用水为何还能扩出条带来?我要烧香了!(引物,质粒,条带,阴性对照)
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[用水为何还能扩出条带来?我要烧香了!(引物,质粒,条带,阴性对照)] 我扩增的是质粒,我的引物都是新的,引物配的过程中是用水溶解的,水不可能受了污染,引物一个25BP,一个32BP,但用水做阴性对照时竟然还能扩出我的目的400BP左右的条带来,我的酶都换了一遍,dd水也换了,污染问题都一个一个排除了,怎么还能扩出来条带呢?我都要急疯了,急求高手解答!!! 关键词:[引物 质粒 阴性对照 条带]…
我扩增的是质粒,我的引物都是新的,引物配的过程中是用水溶解的,水不可能受了污染,引物一个25BP,一个32BP,但用水做阴性对照时竟然还能扩出我的目的400BP左右的条带来,我的酶都换了一遍,dd水也换了,污染问题都一个一个排除了,怎么还能扩出来条带呢?我都要急疯了,急求高手解答!!!
回复没什么的，把桌子什么都擦擦干净，周围用70％酒精喷一喷，ddH2O也要灭菌的，然后就是把所有的东西从头到尾换一遍，不要试图找原因，最便捷的解决方案就是换掉重新开始。系统要是出来问题，真是打破脑壳都想不出来。sigh，祝好运，不要说什么水污染是不可能的，没有绝对的^_^，good luck。回复你所说的情况我们隔壁的实验室有同学遇上过。如果一个实验室总是作相近的研究内容，这个问题是最容易发生的，尤其是作16sRNA以及同源性很高的基因。原因有两个方面：一个是由于在一个实验室很长作同一个（或序列相近的基因），出现这样的事情是不可避免的，处理的方法是换到其他的“未污染”的实验室再作。另一方面是操作者本人的平时习惯所造成的。象你说的这种情况我认为是水出了问题。解决的办法是：用别的实验室的水，并且在另外一个实验室的PCR仪上进行你的实验。回复我的引物就是用其他实验室的水溶解的,会不会是引物自身的问题?35个循环是不是太多了,老师实在不行的话就提高退火温度,这样有用么?唉,我的引物是刚到的,想不到还会出现假阳性,快崩溃了,足足浪费我快两个礼拜了!我在其他实验室也做过的,只带了我的新引物,其他都是人家的,还是有条带,见鬼了!回复
扩增结果跟反应循环数无关的。35个循环是有点大可不必，但也不应该出现你这样的结果。另外，我觉得你所看到的是PCR反应的引物二聚体？？？？嫌疑很大。你应该把你的实验照片上传一张，让大家看看，这样好帮你分析！其中应该包括Marker，阳性对照和你的那个让人头疼的假阳性条代。回复我觉的不像是引物二聚体,我的上游和下游引物加起来只有57BP,怎么可能扩增达到400多BP呢?回复说明:从上往下数,第一个是阴性对照,其余是阳性对照!回复减少循环次数这个估计是老外说的那个气溶胶污染很难完全避免的换枪再不行换人回复
我的引物就是用其他实验室的水溶解的,会不会是引物自身的问题?35个循环是不是太多了,老师实在不行的话就提高退火温度,这样有用么?唉,我的引物是刚到的,想不到还会出现假阳性,快崩溃了,足足浪费我快两个礼拜了!我在其他实验室也做过的,只带了我的新引物,其他都是人家的,还是有条带,见鬼了!如果你真的只带引物到别的实验室（确定无污染），别的其他东西（包括PCR管、酶，buffer等）都是那个实验室的话，阴性仍扩出带的话，应该是你的引物在你第一次用水溶解的时候已经被你以前所做类似实验产生的气溶胶污染了，也就是说在受污染的实验区域放置或打开的任何物品都有可能粘上产物气溶胶，包括你的身上，往后再怎么做都没用。只有重新订引物，但最重要的是消除实验室气溶胶污染。彻底消毒所有的实验设备，曾经暴露过的不能再用，耗材要高压灭菌，紫外线照射过夜，实验室通风，一周时间还不一定能完全将气溶胶清除。新的引物回来后先让别人拿去按你的方法用他的PCR作，结果正常，确保引物无污染，下一步就可以做你的实验室污染的测试了，看经过清洁处理后是否可以重新开始实验。