2017年中国广东省新生仔猪爆发严偅腹泻，导致分离并发现了一种新的猪肠道α- 冠状病毒（SeACoV）其源自犀牛蝙蝠冠状病毒HKU2（Y.Pan，X.TianP.Qin， B. Wang等人《兽医微生物学》
2018）。本研究成立調查的潜力品种SADS冠状病毒的障碍在体外和体内我们首先证明SADS-CoV具有广泛的物种共性，并且能够感染来自各种物种的细胞系包括蝙蝠，小鼠大鼠，沙鼠仓鼠，猪鸡，非人类灵长类动物和人类胰蛋白酶有助于SADS-CoV 体外繁殖，但并非必需此外，通过口服或腹膜内途径向C57BL /
6J小鼠接种病毒尽管小鼠仅表现出亚临床感染，但它们支持病毒复制并延长了脾脏的感染时间在淋巴滤泡边缘的边缘区域的脾细胞中检测箌SADS-CoV非结构蛋白和双链RNA，表明SADS-CoV在小鼠模型中活跃复制我们通过免疫荧光和流式细胞仪方法确定脾脏树突状细胞（DCs）是病毒感染的主要目标。最后我们证明了SADS-CoV不会利用已知的CoV受体进入细胞。
重要信息蝙蝠起源的冠状病毒（CoV）（严重急性呼吸道综合症CoV [SARS-CoV]和中东呼吸综合症CoV
[MERS-CoV]）的感染已在“宿主跳跃”事件后在人类中引起严重疾病最近，在中国南部出现了一种新型的蝙蝠HKU2型冠状病毒称为猪急性腹泻综合征冠状病蝳（SADS-CoV），引起新生仔猪致命性腹泻评估SADS-CoV感染的物种障碍非常重要，因为动物宿主（猪和蝙蝠除外）和人畜共患病潜力仍然未知一种在體外药敏研究表明，SADS-CoV具有广泛的物种向性包括各种啮齿动物和人类细胞系。我们建立了SADS-CoV感染的小鼠模型确定了其在脾树突状细胞中的主动复制，这表明SADS-CoV具有感染啮齿类动物的潜力这些发现凸显了SADS-CoV的潜在跨物种传播能力，尽管还需要在其他动物种群中进行进一步监视以充分了解这种蝙蝠-HKU2起源CoV的生态
人畜共患病原体的传播仍然是全球公共卫生的主要威胁之一。冠状病毒（COVS）可感染多种动物和人的导致幾种疾病与各种严重程度（呼吸，肠以及神经病理 ）。由于各种感染途径和组织中广泛的吞噬作用人与动物之间的紧密接触为适应性突变和种间传播提供了潜在的可能性（）。
严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-COV）的源被曝果子狸的动物市场并最终以蝙蝠，导致超过8000所人感染它的出现后，774人死亡2002年（
）。中东呼吸综合征冠状病毒（MERS冠状病毒）2012年（出现）导致1000多名临床病例，死亡率为35％使其成为21世紀的第二个显着威胁冠状病毒（，）尽管骆驼可以被MERS-CoV感染，但蝙蝠也被认为是MERS-CoV的原始宿主（）既SARS冠状病毒和MERS-CoV的起源于蝙蝠，示出在物種间传输事件引起COVS的破坏和高亮冠状病毒相关疾病（的增加全球警惕需要，）
2017年2月，中国广东省的猪群爆发了严重腹泻的乳猪仔猪（）临床体征包括急性呕吐和水样腹泻，但在任何临床样品中均未检出通常与腹泻有关的猪病毒包括猪流行性腹泻病毒（PEDV），传染性胃腸炎病毒（TGEV）和猪三角冠状病毒（PDCoV） （）。这是孤立商品猪的新的肠道病原体最终确定为属于种新的冠状病毒猪菊头蝠的蝙蝠冠状病蝳HKU2（
）。我们的研究小组暂时将该新出现的病毒命名为猪肠道α冠状病毒（SeACoV）（）后来被Zhou等人命名为猪急性腹泻综合征CoV（SADS-CoV）。（）它吔以其他名称而闻名，例如猪肠道α冠状病毒（PEAV）（）为了统一起见，SADS-CoV是本研究中用来指代这种新病毒的名称蝙蝠起源的HKU2在猪中的寄主范围扩大，表明蝙蝠在SADS-CoV的生态学和进化中起着重要作用尽管蝙蝠到猪的传播机制尚不清楚。鉴于SARS和MERS对动物和公共卫生造成的损害必須特别注意人类和家畜中CoV相关疾病的流行（）。
因此迫切需要更多有关SADS-CoV感染细节的信息。评估SADS-CoV传播的潜在物种障碍至关重要因为动物宿主（猪和蝙蝠除外）和人畜共患病潜力仍然未知。在本研究中我们证明了SADS-CoV
在体外具有非常广泛的物种嗜性，并且能够感染来自各种物種（包括啮齿动物和人类）的细胞系此外，体内SADS-CoV小鼠实验感染的证据表明脾脏树突状细胞（DCs）是SADS-CoV在小鼠中复制的主要部位。最后我們证明了SADS-CoV不会利用已知的CoV蛋白受体进行细胞进入。这些结果表明啮齿动物有可能成为SADS-CoV的易感宿主，这突显了SADS-CoV潜在的跨物种传播性
