【论文】脱氢酶活性检测方法及应用_百度文库
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脱氢酶活性检测方法及应用介​绍​了​分​别​用,,-​氯​化​三​苯​基​四​氮​唑​(​T​T​C​)​以​及​碘​硝​基​四​唑​紫​(​I​N​T​)​等​作​为​人​工​受​氢​体​进​行​脱​氢​酶​活​性​(​D​H​A​)​检​测​的​几​种​常​见​方​法​,​以​及​它​们​自​身​在​反​映​微​生​物​活​性​等​方​面​的​优​缺​点​。​论​述​了​T​T​C​在​D​H​A​检​测​中​的​发​展​,​重​点​讨​论​了​T​T​C​作​为​受​氢​体​进​行​D​H​A​测​定​过​程​中​其​标​准​曲​线​制​作​方​法​的​改​进​,​并​对​测​定​中​诸​多​影​响​因​素​如​温​度​、​p​H​及​萃​取​剂​等​进​行​了​比​较​分​析​,​确​定​了​最​佳​实​验​条​件​。​简​要​概​括​了​目
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酪氨酸酶检测方法
　　酪氨酸酶是黑素合成的关键酶，可能是白癜风自身免疫的重要抗原。最近发现部分白癜风患者血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切相关。提示自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据。酪氨酸酶抗体可以作为白癜风活动性的一个指标。
　　酪氨酸酶(TYR)是一种75kD含铜酶，来源于胚胎峭细胞，是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶。Spritz等人证实TYR是一种铜结合蛋白，有铜A和铜B位点。离子铜特异性能与人TYR结合，一个位点的铜结合可以促进另一个位点的铜结合。组氨酸在铜B位点协调其结合。TYR的多肽链的适当折叠对铜结合及其催化活性是关键性的，TYR突变可中断铜结合使其催化活性丧失。眼、皮肤白化病是由于TYR基因突变所致，该病TYR阳性患者色素性皮肤损害发生率高。超氧化物负离子(O2-)能穿透黑素细胞(MC)入胞内，TYR通过利用O2-保护MC，免受O2-细胞毒作用。在黑素瘤患者黑素瘤细胞(MMC)和MC中抗氧化系统失衡，内源性反应性氧生成，细胞内不能抵御内源性超氧化物的攻击。白癜风患者血清中TYR抗体的生成，提示白癜风的发病与自身免疫有关。
　　酪氨酸酶是黑素合成的关键酶，可能是白癜风自身免疫的重要抗原。最近发现部分白癜风患者血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切相关。提示自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据。酪氨酸酶抗体可以作为白癜风活动性的一个指标。酪氨酸酶(TYR)是一种75kD含铜酶，来源于胚胎峭细胞，是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶。
　　北京美迪中医皮肤病医院酪氨酸酶检测方法：TYR抗体在白癜风患者血清中检出。Song等[11]1994年用细菌合成人TYR，免疫印迹法检测TYR抗体。
　　北京美迪中医皮肤病医院的这种方法相对不敏感且不能定量检测。Baharav等[12]1996年使用蘑菇TYR，ELISA法检测TYR抗体，此法敏感，但所用蘑菇TYR与人TYR同源性低。而Xie等[13]1996年则用人MC提取物作为TYR的来源，免疫沉淀法等检测TYR抗体。 Kemp等[14]1997年采用放免法(RIA)检测TYR抗体。近来此法已被用来检测自身免疫性患者血清中的特异性抗体[15-17]。这种方法能敏感定量检测抗体。
　　本文编辑：李晴
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求膨化大豆尿酶活性检测方法及注意事项
& && & 最近遇到比较奇怪的事情，同时检测膨化的蛋白溶解度和尿酶活性（定量），同时用定性法做尿酶活性，三者结果不相符合。PS高的膨化大豆用定性法测尿酶活性反而比较低。而二者用定量法测尿酶活性，结果都接近零。可能的原因我自已猜测为：1、粉碎机不能用，粉碎时发热，但是我没有另外的粉碎机，不知可以用什么方法避免。2、脂肪含量高了，未脱脂引起结果不准确。3、用做蛋白溶解度方法做膨化大豆的溶解度，可能方法不正确。具体的原因是什么，求指导！！！！！
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我也遇到过这样的情况，脲酶活性0.02，蛋白溶解度在90%，请教了很多人，最后的结论是膨化大豆脲酶活性越低越好，一般不考虑其蛋白溶解度
sdhuang 发表于
我也遇到过这样的情况，脲酶活性0.02，蛋白溶解度在90%，请教了很多人，最后的结论是膨化大豆脲酶活性越低越 ...
