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细胞凋亡的检测细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式， 根据死亡细胞在形态学、 生物化学和分子 生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的 测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1、光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚 期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂 解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的 DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。 三种染料与 DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时 发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度，使用时用 PBS 稀释成终浓度为 2~5mg/ml。 DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度，使用 终浓度一般为 0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状 （rippled）或呈折缝样（creased） ，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝 聚、边缘化；Ⅱb 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图 1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内 染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图 2)；Ⅱa 期细胞核的 染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图 3)。Annexin-V 是一种分 子量为 35~36KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白， 能与 PS 高亲和力特异性结合。 Annexin-V 将 进行荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式 细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期 的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用， 就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法 1、悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用 PBS 洗 2 次，加 入 100ul Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光 30min，再加 入 PI（50ug/ml）5ul，避光反应 5min 后，加入 400ul Binding Buffer，立即用 FACScan 进行 流式细胞术定量检测（一般不超过 1h） 同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为阴性 ， 对照。 2、贴壁培养的细胞染色：先用 0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3、爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 结果 注意事项 1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。 2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。 三、线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用， 多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生 凋亡， 而线粒体跨膜电位 DYmt 的下降， 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件， 它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA 断裂）出现之前，一旦线粒体 DYmt 崩溃， 则细胞凋亡不可逆转。 线 粒 体 跨 膜 电 位 的 存 在 ， 使 一 些 亲 脂 性 阳 离 子 荧 光 染 料 如 Rhodamine 123 、 3 ， 3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6 （3） Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine ]、 iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的 增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为 Rhodamine 123（1mM）或终 浓度为 DiOC6（25nM） ，JC-1（1mM） ，TMRM（100nM） ，37°C 平衡 30min，流式细胞计 检测细胞的荧光强度。 注意事项 1、始终保持平衡染液中 pH 值的一致性，因为 pH 值的变化将影响膜电位。 2、与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度， 引起假去极化。 四、DNA 片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质 DNA 在核小体单位之间的连接处 断裂, 形成 50~300kbp 长的 DNA 大片段, 或 180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳 上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯 DNA，进行琼 脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的 DNA ladder。如果细胞量很少， 还可在分离提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使 DNA 标记， 然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中 DNA ladder 的形成。 1、大分子染色体 DNA 片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为 50~300kbp 长的 DNA 大片段。 