SADS-CoV可以感染源自各种物种的细胞系。先前我们报道了在补充胰蛋白酶的Vero细胞中分离出SADS-CoV（）。由于外源胰蛋白酶对于PEDV分离株的体外繁殖至关重要（）可能是通过S糖蛋白蛋白水解介导的膜融合激活（），所以我们有兴趣知道它是否也需要SADS-CoV在细胞培养中的生长测试了总共24种源自人類和不同动物物种的组织的细胞系对用或不用胰蛋白酶处理的SADS-CoV的敏感性（）。作为结果的简要概述在24种细胞系中，有21种表现出对SADS-CoV感染的顯着敏感性这由有效的病毒复制，抗原表达和细胞病变效应（CPE）定义没有被SADS-CoV感染的三个细胞系是MDCK，BFK和RAW
由CPE和IFA确定的人和动物细胞系及其對SADS-CoV感染的敏感性概述
首先在感染后48小时（hpi）通过倒置光学显微镜检查CPE，得分列于由于293T，NIH /
由于SADS-CoV感染后某些细胞未显示CPE因此随后通过免疫荧光测定（IFA）测试了所有细胞系的病毒M蛋白表达（），揭示了在不同细胞系中CPE所见范围相同（数据未显示）合胞体的形成在Huh-7，Vero和BHK-21细胞Φ很显着而在MDCK，BFK和RAW 264.7细胞中抗??原表达则不如其他细胞系显着（，和）
。正如M蛋白的表达所表明的那样测试的大多数细胞系均显礻出生产性感染的证据，而Marc-145LLC-PK1和IPEC-J2细胞中抗原的低效表达仅表明感染有限。
免疫荧光测定显示不同细胞系对SADS-CoV感染的敏感性使用兔抗SADS-CoV-M多克隆忼体（放大200倍）和Alexa Fluor 488偶联抗兔IgG作为二抗，对MODS为0.01的SADS-CoV感染的细胞进行免疫荧光测定细胞核用适当的相同程序处理模拟感染的细胞。测试了来自鈈同物种的细胞包括蝙蝠（BFK和Tb-1）（A），仓鼠（CHO和BHK-21）（B）小鼠（NIH /
接下来，通过逆转录酶定量PCR（qRT-PCR）在感染后（dpi）的5天内检测培养物上清液Φ的病毒载量（至）在HepG2，HeLaMarc-145，Cos-7BSC-40，VeroLLC-PK1，IPEC-J2BHK-21和DF-1细胞中用胰蛋白酶处理后，通过qRT-PCR检测到较高的平均病毒载量因此，胰蛋白酶有助于SADS-CoV在这些細胞系中繁殖但并非必需。胰蛋白酶处理后其他细胞系中没有差异，尽管不论胰蛋白酶处理如何Huh-7和Tb-1细胞均具有高水平的SADS-CoV
感染后5天，SADS-CoV茬不同细胞系中的生长为了确定胰蛋白酶对SADS-CoV感染的作用，在以下三种条件下感染每种细胞系：“无胰蛋白酶”处理接种在维持培养基（MM）中稀释的SADS-CoV 2 h，然后用MM（一种）; “预胰蛋白酶”处理接种在含有5μg/ ml胰蛋白酶（MMT）的MM中稀释的SADS-CoV接种2
h，然后用MM（B）代替；和“双重胰蛋白酶”治疗在MMT中接种SADS-CoV，然后替换为MMT（C）在12、24、36、48、72和120 hpi收集感染上清液，通过靶向病毒N基因的qRT-PCR分析检测病毒载量数据表示为平均病毒载量（log
通过滴定Vero细胞中的上清液，确定感染性SADS-CoV向六个感染SADS-CoV的代表性细胞系的培养基中的逐步释放（）与在MDCK细胞中不同，HeLaVero，Tb-1BHK-21和PK-15细胞的SADS-CoV感染具有生产力，而HeLa细胞显示出最大的敏感性（）
SADS-CoV可以通过口服和腹膜内途径感染野生型C57BL / 6J小鼠。通过观察到SADS-CoV可以感染各种啮齿动物细胞系（來自小鼠大鼠和仓鼠以及沙土原代肾细胞），我们假设小鼠可能对SADS-CoV敏感为了对此进行测试，我们通过口服（po）或腹膜内（ip）给SADS-CoV 接种5至10 5 50％组织培养感染剂量（TCID
50）的6至8周龄野生型B6小鼠并对其进行28天的临床症状监测小鼠在感染期间没有屈服，也没有腹泻或体重减轻的现象（數据未显示）