尿酶活性你是用什么方法做的啊，为什么我做出来的值都那么低？
脲酶活性的检测，定性法是统计型检测，允许个别不合格，整体合格就好；定量法是每个个别合格，整体自然合格，这样的检测方法是榨油厂检测豆粕的方法，大体一样，脲酶活性检测是判断膨化大豆中抗营养因子是否灭火的依据（主要是胰蛋白酶抑制因子与脲酶的含量及受热失活的特性极为相似），而蛋白质溶解度是判断膨化大豆受热过度的依据。用定量法测的要准点。这个是正常的。
蛋白质溶解度与脲酶活性忆起检测，相互判断，结果是最好的。
还是统计法比较简单方便
我们用的是定量法，一般膨化大豆的脲酶都要求很低，你们的这个值属于正常范围，你们检测的蛋白质溶解度是多少？
幸运ZHI星 发表于
我们用的是定量法，一般膨化大豆的脲酶都要求很低，你们的这个值属于正常范围，你们检测的蛋白质溶解度是多 ...
我们咨询过这方面的专家，膨化大豆的脲酶越低越好，据你这种情况我们来看是合格的，但是我们在溶解度方面没有研究。我查过资料说脲酶活性主要用于评价大豆制品是否过生，在反映大豆及制品的加工是否受热过度方面用蛋白质溶解度评价更为适宜。具体还是看你们针对哪方面的指标。
yangsel 发表于
蛋白质溶解度与脲酶活性忆起检测，相互判断，结果是最好的。
你用的是哪一种方法检测脲酶活性？是定量抑或是定性？以及外观鉴别也要参考。
、京公网安备32号、北京爱牧人网络科技有限公司 & 版权所有基于核酸适配体的凝血酶检测新方法研究--《山西大学》2012年硕士论文
基于核酸适配体的凝血酶检测新方法研究
【摘要】：第一章：简要介绍了蛋白质检测的意义和常用方法,以及核酸适配体的定义和特点；综述了基于适配体的蛋白质检测方法和纳米材料在其中的应用；阐述了本论文的立题背景、主要研究内容及创新点。
第二章：采用荧光基团标记的适配体作为探针,金纳米颗粒作为荧光猝灭剂,建立了一种检测凝血酶的荧光分析法。将荧光染料分子标记的含29个碱基的可识别凝血酶的DNA适配体非特异吸附到纳米金表面,荧光发生猝灭,加入凝血酶后,凝血酶与适配体特异性结合,使适配体空间构象发生改变,荧光染料分子远离纳米金表面,荧光恢复,从而可以实现对凝血酶的检测。实验结果表明,这种检测方法简便、快速、特异性强,检出限为0.54nM(对应样品体积为200μL)。
第三章：利用适配体的亲和作用,磁珠的预富集功能以及量子点的荧光特性,发展了一种基于适配体检测凝血酶的三明治夹心式分析方法。采用两种可与凝血酶分子不同作用位点结合的适配体(15-mer Apt15;29-mer Apt29),将其中一种适配体修饰于磁珠表面作为捕获适配体,另一种适配体修饰于量子点表面作为信号报告适配体,凝血酶存在时可以形成三明治夹心复合物,通过检测三明治复合物中量子点的荧光信号可实现对凝血酶的检测。实验考察了捕获适配体和信号报告适配体的选择及适配体修饰的磁珠或量子点的加入顺序对方法检测性能的影响。在优化的实验条件下,实现了对凝血酶的灵敏检测。血红蛋白、溶菌酶和转铁蛋白均不干扰两种方法对凝血酶的检测,表明方法具有很好的选择性。
第四章：基于适配体的亲和性捕获和随后的酶促反应,发展了一种简单的凝血酶比色分析法。凝血酶被适配体修饰的磁珠捕获后,催化生色底物(T3068,序列为β-Ala-Gly-Arg-p-nitroanilide)转化为吸收光度法可检测的产物。使用吸收光度计测定生成的产物可以最终定量检测凝血酶。利用样品富集和酶催化放大,实现了对凝血酶的高灵敏检测,而适配体的选择性结合和酶的特异性反应使方法具有高特异性。当酶促反应时间为24h,分析250μL凝血酶样品时,方法检出限为2pM。
第五章：本章采用与第四章类似的检测原理,使用凝血酶的另一种生色底物(T1637,序列为N-P-tosyl-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide)进一步提高了方法的灵敏度。凝血酶被适配体修饰的磁珠捕获后,催化生色底物T1637转化为光度法可检测的产物。由于底物T1637的转换数是底物T倍,因此相同条件下T1637参与酶反应具有更高的反应速率。当酶促反应时间为24h,分析250μL凝血酶样品时,方法检出限为40fM,与采用底物T3068得到的结果相比,降低了近50倍。该方法可以用于稀释人血清样品中凝血酶的检测。
【关键词】：
【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R446.1【目录】：
中文摘要12-14ABSTRACT14-16第一章 绪论16-36 1.1 蛋白质检测的意义和方法16 1.2 基于适配体的蛋白质检测方法研究进展16-26
1.2.1 核酸适配体简介16-18
1.2.2 基于适配体的蛋白质检测方法18-23