所有超过一定分子量大小的 双链 DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。 线性 DNA 的双螺旋半径超过凝胶半径时， 即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样， 以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为&爬行&。因此，细胞凋亡早期产生 的 50~300kbp 长的 DNA 大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技 术可圆满地解决这一问题。 这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。 每当电场方向改 变后，大的 DNA 分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移 动。DNA 分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当 DNA 分子变换方向的时间小于 电脉冲周期时，DNA 就可以按其分子量大小分开。 参考文献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 、DNA Ladder 测定 方法：收获细胞（1′107）沉淀?细胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS 和 RnaseA （5mg/ml）56°C，2h?蛋白酶 K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10 体积 3M 醋酸钠和 2.5 倍体积的冷无水乙醇沉淀 DNA，4°C 过夜?14000rpm′15min?最后将沉淀溶解在 TE buffer 中，加 DNA Loading Buffer?1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色并照相。 结果： 参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 6-5507 3、凋亡细胞 DNA 含量的流式细胞计分析 方法：收集细胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C 固定过夜?PBS 洗涤，1000rpm′10min?RNase A （0.5mg/ml）37°C 消化 30min?PI（50mg/ml）染色，室温避光 15min?FACScan 分析 DNA 亚二倍体的形成及细胞周期的变化。 结果： 4、ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH) 优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。 五、TUNEL 法 细胞凋亡中, 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端，可在脱氧核 糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷 酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法 称 为 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 末 端 转 移 酶 介 导 的 缺 口 末 端 标 记 法 （ terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 。 的断裂，因而没有 3'-OH 形成，很少能够被染色。TUNEL 实际上是分子生物学与形态学相 结合的研究方法， 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色， 能准确地反应细胞凋 亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从 组织中分离的细胞的细胞形态测定， 并可检测出极少量的凋亡细胞， 因而在细胞凋亡的研究 中被广泛采用。 六、Caspase-3 活性的检测 Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用， 其中 caspase-3 为关键的执行分 子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在 于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两 个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的 晚期和死亡细胞，caspase-3 的活性明显下降。 1、 Western blot 分析 Procaspase-3 的活化， 以及活化的 Caspase-3 及对底物多聚 （ADP-核糖） 聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。 方法： 收集细胞→PBS 洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 电泳→硝酸纤维素膜 或 PVDF 膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温 1.5~2h 或 4°C 过夜→Caspase-3 多抗或单抗室温 反应 1~2h 或 4°C 过夜→TBS-T（含 0.05% Tween 20 的 TBS）洗 3 次，5~10min/次→HRP标记的羊抗鼠 IgG 或 AP 标记的羊抗鼠 IgG 室温反应 1~2h→ TBS-T 洗 3 次， 5~10min/次? →ECL 显影或 NBT/BCIP 显色。 结果： 2、荧光分光光度计分析 原理： 活化的 Caspase-3 能够特异切割 D1E2V3D4-X 底物， 水解 D4-X 肽键。 根据这一特点， 设计出荧光物质偶联的短肽 Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC 不能被激发荧光，短肽 被水解后释放出 AMC，自由的 AMC 才能被激发发射荧光。根据释放的 AMC 荧光强度的 大小，可以测定 caspase-3 的活性，从而反映 Caspase-3 被活化的程度。 方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS 洗涤?制备细胞裂解液?加 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 四肽荧光底物）?37°C 反应 1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为 430-460nm） 。 结果： 、 3、流式细胞术分析 方法： 收获细胞正常或凋亡细胞?PBS 洗涤?加 Ac-DEVD-AMC?37°C 反应 1h?UV 流式细胞 计分析 caspase-3 阳性细胞数和平均荧光强度。 七、凋亡相关蛋白 TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19 （PDCD5） 是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因， 前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的 TFAR19 单克隆抗体为探针， 对细胞凋亡过程中 TFAR19 蛋白的表达水平及定位研究发现， 凋亡早期 TFAR19 表达水平增高并出现快速核转位现象， 伴随着细胞核形态学的变化， 持续较长时间， 在凋亡小体中仍然可见。 