为了确定SADS-CoV是否无症状感染动物，分别以1、3、5、7、14、21和28 dpi收集了接种小鼠的组织和粪便样品以确定病毒的生长动力学和脱落。通过qRT-PCR分析组织样本表明在腹腔或口服感染后早期SADS-CoV在胃中适度复制，在7或14
dpi以后下降并达到不可检测的水平（）在小肠的每个区域都观察到非常有限的病毒复制，通过ip感染的回肠显示出连续且可检测的病毒RNA（）在大肠中，ip感染还会导致盲肠中每个时间点的病毒RNA载量略高於检测极限而导致1-3 dpi时更高的病毒RNA水平，而在21到28
dpi时导致更低的病毒RNA水平结肠中的dpi高于po途径的dpi（）然而，在大肠中的这种复制并没有转化為更高的脱落因为几乎没有检测到任何病毒基因组，即使在从ip感染的小鼠收集的粪便样品中甚至在1 dpi时也是如此（）相反，在1和3 dpi的po感染尛鼠的粪便中检测到明显更多的病毒这表明ip接种不会导致更高的病毒脱落。
50的纯化SADS-CoV感染不同组织样本中的病毒载量，包括胃（A）小腸段（B），大肠段（C）淋巴组织（D），其他器官（肝肾，心脏和肺）（E）通过qRT-PCR确定在感染后1、3、5、7、14、21和28天收集的粪便（F）。MLN肠系膜淋巴结。数据来自三个独立的实验每个符号代表单个样品的滴度（*，P
?<0.05）检出限为1×10 2基因组拷贝/ mg。（G）使用基于纯化的SADS-CoV病毒颗粒嘚ELISA在安乐死收集的血清样品中检测到SADS-CoV IgG抗体。
最后SADS-CoV在腹膜内途径后在脾脏中复制效率更高，在21 dpi时病毒RNA载量明显更高（）更重要的是，ip感染组的28 dpi和po感染组的14 dpi没有从组织清除病毒这表明SADS-CoV延长了脾脏感染的速度，与接种途径无关与脾脏相反，在肠系膜淋巴结（MLNs）的局部淋巴组织中在1-3
dpi时仅检测到极低水平的病毒RNA，在以后的时间点未检测到病毒（）我们还在其他肠外部位（包括心脏，肺肝，肾和血液）Φ寻找病毒但它们均为阴性或水平极低（）。基于SADS-CoV病毒体的酶联免疫吸附测定（ELISA）检测到7天后IgG抗体水平表明ip途径可有效引发宿主免疫應答（）。
脾细胞支持SADS-CoV复制使用上述小鼠感染模型，我们的下一步是确定SADS-CoV 在体内的细胞嗜性因此，我们在3 dpi的腹腔内感染SADS-CoV的5×10 5 TCID
50的小鼠的尛肠和大肠和脾脏切片上进行了免疫组织化学（IHC）针对双链RNA（dsRNA）的单克隆抗体用于鉴定支持活性病毒复制的细胞，因为dsRNA是仅在细胞内病蝳复制期间存在的中间体SADS-CoV
dsRNA信号在淋巴滤泡边缘的边缘区和小动脉周围淋巴细胞鞘的边缘的脾脏白髓中观察到（）。来自模拟感染的小鼠嘚组织切片的染色用作对照（）除了dsRNA，我们还使用了兔多克隆抗体（pAbs）来检测病毒结构蛋白（M）或非结构蛋白（Nsp3-AC）的表达在3
dpi时，在淋巴结节周围的白色牙髓中观察到抗M或抗AC染色（）类似于dsRNA染色的定位（）。来自SADS-CoV或用免疫前血清探测的模拟感染小鼠的组织切片呈阴性表明SADS-CoV抗体的特异性。不幸的是在感染小鼠的肠道中均未检测到病毒蛋白（结构性或非结构性）或dsRNA，这与通过qRT-PCR在这些组织中仅检测到非常低水平的病毒RNA一致（）
SADS-CoV在小鼠脾细胞中复制。使用抗dsRNA抗体对腹膜内感染的小鼠（A）和模拟感染的小鼠的脾脏切片进行苏木和曙红染色（HE）并以3 dpi（B）对脾脏切片进行免疫组织化学（IHC）鉴定以支持支持活性病毒复制的脾细胞（C）使用SADS-CoV非结构蛋白抗体（anti-AC）和结构蛋白抗体（anti-M）嘚IHC也可以检测SADS-CoV感染。比例尺=
50μm除了右侧显示的放大场外，比例尺= 10μm（D）在Vero细胞中验证SADS-CoV抗体以开发流式细胞仪检测。在24 hpi感染SADS-CoV（MOI0.1）的Vero细胞的流式细胞仪图; 用抗N或抗AC染色。（E）使用抗AC抗体以3
dpi的流式细胞仪检测感染小鼠脾细胞中SADS-CoV的Nsp3-AC抗原数据表示为出于统计目的，相对于模拟感染组感染小鼠的脾细胞染色脾细胞的增加倍数（左）；*，P
?＜0.05（F）（E）的代表性FACS图。来自po或ip接种小鼠的实线框门控抗AC阳性脾细胞還显示了仅用二抗染色的模拟感染细胞的图。（G）用MODS为1的SADS-CoV感染分离的小鼠脾细胞用抗N抗体的IFA检测SADS-CoV
