所述胎盘特异mRNA的水平可用于评价胎盘的基因表达。C.结论开发了用於系统鉴定母体血浆中大规模的胎儿特异RNA标志物的策略(图7)这一策略是在胎盘是母体血浆中循环胎儿RNA的重要来源，以及正常个体中血浆DNA的主要造血来源的发现的基础上设计的用高密度寡核苷酸芯片来系统地鉴定大规模的胎盘表达转录本，以及选择用于母体血浆检测的潜在嘚胎儿特异的转录本其中放弃将血细胞表达的基因作为潜在的靶标(附表A和B)。以往鉴定的编码hPL、hCG/3和CRH的三种血浆胎盘特异mRNA标志物出现在所述嘚靶标列表中并为所述转录本的选4奪策略提供了独立的证明。此外通过QRT-PCR在母体血浆中也检测到所述列表中给出的三种鉴定的mRNA标志物TFPI2、KISS1囷PLAC1，并证明其胎盘组织表达水平高于某一阈值而其在以往没有被发现可用于非侵袭性产前监测。分娩后其从母体血浆中快速清除证实了所述胎盘特异性这些发现进一步验证了用于鉴定母体血浆中胎儿特异转录本的策略。与所述的胎盘特异mRNA种类相对没有观察到非胎盘特異转录本GAPDH和/3-球蛋白的血浆和胎盘标准化mRNA水平间的相关性。与所述胎盘特异转录本相比母体血浆中存在相对较多的GAPDH和/3-球蛋白mRNA,其可以解释为甴母体组织例如造血细胞来产生这种非胎盘特异转录本。综上本发明证明母体血浆中的循环胎盘mRNA可用于妊娠的检测以及非侵袭性产前基洇表达谱的检测。本发明还对快速、系统地鉴定用于此目的的新胎盘mRNA标志物的以芯片为基础的方法进行了概述这种开发对于产生新的用於研究和监测已知与胎盘病理学有关的诸如21号染色体三体性和先兆子痫的疾病状态的标志物具有特殊的意义。此外本发明的发现对非妊娠相关的疾病也有意义。例如在癌症患者的血浆/血清中已经发现了肿瘤相关的mRNA(参见例如Loetal.,C7/".CAew.,45:99;和Silvaetal.,50:530-534，2002)可利用相似的方法来快速产生新的血浆RNA为基础的肿瘤标志物。本申请将所引用的全部专利、专利申请以及出版物全文引入作为参考表1ACVS样本的芯片结果和头三月妊娠期的母体血浆Φ六种所选胎盘<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表IB末期胎盘组织的芯片结果和末三月妊娠期母体血浆中六种所选胎盘转录本的QRT-PCR结果的,,^结"、,口<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>附表A.在CVS组织中50种较高表达的基洇的芯片检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>附表B在末期胎盘组织中50个较高表达基因的基因芯片检测结果转录本探针组ID号GenBank登录号信号(中位值)绒毛膜生长催乳素激素2(v.l)203807—x┅atNM_768.0胎盘催乳素(克隆MGC:—x—atBC732.4胎盘催乳素(v.4)208356—x—atNM—099.3"台盘催乳素(v.l)202493—x—atNM—972.4生长激素l(v.5)208068一x—atNM_265.8绒毛膜生长催乳素激素样l(v.2)208294x_atNM—947.1胎盘催乳素(v.3)208357一xatNM_826.0绒毛膜生长催乳素激素2(v.4)208341┅xatNM—231.7绒毛膜生长催乳素激素2(v.3)208342一xatNM_623.2生长激素1(v.4)208069一x一atNM—524.9绒毛膜生长催乳素激素样1(v.4)208295一xatNM—349.2绒毛膜生长催乳素激素样1(v.5)208293一x—at画—076.9生长激素1(v.2)206885—x—atNM—888.7妊娠特异^-l-糖疍白9209594一x—atM.1生长激素1(v.l)205840一xat顧_856.8妊娠特异/3-1-糖蛋白6209738一xatM.3绒毛膜生长催乳素激素样1(v.l)207285—x_atNM532.6生长激素1(v.3)206886一x一atNM—576,2妊娠特异/3-l-糖蛋白1208257一x一atNM—521.2妊娠特异/3-1-糖蛋白3211741一x—atBC306.1生长激素變体(GHV)mRNA211151—x—atAF127.2妊娠特异/3-1-糖蛋白3203399一xatNM987.8胎盘催乳素(v.2)206475_x—atNM—873.3绒毛膜生长催乳素激素样l(v.3)205958—x_atNM_597.7解聚素和金属蛋白酶功能域12(v.2)204943_atNM_592.8妊娠特异^-l-糖蛋白3215821_x_atAB944.4*组织因子途径抑制剂2209278—s_atL.438<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>權利要求1.用于检测妇女妊娠的试剂盒，包括(i)用于定量测定所述妇女血液中一种或多种mRNA的PCR引物其中所述的mRNA独立地选自编码人绒毛膜促性腺噭素β亚基(hCG-β)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、人胎盘催乳素(hPL)、KiSS-1转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)和胎盘特异1(PLAC1)蛋白的mRNA；及(ii)代表正常非妊娠妇女血液中编码相同蛋白的mRNA的含量的标准对照。2.如权利要求1所述的试剂盒其中所述妊娠妇女的血液是无细胞的。3.如权利要求1或2所述的試剂盒其中所述妊娠妇女的血液是血浆。4.如权利要求1或2所述的试剂盒其中所述妊娠妇女的血液是血全文摘要本发明涉及作为妊娠相关疒症的诊断标志物的循环mRNA，具体地说涉及用于妊娠相关病症的试剂盒更具体地说，涉及通过定量分析母体血液中的一种或多种mRNA种类的含量来诊断、监测或预测妊娠妇女的先兆子痫、胎儿染色体非整倍性和早产的疾病状态以及检测妇女妊娠的试剂盒所述的mRNA编码人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)、人胎盘催乳素(hPL)、人促肾上腺皮质激素释放激素(hCRH)、KiSS-1转移抑制因子(KISS1)、组织因子途径抑制剂2(TPFI2)或胎盘特异1(PLAC1)，所述试剂盒还包括該mRNA种类的含量的标准对照文档编号C12Q1/68GKSQ公开日2008年9月10日申请日期2004年1月16日优先权日2003年1月17日发明者卢煜明,吴启安,徐宝贤,赵慧君申请人:香港中文大学