首先把5个已灭菌的PCR空管开盖放置在你实验室的四周及中间，半个小时后闭上盖子，送到结果正常的实验室，加上PCR反应体系（不加模板），扩增，如果出来是阴性，表明实验室污染已清除，可以重新起用，如果仍为阳性，那还得继续通风，重复实验直至结果转阴为止。这个过程可能是痛苦而漫长的，Good Luck!!回复小心就是了连污染都避免不了还做什么实验回复现在又碰到一个很奇怪的事,我拿我的引物到别的实验室去 做,让别人替我做,同样条件,结果阴性和阳性对照都没有条带了,空空的.奇怪的事情真是让我....这又是什么原因呢?回复阳性对照都出不来，这说明这次PCR反应体系有问题，我想八成是少加了一种组分。然而根本的办法是：我建议你重新合成引物，不要再疑神疑鬼的了！PCR发应很灵敏，也很敏感！所以在配制溶液时要小心谨慎! 告诉大家一个笑不出来的笑话：我曾经见过一个作枯草芽孢杆菌的研究生用枯草芽孢杆菌的引物扩增出的片段测序后比对后发现与人细胞的某个基因同源性为99％，而跟枯草芽孢杆菌没有同源性。这说明了什么呢？？回复做实验关键要有耐心，可不能着急啊！我以前做pcr实验有时候要做十几遍，你就是真的急疯掉也解决不了问题。还是耐心下来寻找原因吧，像上边几位老兄给你提的的那些建议你都要实验一下，说不定就解决了！呵呵。最后建议你，pcr最容易污染，你最好把所有的环节都换掉！回复谢谢大家的建议,我会试试的,这实验真的是看不见模不着,的确能锻炼人的耐性.我现在是没啥脾气了,换掉重来试试了!我就还有一点不明白,为什么拿到人家实验室去做,人家帮我做的PCR,连阳性对照都做不出来了呢,可以保证没有一样试剂忘了加,但就是同样的条件就是扩不出来,而一拿到我的实验室用我的酶却阴性和阳性都扩的出来!!!要么什么也扩不出来,要么什么都扩的出来,把我搞晕了,按理说我实验室可能受了污染,是同样的条件啊,但人家实验室好好的怎么就扩不出来呢?回复人家不会作倍回复
我认为是污染了。你可以用紫外线照射和通风的方法排除室内的污染，暂停一段时间。另外有一个很重要的是你的消毒方法，在PCR 实验室中用乙醇消毒是绝对不可靠的。不信的话，请问你用什么洗涤你的？建议用过氧乙酸进行消毒。然后采用重新配制所有试剂，严格遵守无菌操作。你的水中的条带就会消失了。回复
我认为是污染了。你可以用紫外线照射和通风的方法排除室内的污染，暂停一段时间。另外有一个很重要的是你的消毒方法，在PCR 实验室中用乙醇消毒是绝对不可靠的。不信的话，请问你用什么洗涤你的？建议用过氧乙酸进行消毒。然后采用重新配制所有试剂，严格遵守无菌操作。你的水中的条带就会消失了。
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pcr目的条带暗，怎么办呢？？
最近一直pcr,可是目的条带总是很暗，该怎么优化条件呢？而且在胶回收后用同样的条件跑，连条带都没有，目的片段大小1500bp
反应条件：94度 4min 94度 30s&&52度30s&&72 度 90s&&72度10min&&
该怎么优化呢？？
未命名.jpg
胶回收稀释后pcr.jpg
杂带比较多，可以升高退火温度，比如做个touchdown PCR，或者梯度PCR，找到最适退火温度，再PCR！ : Originally posted by lhs521521 at
杂带比较多，可以升高退火温度，比如做个touchdown PCR，或者梯度PCR，找到最适退火温度，再PCR！ 怎么才能让条带更亮呢 : Originally posted by 1989zb at
怎么才能让条带更亮呢... 第一次做体系大一点，切目的条带，回收，以回收产物为模板再P，再结合优化PCR条件因该会好些！ : Originally posted by 无为书生 at
第一次做体系大一点，切目的条带，回收，以回收产物为模板再P，再结合优化PCR条件因该会好些！... 第二张图片就是胶回收在p&&的 结果什么都没p 出来&&不管是用胶回收原液或者稀释的都没p出来 郁闷的很