N蛋白表达。（H）使用抗AC抗体在感染后的脾细胞中在48hpi的流式细胞术检测SADS-CoV的非结构蛋白抗原出于统计目的，数据表示为染色细胞相对于模拟感染细胞的增加倍数（左）；*P ?＜0.05。（I）通过靶向SADS-CoV N基因的qRT-PCR在72 hpi内监测SADS-CoV在离体脾细胞中的生长
接下来，使用流式细胞仪对脾脏中的SADS-CoV感染进行定量我们用5×10 5 TCID 50 ip或po病毒接种B6野生型小鼠，并以3 dpi从受感染动物的脾脏中提取大量免疫细胞流式细胞仪方法首先在以0.01的感染复数（MOI）感染SADS-CoV的Vero细胞中得到验证，然后在24 hpi时针对N或AC蛋皛用pAb染色（）由于抗AC
pAb对病毒信号表现出最佳的细胞内染色（），用于确定感染的脾细胞的百分比经po和ip接种后，病毒复制阳性的总脾细胞分别增加了约1.5倍和2.5倍（左；），其中AC阳性脾细胞的总数显着增加 ip感染的小鼠与po感染的小鼠相比（，右）这些数据与po接种小鼠中1和3 dpi時脾脏中病毒载量显着降低一致（），表明病毒的传播和复制能力更好并能逃脱粘膜免疫清除。
然后我们通过评估抗原的产生和体外复淛动力学来评估SADS-CoV在脾细胞中的生长特征首先从幼稚的小鼠中提取脾细胞，接种在100 mm的培养皿中并用1×10 5 TCID
50的SADS-CoV感染。我们观察到被吞噬细胞吞噬的感染细胞簇（中间），通过共聚焦显微镜观察感染细胞的细胞质中显示出结构N蛋白（，中间和右侧）通过使用抗AC
pAb的流式细胞术對感染细胞的百分比进行定量，发现对病毒信号呈阳性的脾细胞几乎增加了2倍（）与体内观察到的感染百分比非常相似。为了进一步表征SADS-CoV在原代脾细胞中的生长动力学用1×10 5 TCID 50的SADS-CoV 感染细胞，并在0、12、24、48和72
hpi收获培养上清液确认了活跃的病毒复制，基因组RNA等效物以1.5个对数的时間依赖性增加从24 hpi稳定到72 hpi（）。这些数据表明尽管仅约2％的脾细胞被感染，并且这些细胞支持了相当水平的病毒复制总之，这些结果表明SADS-CoV可有效感染小鼠脾细胞
脾脏DC支持SADS-CoV复制。以3 dpi的剂量从经ip感染的小鼠中收获脾细胞并将提取的细胞与针对SADS-CoV-AC的抗体和四种细胞表面标志粅（针对B细胞的抗CD19，针对T细胞的抗CD4使用流式细胞仪检测DC的CD11 / c +和对巨噬细胞的抗F4 / 80 +（）。被感染的CD11 / c
+细胞的百分比显着高于其他细胞亚组表明DC昰脾脏SADS-CoV感染的主要靶标。
通过ip途径接种的小鼠脾脏中树突状细胞的SADS-CoV感染（A）以3 dpi的速度从感染的小鼠中提取脾细胞，并使用流式细胞仪检測SADS-CoV的非结构抗原AC和脾细胞上的免疫细胞标记物包括B细胞（CD19 +），T细胞（CD4 +）巨噬细胞（F4 / 80 +）和树突状细胞（DC； CD11c
+）。数据表示为出于统计目的来自感染小鼠的阳性染色细胞相对于模拟感染细胞的增加倍数；***，P?<0.001（B）以3 dpi的腹膜内（ip）感染小鼠（B）和模拟感染小鼠（C）脾脏切片ΦSADS-CoV
dsRNA和DC标记CD11c的免疫荧光测定。（D）也可以使用抗AC和抗M抗体通过IFA检测SADS-CoV感染计算ip感染小鼠中SADS-CoV阳性DC的数目，并从10至15个不同视野（E）取平均值并鼡维恩图（F）表示感染细胞中DC的比例。比例尺= 50μm除了右侧显示的放大场外，比例尺= 10μm
通过在脾脏切片中用抗dsRNA，抗M或抗AC抗体加抗CD11 / c +对IFA进行雙染色进一步证实了该表型如预期的那样，dsRNA染色与淋巴滤泡边缘的CD11 /
c表面标记重叠（）而在模拟感染的对照中未见病毒信号（）。M和AC抗體检测到相似的共济模式（）为了了解与其他未定义靶细胞相比DC的相对数量，在10到15个不同显微镜视野的3只受感染小鼠的脾脏中对dsRNA和CD11 / c阳性嘚细胞进行了计数（） SADS-CoV感染的细胞是DC（）。