同时我们发现， 凋亡早期 TFAR19 蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸 （PS）外翻和细胞核 DNA 的片段化，提示 TFAR19 蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的 事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期 TFAR19 的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早 期均出现 TFAR19 高表达和核转位。 这为研究细胞凋亡早期所发生的事件， 提供了一种新的 技术和指标。 （一）TFAR19 蛋白的细胞定位分析 材料试剂： FITC 标记的单克隆抗体， pH7.4 、 0.15Mol/L PBS， 3%的多聚甲醛， PBS-T （pH7.4 、 0.15Mol/L PBS 含 0.2% Tween 20） ，胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含 2%胎牛血清及 0.1%NaN3 。FACS 管，Tip 头，移液器。 仪器：低温水平离心机, 37°C 水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，流式细胞计 方法： 1、悬浮细胞的染色： （1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106） ，PBS 洗 2 次，1000rpm′10min。 （2）3%多聚甲醛冰浴 10min，PBS 洗 2 次，1000rpm′10min。 （3）加入 PBS-T 溶液，37°C 孵育 15min，PBS 洗 2 次，1000rpm′10min。 （4）加入 200ml 胎牛血清，室温反应 30min。 （5）加入 5ml FITC 标记的 TFAR19 单抗（终浓度为 1：40） ，4°C 反应 30min （6）荧光细胞洗液洗 2 次，1000rpm′10min。 结果观察： 将细胞沉淀滴片， 荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察 TFAR19 在细胞中的定 位。同时用流式细胞计定量检测 TFAR19 蛋白的平均荧光强度。[图 11] 2、贴壁细胞的原位染色 （1）贴壁生长的对数期细胞铺在 24 孔或 6 孔板中（内有洁净盖玻片） ，让其爬片生长，待 长到 50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。 （2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。 （3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦 激光扫描显微镜观察 TFAR19 在细胞中的定位。 结果观察： 3、临床病理切片的染色、检测。 4、原代细胞的培养、检测。 5、分析 TFAR19 蛋白在人体内各组织器官的分布及定位 （二）TFAR19 蛋白的表达与临床疾病 1.ELISA 法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中 TFAR19 蛋白水平及其 TFAR19 自身抗体水平。 材料和试剂：1.包被 Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L 碳酸盐 Buffer 2.洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含 0.05% Tween 20 3.封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制） 4.酶标抗体的稀释：用封闭液稀释 5.OPD 底物 Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g，柠檬酸 0.51g ，DDW 100ml 6.显色液（现配现用） ：底物 Buffer 10ml，OPD 2mg，30% H2O2 2ml 7.终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人 TFAR19, HRP 标记的羊抗人 IgG9. ELISA 板, Tip, 移液 器，ELISA Reader（OD490nm） ，洗板机 操作步骤： 1.用包被 Buffer 稀释的重组人 TFAR19（1mg/ml）包被 ELISA 板, 100ml/well, 37°C 孵育 2h 或 4°C 过夜（一般 24h 以上） 。 2.洗涤 Buffer 洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37°C 孵育 2h 或 4°C 过夜。 3.洗涤 Buffer 洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3 个重复孔）100ml/well ，37°C 孵 育 1h。设包被 Buffer、洗涤 Buffer 、封闭液为阴性对照。 4.洗涤 Buffer 洗板三次，加入 1：2500 稀释的 HRP 标记的抗人 IgG, 100ml/well，37°C 孵育 1h。 5.洗涤 Buffer 洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应 10~15min。 6.加入 H2SO4 终止反应，50 ml/well。 7.ELISA Reader 读取 OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血 清中 TFAR19 自身 抗体的表达水平。 Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的 TFAR19 蛋白的表达水平。 细胞凋亡检测技术与方法 jmtang 转 细胞凋亡（Apoptosis） ，又称细胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指细胞在一 定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度 有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到 30 年的时间， 但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色， 对个体的正常发育及细胞凋 亡紊乱在病理学研究中的重要作用， 引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究， 成为 目前生命科学界最为热门话题之一， 也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。 从 近年的 SCI 排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组 方面的， 而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。 