浓度不够没办法测序这才真郁闷了。 : Originally posted by 1989zb at
第二张图片就是胶回收在p&&的 结果什么都没p 出来&&不管是用胶回收原液或者稀释的都没p出来 郁闷的很
浓度不够没办法测序这才真郁闷了。... 看你第一个图的条带是可以回收到的，你回收不到可以让别人帮你做一次，做大孔胶，加大上样量，最后溶解时少加点TE或水。:hand: 非特异性条带太多并且很亮，我看了一下你的退火温度有点低，摸索PCR条件还不如重新设计引物 : Originally posted by 无为书生 at
看你第一个图的条带是可以回收到的，你回收不到可以让别人帮你做一次，做大孔胶，加大上样量，最后溶解时少加点TE或水。:hand:... 回收后电泳是有条带的&&只是在次p 就p 不出来…… PCR扩增的非特异性条带太多，要提高退火温度，提高个2~3度试试；还有你回收产物扩增的跑胶图片中，引物二聚体浓度太高，可以降低一下引物浓度试试。 : Originally posted by 1989zb at
回收后电泳是有条带的&&只是在次p 就p 不出来……... 回收后电泳不知道你上样量是多少，换句话说，回收后的浓度时多少。如果很低的话，干嘛要稀释那么多倍。我一般回收产物都不稀释的，直接p : Originally posted by zhoulubin at
回收后电泳不知道你上样量是多少，换句话说，回收后的浓度时多少。如果很低的话，干嘛要稀释那么多倍。我一般回收产物都不稀释的，直接p... 不稀释的 我也p 不出来问题是 目的条带也不是很弱，提高退火温度2-3度若还是这样那就和温度没多大关系了，你的PCR体系可能需要优化，现在那种混合好的pcr体系有的就比较好用，你可以试试。再就是胶带回收时少加些水或TE。 : Originally posted by tongyanna at
目的条带也不是很弱，提高退火温度2-3度若还是这样那就和温度没多大关系了，你的PCR体系可能需要优化，现在那种混合好的pcr体系有的就比较好用，你可以试试。再就是胶带回收时少加些水或TE。 混合好的pcr体系？？什么意思!()(忘了说电泳是点的20ul) 试试提高退火温度吧，可以减少有效的减少非特异性扩增，实在不行，重新设计引物再来吧。没办法。 第一、升高退货温度，应该可以做一个温度梯度，从而选择最适温度。可以选择55~65度
第二、减少引物量以及模板量
第三、适当加大1~2个循环数
第四、电泳检测的时候，不需要点20ul
第五、重新设计引物
祝你实验顺利 把退货温度提高到58度~~引物少加点，不是越多越好~ 我们做实验时有时候自己配制pcr体系就是自己加酶、dntp、模板、水。而有种PCR产品是公司买的那种，酶和DNTP已经配置好了，用的时候只加模板就行。很多公司有卖的 杂带比较多，并且要比目的条带亮很多，建议提高退火温度或者减少dNTP的含量，如果只是想要回收片段的话，电泳点样量加大。 : Originally posted by li315yanwei at
杂带比较多，并且要比目的条带亮很多，建议提高退火温度或者减少dNTP的含量，如果只是想要回收片段的话，电泳点样量加大。 用的mix&&谢谢 : Originally posted by
第一、升高退货温度，应该可以做一个温度梯度，从而选择最适温度。可以选择55~65度
第二、减少引物量以及模板量
第三、适当加大1~2个循环数
第四、电泳检测的时候，不需要点20ul
第五、重新设计引物
祝你实验顺 ... 谢谢
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我的PCR条带弥散,阴性对照也弥散,但是不加引物不弥散,当然也没有条带,请问都是什么原因啊?
我的PCR条带弥散,阴性对照也弥散,但是不加引物不弥散,当然也没有条带,请问都是什么原因啊?