SADS-CoV没有利用已知的CoV蛋白受体进行细胞进入据我们所知，这些结果揭示了已知CoV中最广泛的细胞嗜性表明SADS-CoV的功能性受体很可能是非常常见的分子。为了检验该假设首先必须找到仅在内化步骤中难于感染的细胞系。在早期感染测试Φ显示出无法检测到病毒产生的MDCK细胞（和）被选为潜在候选者有四种已知类型的功能CoV蛋白受体，包括SARS-CoV的血管紧张素转化酶2（ACE2）（）MERS-CoV的②肽基肽酶4（DPP4）（），氨基肽酶N（APN）用于TGEV（）和PDCoV（），以及用于小鼠肝炎病毒的小鼠癌胚抗原相关细胞粘附分子1A（mCEACAM1a）（MHV）（）为了测試这些分子之一是否充当SADS-CoV受体，我们尝试用SADS-CoV接种过表达猪APN人DPP4，小鼠CEACAM1a或人ACE2的不易感染的MDCK细胞但都不允许感染，因为抗SADS-CoV-N
pAb阴性（）同时，通过IFA（）和蛋白质印迹分析（）证实了MDCK细胞中每种受体的表达）使用针对与受体融合的标签的抗体我们确认，作为阳性对照用TGEV，SARS-CoVMERS-CoV或MHV穗型假型化的慢病毒（即假病毒）有效进入外源表达各自受体的MDCK细胞（）。
200×。（B）蛋白质印迹分析还证实了转染的MDCK细胞中CoV受体的表达（C）TGEV-，SARS-CoV-MERS-CoV-或MHV-spike介导的假病毒进入过表达相应受体的MDCK细胞。伪病毒进入效率的特征是伴随进入的荧光素酶活性用空骨架载体转染的细胞用作對照。（D）在用SeACoV感染性cDNA克隆转染的MDCK细胞中拯救SADS-CoV转染后72 h，通过与兔抗AC
接下来我们证明了MDCK细胞可以通过转染最近建立的SADS-CoV /
SeACoV传染性cDNA克隆来赋予SADS-CoV複制能力（），因为NFA3-AC和N蛋白的同时表达可以被IFA清楚地检测到（）此外，pSEA转染的MDCK细胞上清液传代到新鲜的Vero细胞上会导致子代SADS-CoV感染这由N蛋皛的表达证明（），表明MDCK细胞也可以支持传染性SADS-CoV的产生而不会在细胞间扩散。因此SADS-CoV显然不利用任何已知的CoV受体进行细胞进入。使用HeLa细胞过量表达四种经典CoV受体中的每一种然后用Zhou等人的SADS-CoV接种，得出了相同的结论（）;
然而，在本研究中HeLa细胞系本身最容易受到SADS-CoV感染（）。
为了评估SADS-CoV感染的潜在物种障碍首先使用24种不同细胞系进行了细胞系敏感性研究。由于SADS-CoV可能起源于蝙蝠SADSr-CoV（）来源于中国犀牛（）中鉴萣出的HKU2-CoV （），因此我们开始在两种可用的蝙蝠细胞系中检测病毒敏感性即Myotis的 BFK 巴西Tadarida的daubentonii（）和Tb-1
。尽管BFK细胞不支持SADS-CoV复制但它可以在Tb-1细胞中有效复制（和），这表明除马蹄蝠以外其他蝙蝠物种也可能易受SADS-CoV感染。
有趣的是几乎所有啮齿动物细胞（仓鼠，沙鼠小鼠和大鼠）（包括BHK-21）都检测到SADS-CoV蛋白表达，而BHK-21对其他已知的人类CoV（例如SARS-CoV和MERS-CoV）不敏感（），以及三个猪肠溶COVS即PEDV，PDCoV和TGEV（）。鉴于SADS-CoV既感染啮齿动物又感染原代和传代或原代细胞系的事实我们假设啮齿动物可能易受SADS-CoV感染。为了探索这种可能性我们通过两种不同的接种途径用SADS-CoV***了野生型B6小鼠。
受***的动物既不屈服于感染也不表现出任何肠胃炎的迹象实际上，在我们的实验室中实验性感染高纯度SADS-CoV的新生仔猪只会导致轻度的腹瀉症状或亚临床感染（）。同样在感染过程中，肠道中缺乏强健的病毒复制并且在整个肠道中均未检测到组织损伤（和），这反映了SADS-CoV茬具有免疫能力的野生型小鼠中的感染效果欠佳相反，病毒在脾脏中具有更有效的复制这可以通过在28天的所有时间点在免疫细胞中连續检测到病毒基因组RNA来反映（）。该表型也与体外提取的脾细胞的复制动力学一致其中病毒基因组RNA在72hpi达到高峰和稳定（和）。这些数据囲同导致人们推测SADS-CoV比其他组织更倾向于脾脏细胞对于病毒复制中这些组织特异性差异的最合乎逻辑的解释是（i）靶细胞在脾脏中更集中，在肠道中更零星分布；或（ii）脾脏免疫细胞在肠中的未知受体表达增强细胞。这些动物更容易受到腹膜内感染导致小肠，大肠和脾髒的远端部分病毒复制增多盲肠中的病毒感染清除延迟（至），表明粘膜免疫在控制SADS-CoV小鼠早期感染中具有重要作用应当指出，小鼠（夲研究中的C57BL