随着这方面研究的持续升 温， 涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测， 其中不少已经有商品化的产品出现， 大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法（概括如图 1） ： 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测: PS 从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生, 可能作为免疫系统的识别标 志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的 PS，再通 过简单的显色或发光系统进行检测。 由于这是一种凋亡早期的活细胞检测 （悬浮细胞和贴壁 细胞都适用） ，可与 DNA 染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。 美国著名生物试剂公司 CLONTECH 和 INTERGEN 公司分别开发了多种标记的 Annexin V 产品， 简便快速， 分钟就可完成检测。 10 其中带荧光标记的 Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及 Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为 FACS（流式细胞分选）方法筛选 凋亡细胞的基础。由于融合蛋白 Annexin V-EGFP，EGFP 与 PS 的结合比例为 1：1，还可 进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的 Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来 检测。另外，MACS 公司将磁珠包被 Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。2）细胞内氧化还原状态改变的检测： 这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发 生 。 CLONTECH 公 司 的 ApoAlertTM Glutathione Detection Kit 通 过 荧 光 染 料 monochlorobimane(MC 体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内 氧化还原状态的变化。 正常状态下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有 毒的氧化物通过被 GSH 还原而定期去除，氧化型的 GSH 又可被 GSH 还原酶迅速还原。这 一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在 Jurcat 和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的 ATP 依赖的 GSH 转移系统。当 细胞内 GSH 的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早 期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素 C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转 移到细胞液中，启动凋亡效应器 caspase 的级联反应。 由于 GSH 与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非 常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和 3T3 细胞凋 亡时没有明显的 GSH 水平的变化，不能用此法检测。 3）细胞色素 C 的定位检测 细胞色素 C 作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于 线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合 Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动 caspase 级联反应：细胞色素 C/Apaf-1 复合物 激活 caspase-9，后者再激活 caspase-3 和其它下游 caspase。 细胞色素 C 氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内 膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用 的标志。 ApoAlertTMCell Fractionation Kit 不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高 度富集的线粒体部分， 再进一步通过 Western 杂交用细胞色素 C 抗体和 COX4 抗体标示细胞 色素 C 和 COX4 的存在位置，从而判断凋亡的发生。 4) 线粒体膜电位变化的检测： 在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发 现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱 导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的 染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集 体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细 胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。 CLONTECH 公司的 ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit 就采用这种原理来检测线粒 体膜电位的变化。 但是， 这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些 Caspase 的底物）在核小体之间剪切核 DNA，产生大 量长度在 180-200 bp 的 DNA 片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法： 1）TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling） 通过 DNA 末端转移酶将带标记的 dNTP （多为 dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到 DNA 片段的 3’-OH 端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国 Intergen 公司提供 多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、 福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少， 操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。