阴性对照的作用就是来判断实验是否有污染的,如果PCR条带和阴性对照都弥散的话,原因应该是污染.污染一般有试剂的污染,也有可能是环境的污染.先说试剂的污染.你设置的阴性对照所用的每一种试剂都存在被污染的可能,最实际也最麻烦的方法就是,每次更换一种试剂,重复实验,从而确定那种试剂发生污染.你提到的不加引物不弥散,那是必然的结果,及时所有试剂都发生了污染,不加入引物,扩增也是没办法进行的,结果也不会有条带.再说环境的污染.环境的污染一般就是指气溶胶的污染,PCR实验室多少都会存在这种问题,气溶胶是比较难以消除的.先假设你所用的试剂都是正常的,你可以选择两到三对PCR产物片段较长的引物做试验（比你此次出问题的实验所选的要长）,进行正常PCR,电泳看结果是如何,如果不出现弥散现象,可初步判断为气溶胶污染.接着选两到三对产物片段较短的做实验（同上）,观察结果,如果同样出现弥散现象,此时可断定确实是气溶胶污染.以上所说,属于理想状态,首先要排除个人操作失误,另外具体的情况再具体分析!个人理解,
是跑出的条带很糊么？如果是的话，按照你说的阴性对照也弥散应该是引物的问题，也有可能是PCR试剂的问题，还有可能是退火温度的问题。逐个排除吧。
降低电压 跑慢点
引物有无污染，跑个电泳看看&& 查看话题
【求助/交流】PCR阴性对照总有微弱条带！！！
最近做的PCR的阴性对照总是出现条带，水、试剂、引物都换过了，但仍旧不能消除！急呀！到底怎么回事呀？HELP！
正常，PCR说明不了问题，如果是质粒的话最好是酶切验证 微弱条带还好，反正阳性的条带很亮就可以了，影响不大。如果出现阴性贼亮贼亮那就麻烦了。 酶和PCR Buffer 是不是也被污染了。
如果这些都没有问题的话，那可能是楼主在操作的时候，有一个习惯性动作老是改变不了所导致的。
建议你做实验时阳性对照和阴性对照离的远一点，最好阴性对照放在最上游的位置，并且最先加入，然后盖上盖子。再依次加入模板和阳性对照。 你的条带是不是引物二聚体呀？阴性对照都有引物二聚体的 Originally posted by xuexue1204 at
你的条带是不是引物二聚体呀？阴性对照都有引物二聚体的 很显然，不是引物二聚体，阴性对照产物和实验组大小一样…… Originally posted by xiaoqi708 at
酶和PCR Buffer 是不是也被污染了。
如果这些都没有问题的话，那可能是楼主在操作的时候，有一个习惯性动作老是改变不了所导致的。
建议你做实验时阳性对照和阴性对照离的远一点，最好阴性对照放在最上游的位置 ... 酶和buffer也换过了，我也是先加阴性对照的，就像你说的那样，但仍旧有带 跑胶 点样 溢过去的吧。 Originally posted by yixuanwin at
跑胶 点样 溢过去的吧。 同意他的看法，很有可能，如一样大小的话，下次少点一点样试试 Originally posted by wangchunling at
很显然，不是引物二聚体，阴性对照产物和实验组大小一样…… 也可隔几个孔再点阴性对照，再做个空白对照试试呵，多做些对照找找原因，哈哈 模板是什么，要扩什么东西 Originally posted by 世外清风 at
也可隔几个孔再点阴性对照，再做个空白对照试试呵，多做些对照找找原因，哈哈 嗯，谢谢你哈！:tiger28: Originally posted by hfkset at
模板是什么，要扩什么东西 模板是稀有鮈鲫的脾脏DNA，好像扩金属硫蛋白基因吧 Originally posted by 世外清风 at
同意他的看法，很有可能，如一样大小的话，下次少点一点样试试 嗯，收到！谢谢:tiger28: 我们实验室也遇到这个问题，可以换移液器试试，另外换个PCR仪。 电泳液许久不换也会出问题的。 Originally posted by haitian0625 at
电泳液许久不换也会出问题的。 哦，多谢赐教！ 我也出现同样问题，一直以为是实验室被转换君污染，但是处理过后偶尔还是有问题~郁闷 我今天做实验就发现溢空现象，我看楼主可能是同样的问题 可能酶被污染了，加酶的时候我为了不让移液枪碰到酶的管壁，我都拿两个枪头套在一起用
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