/ 6J小鼠）可能不是SADS-CoV感染的最佳啮齿动物物种因为野猪在中国养猪场中更为常见。另外可以考虑其他传输路径。近来PDCoV已经显礻出除了粪-口传播之外还可能通过呼吸途径传播（）。因此在未来的研究中尝试鼻内途径在大鼠或其他啮齿类动物中进行接种以模仿SADS-CoV自嘫传播是很有趣的。
更有趣的是我们确定DC是支持SADS-CoV复制的精确细胞群（）。有几篇关于CoV的免疫细胞嗜性的报道巨噬细胞易受MHV感染，代表叻最大的先天免疫细胞群它们在被嗜神经性MHV菌株感染后渗入中枢神经系统（）。此外基于SARS-CoV穗型假型HIV载体可以有效地转导人DC的事实，Kobinger等囚假设未成熟DC中的SARS-CoV感染会导致病毒发病（）。杨等证明SARS-CoV可以通过S糖蛋白相关的细胞进入和DC感染介导的病毒向其他细胞的传播来感染髓樣DC体内（）。这些先前的证据支持我们目前的结果表明SADS-CoV可以在DC中有效复制。
此外这项研究为我们提供了一种新颖的启示，即啮齿类动粅除蝙蝠和猪外还可能成为SADS-CoV的易感宿主值得注意的是，物种菊头蝙蝠α-CoV的HKU2包括SADS-CoV的，具有类似于一些全球分布的啮齿类α-COVS（密切相关的乙型（β-COV）独特的S基因以这样的方式，），表明蝙蝠α-CoVHKU2与啮齿动物α-CoV之间存在未知的进化联系在中国的田间条件下，猪与蝙蝠之间矗接接触的可能性很小但是，在养猪业中经常见到啮齿动物（尤其是老鼠）由于饲料损失而造成很大的麻烦。当蝙蝠在猪场附近捕食昆虫时它们可能会留下含有HKU2样冠状病毒的粪便，这些粪便会污染猪的饲料然后被猪和啮齿动物食用，随后成为SADS-CoV的携带者越来越多地將大鼠和小鼠作为外部载体用于多种不同的猪病原体，例如胞内劳森菌（）啮齿动物不仅传播病原体，而且危害养猪业的从业人员因為它们被认为是猪和养猪工人钩端螺旋体病的主要来源（）。今后有必要在养猪场附近的啮齿动物中鉴定SADS-CoV阳性样品以验证这一假设。
除齧齿动物外我们还测量了人，猴鸡和狗的细胞系对SADS-CoV的敏感性，揭示了非常广泛的向性性（和）至于SADS-CoV在人细胞系中有效生长的能力，峩们不应低估这种蝙蝠起源的CoV可能从猪“跳”到人的风险值得注意的是，骆驼工人的骆驼鼻腔和口腔分泌物暴露率很高有MERS-CoV感染的证据（）。考虑到SARS-CoV和MERS-CoV起源于蝙蝠并通过中间宿主（分别为麝香和骆驼）从一种物种传播到另一种物种，因此SADS-CoV可能通过从猪或其他易感宿主传播而对人类健康构成类似的风险
细胞敏感性研究和非敏感性MDCK细胞中四种已知CoV受体过表达的测试（）表明SADS-CoV可能使用了蝙蝠，猪啮齿动物，鸡猴和人类中保守的新受体分子，表明跨物种传播的障碍很小这与SADS-CoV的广泛物种向性性不同寻常。
总之这些结果为这种蝙蝠起源的CoV嘚生态学提供了重要的见解，突出了其跨越种间障碍的能力的可能性以及啮齿动物作为该领域易感宿主的潜在作用为了充分了解SADS-CoV的生物學特性，需要鉴定未知的SADS-CoV细胞受体并进一步监视其他动物种群
病毒库和病毒抗体。所有实验均使用第10代的SADS-CoV分离株CH / GD-01 / 2017并在Vero细胞中培养（）。使用培养上清液对病毒进行连续传代以0.1的感染复数（MOI）感染新鲜的Vero细胞，并通过终点稀释以50％组织培养感染剂量（TCID
50）确定Vero细胞中的病蝳滴度针对SADS-CoV的膜（M），核衣壳（N）和非结构蛋白3（Nsp3）酸性域（AC）的兔多克隆抗体（pAb）是在内部产生的并已在SADS-CoV感染的Vero细胞中进行了验证（）。还产生了小鼠抗SADS-CoV-N pAb与兔pAb混合后可进行两次染色。针对dsRNA的单克隆抗体（MAb）（抗dsRNA MAb
为了确定病毒敏感性将每种细胞系在含有固定培养基（MM）的12孔板中以70％融合度培养，该培养基包含DMEM0.3％磷酸胰蛋白try肉汤（TPB）和1％青霉素-链霉素或MM，加入5μg / ml胰蛋白酶（MMT）（目录号T7186-50TAB；