2) LM-PCR Ladder (连接介导的 PCR 检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察 不到核 DNA 的变化。 CLONTECH 公司的 ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit 通过 LM-PCR （ligation-mediated PCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地 检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程 度的不同样品可进行比较。 上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核 DNA 断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损 伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。 3) Telemerase Detection (端粒酶检测) 这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由 RNA 和蛋白组成的核蛋白，它 可以自身 RNA 为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化” 。正常体细胞是 没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟， 表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具 有端粒酶的活性。Intergen 公司的 TRAP-eze Telemerase Detection Kit 在 1996 年率先推出。 它提供特定的寡核苷酸底物， 分别与底物及端粒重复序列配对的引物。 如果待测样本中含有 端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的 6 碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过 PCR 反应， 产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的 DNA Ladder 现象 （参见图 4） 此外， 。 Intergen 公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒. 同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。 3、mRNA 水平的检测 研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因， 检测这些特异基因的表达水平也成为检 测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和 bcl-X (长的) 作为抗凋亡（bcl-2 和 bcl-X）的 调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。一般多采用 Northern 杂交和 RT-PCR 走胶对它们进行检测。随着近年来荧光定量 PCR 技术的发展，用定量 PCR 技术来 检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。Intergen 公司的 Amplifluor? Apoptosis Gene Systems 就根据这一新技术原理， 通过检测 fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA 表 达水平来进行细胞凋亡的检测。 以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法， 随着凋亡机制研究的深入， 近年来还发展了 许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等，Cell Signeling technology 公 司，DAKO 公司，Santa-Cruz 公司，Calbiochem & Oncogene 公司都紧跟科研潮流，开发了 大量的抗体及活性测定产品。 一种深入凋亡机制的高度特异性的检测 ——活性 Caspase 的检测 jmtang 转自“基因快讯 Gene News”2001 年第 1 期随着凋亡机制研究的逐渐深入， 对细胞凋亡的检测不再停留在细胞经凋亡诱导后发生的一些 普遍现象上。 既然细胞凋亡是一个主动的， 高度有序的， 多种基因调控， 多种酶参与的过程， 那么细胞凋亡是怎么触发的？凋亡信号是怎样在细胞中传递的？有哪些基因产物参与了凋 亡的调控， 哪些酶参与了凋亡程序的启动和执行？近年来的研究取得了很大的进展， 研究者 们发现了很多与细胞凋亡相关的信号传导途径（参见下图） ， 对其中一些关键组分，激酶、磷酸酯酶、转录因子等都有了进一步的了解。同时，发现许多 细胞都可通过膜受体与特异性配体，如一些细胞因子，生长因子，肿瘤坏死因子(TNF)等作 用， 将存活或凋亡信号从胞外传递到胞内， 再通过特定的信号传导途径调控细胞凋亡的进程， 如通过 NF-κ B、AKT，PKC 等途径抑制凋亡的发生（参见图 2） 。 而在凋亡程序的启动及执行过程中，有一大类蛋白酶家族：Caspases，有人称它们为凋亡的 效应器，起了非常重要的作用。它们直接参与了凋亡早期启动，凋亡信号的传递以及凋亡晚 期作用于不同凋亡底物（主要是一些 DNA 酶和一些细胞骨架蛋白） ，产生细胞皱缩，膜出 泡， DNA 断裂等等凋亡特征现象。 其中研究得较多是胞外配体 FasL、 TNF、 APO-3L、 APO-2L 诱导的途径（参见中心插页 2 彩图） 。细胞膜上有一类被称为死亡受体的膜受体， Fas、 TNFR1、DR3、4、5 等，它们受到特定的胞外配体诱导后发生低聚合作用，这样它们膜内 侧部分就能与特异性接头蛋白（FADD、RAIDD、Apaf1 等）结合，再通过特异性接头蛋白 激活特定的 Caspase，引起 Caspase 的级联反应，将凋亡信号传至不同的凋亡底物，诱发凋 亡特征。那么，为什么 Caspase 能够担负凋亡过程中如此重要的角色？与它的工作相适应， 它具有什么样的特征？从已发现的一大类 Caspase 家族中，可以归纳出它们的共同特征。 Caspase(Cystein-containing, aspartat-specific proteases)的本质是一些半胱氨酸蛋白酶，其剪切 位点是在特异的天冬氨酸（Asp）残基。它们是 ICE（Interleukin-1 beta-Converting Enzyme） 相关蛋白酶家族的成员。在正常的状态下，它们以无活性的原酶（proenzymes）形式存在， 凋亡信号刺激其特异性 Asp 残基处被剪切后激活，同时释放 N-端结构域（Pro-domain） 。所 有的 Caspase 都被剪切在特异的 Asp 残基，一些上游的 Caspase 就能次序地激活其它下游的 Caspase，形成 Caspase 级联反应，将凋亡信号一级级传至凋亡底物。早期研究细胞凋亡机 制的生物模型：线虫，其死亡基因产物 CED-3 就是一种 Caspase，而在脊椎动物中则已衍生 出一大类 Caspase 家族。