1.2.3 适配体结合纳米材料检测蛋白质23-26 1.3 立题背景及主要研究内容26-28 1.4 创新点28-29 参考文献29-36第二章 采用纳米金和荧光标记的适配体检测凝血酶36-44 2.1 引言36-37 2.2 实验部分37-38
2.2.1 仪器与试剂37
2.2.2 纳米金的合成及表征37
2.2.3 凝血酶的检测37-38 2.3 结果与讨论38-41
2.3.1 金纳米颗粒浓度对荧光猝灭的影响38
2.3.2 反应时间对荧光猝灭的影响38
2.3.3 温度对荧光恢复的影响38-39
2.3.4 缓冲溶液的选择39
2.3.5 方法的特异性39-40
2.3.6 凝血酶的检测40-41 2.4 结论41 参考文献41-44第三章 基于适配体修饰的磁珠和量子点荧光法检测凝血酶44-58 3.1 引言44-45 3.2 实验部分45-47
3.2.1 仪器和试剂45-46
3.2.2 适配体修饰的磁珠的制备46
3.2.3 适配体修饰的量子点的制备46
3.2.4 凝血酶的检测46-47
3.2.5 特异性实验47
3.2.6 回收率实验47 3.3 结果与讨论47-55
3.3.1 量子点的检测47-48
3.3.2 采用Apt29-QD和Apt15-MB检测凝血酶48-52
3.3.2.1 适配体和量子点结合比率的影响48-49
3.3.2.2 Apt29-QD和Apt15-MB加入顺序的影响49-50
3.3.2.3 方法的检测性能50-52
3.3.3 采用Apt15-QD和Apt29-MB检测凝血酶52-53
3.3.4 方法的特异性53-54
3.3.5 回收率考察54-55 3.4 结论55 参考文献55-58第四章 基于适配体捕获和生色底物(T3068)催化水解的凝血酶分析法58-80 4.1 引言58-59 4.2 实验部分59-61
4.2.1 仪器和试剂59-60
4.2.2 适配体修饰的磁珠的制备60
4.2.3 凝血酶的检测60
4.2.4 特异性实验60-61
4.2.5 复杂样品中凝血酶的检测61 4.3 结果与讨论61-77
4.3.1 凝血酶催化反应条件的优化61-64
4.3.1.1 pH和温度对催化反应的影响61-62
4.3.1.2 底物浓度的影响62-63
4.3.1.3 催化反应时间的影响63-64
4.3.2 Apt15-bead作为捕获试剂对凝血酶进行检测64-74
4.3.2.1 捕获条件的优化64-66
4.3.2.2 酶反应终止的考察66-67
4.3.2.3 Apt15对凝血酶催化活性的影响67-68
4.3.2.4 适配体修饰的磁珠捕获凝血酶对凝血酶催化活性的影响68-69
4.3.2.5 凝血酶的检测69-71
4.3.2.6 方法的特异性71-72
4.3.2.7 复杂样品中凝血酶的检测72-74
4.3.3 Apt29-bead作为捕获试剂对凝血酶进行检测74-77
4.3.3.1 温度对捕获的影响74
4.3.3.2 Apt29对凝血酶催化活性的影响74-75
4.3.3.3 凝血酶的检测75-76
4.3.3.4 方法的特异性76-77
4.3.3.5 复杂样品中凝血酶的检测77 4.4 结论77 参考文献77-80第五章 基于适配体捕获和生色底物(T1637)催化水解的凝血酶分析法80-102 5.1 引言80 5.2 实验部分80-82
5.2.1 仪器和试剂80-81
5.2.2 适配体修饰的磁珠的制备81
5.2.3 凝血酶的检测81
5.2.4 特异性实验81-82
5.2.5 复杂样品中凝血酶的检测82 5.3 结果与讨论82-100
5.3.1 凝血酶催化反应条件的优化82-87
5.3.1.1 溶液pH对酶促反应的影响82-83
5.3.1.2 钠离子浓度对酶促反应的影响83
5.3.1.3 钙离子浓度对酶促反应的影响83-84
5.3.1.4 底物浓度的影响84-86
5.3.1.5 催化反应时间的影响86-87
5.3.2 Apt15-bead作为捕获试剂对凝血酶进行检测87-97
5.3.2.1 捕获条件的优化87-90
5.3.2.2 凝血酶的检测90-94
5.3.2.3 方法的特异性94-95
5.3.2.4 复杂样品中凝血酶的检测95-97
5.3.3 Apt29-bead作为捕获试剂对凝血酶进行检测97-100
5.3.3.1 Apt29对凝血酶催化活性的影响97-98
5.3.3.2 凝血酶的检测98-99
5.3.3.3 方法的特异性99
5.3.3.4 复杂样品中凝血酶的检测99-100 5.4 结论100 参考文献100-102攻读学位期间取得的研究成果102-103致谢103-104个人简况及联系方式104-106
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