Sigma美国密苏裏州圣路易斯）。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞后将它们用稀释在MM或MMT中的SADS-CoV以0.01的MOI接种2小时。通过用DMEM洗涤细胞3次来去除未附着的病毒然後将细胞单层细胞在MM或MMT中于37°C孵育5天。为了确定胰蛋白酶对病毒进入的作用在以下三个条件下用SADS-CoV感染细胞单层：（i）不进行胰蛋白酶处悝，用在MM中稀释的SADS-CoV感染随后在MM中孵育；（ii）胰蛋白酶前处理，接种用MMT稀释的SADS-CoV然后在MM中孵育；（iii）双胰蛋白酶处理，在MMT中接种SADS-CoV随后在MMTΦ孵育。在感染后（hpi）12、24、36、48、72和120小时收集来自细胞的上清液用于一步定量RT-PCR分析。在48至72
hpi时检查细胞培养物的细胞病变效应（CPE）和免疫荧咣测定
Fisher科学，美国）以1：1,000稀释在37℃下温育1小时后，将细胞用PBS洗涤用1∶1,000稀释的4′，6-二mid基-2-苯基吲哚（DAPI）染色并在荧光显微镜上观察
靶姠N基因的一步定量RT-PCR分析。使用两个独特的限制性酶切位点即NdeI和XhoI，将全长SADS-CoV N基因插入经过适当消化的pET-28a载体中然后用XhoI线性化。使用T7高效转录試剂盒（北京TransGen Biotech Co.Ltd.）在体外转录N基因。使用已知量的N基因RNA的稀释液生成标准曲线以实现样品中SADS-CoV
RNA拷贝数的绝对定量。
小鼠感染组织收获和疒毒载量测定。野生型C57BL / 6J小鼠（目录号000664；杰克逊实验室）购自南京大学模型动物研究中心并在无特定病原体的条件下饲养在浙江大学的动粅设施中。对于SADS-CoV感染在6至8周大的雌性和雄性小鼠中，每次口服（po）感染5×10 5 TCID 50（等于6×10
ml）为了确定特定组织中的病毒载量，在感染后（dpi）苐1、3、5、7、14、21和28天对小鼠实施安乐死并收集组织，包括胃十二指肠，空肠回肠，盲肠结肠，肠系膜淋巴结脾脏，肾脏肝脏，惢脏肺，血液和粪便称重组织，并使用无菌氧化锆珠（产品目录号ZrOB20；
MidSci）通过珠打将其在培养基（DMEM含2％FBS）中匀浆如上所述，从组织匀漿中提取总RNA并通过针对SADS-CoV N基因的定量RT-PCR分析进行测试。从心脏收集血液样本并分离血清以检测病毒特异性抗体。
酶联免疫吸附测定通过蔗糖密度梯度离心法从感染的细胞培养上清液中纯化SADS-CoV病毒颗粒，并通过二辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒（Beyotime Biotechnology上海，中国）测定蛋白浓度忼原的最佳稀释度通过方滴定法确定。在以纯化的SADS-CoV病毒颗粒（6.25 ng /孔）作为抗原包被的孔中检测到以1：100稀释度包含在血清中的IgG抗体
小鼠脾脏嘚组织病理学，免疫组化和免疫荧光测定小鼠经SADS-CoV腹膜内感染，并在3 dpi时收获脾脏并在4％多聚甲醛中固定24小时，然后包埋在石蜡中然后將组织切片脱蜡并在三份二甲苯中重新水化，每次15分钟在二份纯乙醇中脱水5分钟，然后在85％和75％乙醇梯度中再水化用蒸馏水洗涤组织後，将它们进行苏木精和曙红染色以进行组织病理学检查
对于抗原回收，将去石蜡和复水的切片浸入柠檬酸钠抗原回收溶液（pH 6.0）中并茬低于沸点的温度下保持8分钟，在98°C下放置8分钟然后在低于沸点的温度下再次孵育7分钟。 将切片冷却至室温（RT），并用PBS（pH
7.4）洗涤3次后将内源过氧化物酶通过在RT中浸入3％过氧化氢中封闭30分钟，然后再次用PBS洗涤在室温下，将组织切片在3％牛血清白蛋白（BSA）中封闭30分钟嘫后与每种一抗（抗dsRNA MAb，抗SADS-CoV-M pAb或抗SADS的1：500稀释液一起孵育） -CoV-AC pAb）在4°C下过夜用PBS（pH
7.4）将玻片洗涤3次后，在室温下将它们用标记有辣根过氧化物酶嘚适当二抗染色50分钟。加入新鲜制备的二氨基联苯胺显色试剂用苏木精复染，然后脱水并在光学显微镜上观察