表 1 是目前已发现的一些 Caspase 的特性，从这张表上可以看到， Zymogen(kDa) preference Apoptotic initiators Caspase-2 (51) Caspase-8 (55) (L/V/D)EXDd Caspase-9 (45) 17/10 20/12 18/11 RAIDD DXXDb,c FADD Active subunits (kDa) Activation adapter TetrapeptideAPAF-1(I/V/L)EHDCaspase-10 (51) Apoptotic executioners Caspase-3 (32) Caspase-6 (34) Caspase-7(35) Cytokine Processors Caspase-1 (45) (W/Y/F)EHD Caspase-4 (43) Caspase-5 (48) mCaspase-11 f (42) mCaspase-12 (50) Caspase-13 (43) mCaspase-14 (30) 20/10 Invertebrate caspases17/12FADDUnknown17/12 18/11 20/12NAe NA NADEXD (V/T/I)EXD DEXD20/10?CARDIAK20/10 20/10 20/10 20/10 20/10 NAUnknown Unknown Unknown Unknown Unknown(W/L/F)EHD (W/L/F)EHD Unknown Unknown Unknown Unknown17/14CED-4DEXDCED-3 (56) 22/13 NA Unknown Caspase 按照它在凋亡途径中所处位置可分为上游起始性的 Caspase（Apoptotic inhibitors） 和下游执行的 Caspase(Apoptotic executioners)，此外还有一些与细胞因子信号传递有关的 Caspase。Caspase 都由活性亚基和非活性亚基组成，但要在被特异性剪切后才暴露出活性亚 基，才具有蛋白酶活性，每种 Caspase 活性亚基的大小在不同的生物及不同途径中还有所不 同。Caspase 的激活需要一些特异性接头蛋白。它们与底物作用部分有其偏爱的四肽序列。 正由于 Caspase 在细胞凋亡机制中的重要作用及它们具有的上述特性， 针对它们来进行凋亡 检测以及凋亡调控机制的研究日益广泛，检测的技术和方法也不断地更新。目前 Caspase 的 检测主要有两类方法：抗体法，人工底物及抑制剂法。确立了 Caspase 在凋亡过程中起关键作用之后，很容易想到用抗体方法对其进行直接检测， 但同信号传导途径中许多其他组分的抗体检测一样， 这涉及到活性问题。 并不是能检测到有 这个组分就行了，如果它没有活性，检测结果对研究信号传导就没有意义，因为非活性的形 式在没有信号刺激，没有发生信号传导时也存在。生物体这样运作也很容易理解，因为信号 传导是个非常灵敏的过程，有许多反应是非常迅速的，如对疼痛刺激的反应，如果传导途径 中的组分都要现合成就不能达到快速反应的目的。于是生物体采用先合成前体（precursor） ， 用时再激活的策略，比如进行磷酸化，去磷酸化修饰等等，而 Caspase 采取的是剪切掉非活 性亚基的激活方式。这样的策略给我们的检测带来了不便，比如磷酸化修饰，活性与非活性 形式在分子量上就相差一个或几个磷酸分子， 一般的抗体根本无法区分， 也就无法揭示信号 传导发生与否。Cell Signaling Technology 公司 (原 New England Biolabs 公司信号传导组)几 年前率先推出的特异性磷酸化抗体（phospho- *** antibody） ，特异性识别信号传导途径中磷 酸化的活性形式的组分， 为真正揭示磷酸化修饰激活的一大类信号传导组分的活性检测提供 了解决办法。对于 Caspase 的检测，也存在相似的问题：一般的 Caspase 抗体针对全长的 Caspase 中的某些抗原表位，与全长 Caspase 和 Caspase 某个亚基（活性或非活性）都起反 应， 无法鉴别 Caspase 是否被激活， 因而也无法揭示凋亡是否真的发生。 尤其对于免疫组化， 原位检测等研究， 不能从分子量上作出辅助性判断， 就根本不能区分剪切后的活性形式和未 剪切的非活性全长形式。自然，这样的检测结果对于判断凋亡是否进行没有意义。好在， Cell Signaling Technology（CST）公司又推出了一系列特色 Caspase 抗体：活性 Caspase 抗 体 （Cleaved Caspase-* antibody） 只识别被剪切后活性 Caspase 亚基， ， 不识别全长的 Caspase 和非活性亚基，彻底解决了活性检测的问题，无论做 Western blot，ELISA，免疫细胞化学， 免疫组织化学（有的还可做石蜡切片）都能真正揭示凋亡机制。同时，CST 公司也提供用 作检测对照的普通的 Caspase 抗体。 除抗体法外，还有一大类的检测方法，人工底物和抑制剂法，在没有活性抗体之前，这种方 法是检测 Caspase 活性的主要方法。它主要根据 Caspase 与底物作用的偏爱序列设计。研究 报道， Caspase 底物与其结合部位有一些特定的氨基酸， 其中，Asp 残基羧基侧链又被 Caspase 特定的四肽序列包围，并且这四肽序列已足够识别底物。底物与 Caspase 结合的特异性肽序 列加上一些检测标记 （荧光物或发色团） 和其他辅助基团即成为人工底物和抑制剂的基本结 构。人工底物和抑制剂检测方法操作比较简便，若采用荧光标记，检测也很灵敏，但一般只 用于细胞的 Caspase 活性检测，不能做组织样本。目前世界上最大的信号传导产品公司： Calbiochem&oncogene 公司提供大量的这方面的检测试剂：各种标记的人工底物、抑制剂及 活性测试试剂盒。CLONTECH 公司和 Intergen 公司也有不同标记的此类产品。 在本文的最后，笔者还想指出，正如活性 Caspase 检测在凋亡检测中具有特殊意义一样，活 性检测还适用于很多领域的研究， 因为它可以区分同种组分的活性和非活性形式， 进行功能 性检测，不仅在细胞凋亡，信号传导研究中具有重要意义，作为功能研究的一个有力工具， 在基因组之后的蛋白组及功能基因组的研究中必将发挥更大的作用。 细胞凋亡的几种检测方法 shihong4699 一、形态学观察方法 1、HE 染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞 表面有“出芽”现象。2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡 细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。 如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的 完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核 膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细 胞吞噬现象。 二、DNA 凝胶电泳 （一） 、检测原理 细胞发生凋亡或坏死，其细胞 DNA 均发生断裂，细胞内小分子量 DNA 片断增加，高分子 DNA 减少， 胞质内出现 DNA 片断。 