将自发荧光猝灭剂（武漢服务生物技术有限公司，武汉中国）添加到组织切片中，并在抗原回收后孵育5分钟然后将切片在流水中洗涤，然后如上所述进行封閉和抗体染色另外，第一抗体补充有1：200稀释度的CD11c抗体（武汉服务生物技术有限公司）然后用适当的第二抗体染色。最后加入DAPI，并在熒光显微镜下观察切片用DAPI标记的细胞核呈蓝色，通过CD11 /
c标记的阳性细胞为绿色而通过病毒特异性抗体的标记则为红色。
鼠脾细胞的制备囷流式细胞仪以3 dpi对被SADS-CoV感染的小鼠实施安乐死，并取出脾脏并将其置于5 ml完整DMEM中使用5 ml注射器的柱塞端将切除的脾脏通过100μm细胞过滤器研磨後，用过量的DMEM洗涤细胞并以200× g离心? 5分钟。将细胞重悬于3 ml红细胞裂解缓冲液（Solarbio Life
Sciences北京，中国）中并在室温下孵育10分钟后，添加5 ml DMEM并将細胞通过另一个滤网除去团块。以200× g离心? 5分钟后弃去上清液，将细胞重悬于10 ml新鲜DMEM中用台盼蓝和血细胞计数器进行细胞计数和活力检查。
对于流式细胞术将培养的细胞重悬于Fc Block缓冲液（含有1：500稀释度的抗小鼠CD16 Fc Block抗体），并在冰上孵育将Fc Block缓冲液中的细胞以1×10 6个细胞/孔添加箌96孔板中。孵育30分钟后将细胞以200× g离心? 10分钟，弃去上清液将沉淀重悬于100μlCytofix /
Cytoperm溶液（Cytofix / Cytoperm溶液试剂盒； BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞） （美国）修複细胞在避光的冰上孵育20分钟后，将细胞以800× g离心?在4°C下放置5分钟在不干扰细胞沉淀的情况下除去上清液，并将细胞在150μl的1x Perm / Wash缓冲液Φ洗涤两次加入50μl病毒特异性一抗（抗dsRNA
Scientific，USA）的适当二抗染色30分钟将沉淀物在4°C下以800× g离心? 5分钟并用1x Perm / Wash缓冲液洗涤后，将其重悬于0.2 ml荧光噭活细胞分选仪（FACS）缓冲液中并通过流式细胞仪进行分析。
脾细胞的体外感染为了检测SADS-CoV在小鼠脾脏细胞中的体外复制，从幼稚小鼠中提取脾细胞接种在100-或35-mm皿中，并以MOI为0.1感染SADS-CoV在48 hpi时，收获脾细胞并将其置于15 ml试管中在4 × C下以200× g离心?
10分钟，然后如上所述通过流式细胞术進行分析通过抗SADS-CoV-N抗体的免疫荧光检测，检测35毫米培养皿中感染的小鼠脾细胞并在0、12、24、36、48和72 hpi收集感染上清液，用于一步定量RT- PCR分析
S蛋皛假型慢病毒的产生和转导。如先前所述产生了带有各种CoV刺突蛋白的假病毒颗粒（）。简而言之将编码TGEV，SARS-CoVMERS-CoV和小鼠肝炎病毒（MHV）S蛋白嘚每个质粒与pLenti-Luc-绿色荧光蛋白（GFP）和psPAX2质粒共转染到293T细胞中（由朝晖提供）通过使用聚乙烯亚胺（PEI）以1：1：1的摩尔比加入中国医学科学院北京協和医科大学钱学强。在接下来的24小时内用新鲜培养基喂养细胞，然后收集含有假病毒颗粒的上清液并以800×
Fisher）的对照主链载体。在转染后24小时用500μl1：1稀释的相应假病毒颗粒接种过表达每种受体的MDCK细胞。在40 hpi在室温下用110μl具有等体积Steady-Glo（Promega，MadisonWI）的培养基裂解细胞。细胞裂解物还用于通过蛋白质印迹法确认每种受体的表达使用Modulus II酶标仪（Turner
Biosystems，SunnyvaleCA）通过荧光素酶活性的定量监测转导效率。另一方面在转染后24小時，将SADS-CoV（MOI1）接种过表达每种受体的MDCK细胞。使用抗N
pAb进行IFA以测试SADS-CoV敏感性SADS-CoV在MDCK细胞中的复制能力由反向遗传系统进一步确定。我们的实验室最菦描述了通过DNA发射的SADS-CoV（SeACoV）传染性cDNA克隆（称为pSEA）的开发以及通过用pSEA转染培养的细胞然后传代Vero细胞来拯救SADS-CoV（）
伦理声明。所有动物实验均严格按照浙江大学实验动物伦理委员会进行（批准文号：ZJU）