但凋亡细胞 DNA 断裂点均有规律的发生在核小体之间， 出现 180－200bpDNA 片断，而坏死细胞的 DNA 断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征 可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 （二）结果判断 正常活细胞 DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞 DNA 电泳类似血抹片时的连 续性条带。 三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的 DNA 断裂使细胞质内出现核小体。 核小体由组蛋白及其伴随的 DNA 片断组成， 可由 ELISA 法检测。 （一）检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗 DNA 抗体使之与核小体上的 DNA 结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 （二）用途该法敏感性高，可检测 5*100/ml 个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不 需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。 四、流式细胞仪定量分析 （一）检测原理 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利 用这一特点， 被检测细胞悬液用荧光素染色， 利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度 来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 （二）应用价值 流式细胞仪检测具有以下特点： 1、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2、可以做许多相关性分析 3、结合被检测细胞的 DNA 含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期 检测形态学及细胞膜完整性的 Hoechs-PI 双染色法 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用 这一特点， 被检测细胞悬液用荧光素染色， 利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来 区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。 利用 Hoechs-PI 染色法， 正常细胞对染料有抗拒性， 荧光染色很浅， 凋亡细胞主要摄取 Hoecha 染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。 DNA 片断原位标记法 凋亡细胞 DNA 片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧 光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脱氧核苷 酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后 3?的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测 DNA 裂解点的技术。 DNA 片段原位标记法有二种： 1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT）技术，它是利用 DNA 多聚酶 I 将标记的核 苷酸连接到断裂 DNA 的 3?－OH 端 2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL） ，即 TUNEL 法，它是利用 TdT 将标记的 DUPT 接到 3?-OH 端。研究证明，TUNEL 法的敏感性远高于 ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL 更为合适。 检测细胞膜成分变化的 Annexin V 联合 PI 法 1、原理： 在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白 V （Annexin V） 是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白， 它于 PS 具有高度的结合力。 因此， Annexin V 可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。 故利用对 PS 有高度亲和力的 Annexin V，将 Annexin V 标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素 FITC） ，同时结合使用 PI 拒染法（因坏 死细胞 PS 亦暴露于细胞膜外测， 且对 PI 高染） 进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检 测凋亡细胞。 2、结果判断： 正常活细胞 Annexin V 、PI 均低染；凋亡细胞 Annexin V 高染、PI 低染；坏死细胞 Annexin V/PI 均高染。 3、应用价值： 细胞发生凋亡时，膜上的 PS 外露早于 DNA 断裂发生，因此 Annexin V 联合 PI 染色法检测 早期细胞凋亡较 TUNEL 法更为灵敏。又 Annexin V 联合 PI 染色不需固定细胞，可避免 PI 染色因固定造成的细胞碎片过多及 TUNEL 法因固定出现的 DNA 片段丢失。因此，Annexin V 联合 PI 法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。 细胞凋亡 yoyo781206 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972 年，英国教授 Kerr 首 先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要 进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。 细胞凋亡与组织器官的发育、 肌体正常生理活动的维持、 某些疾病的发生以及细胞恶变等过 程均有密切的关系。 形态学变化 细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段： （1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓 集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。 （2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及 核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体” 。最后，整个细胞均裂解成这种“小体” 。 （3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。 细胞凋亡的生化改变 （1）胞内 Ca2+浓度增高 所有细胞凋亡过程中均出现胞内 Ca2+浓度增高，这可能是 Ca2+内流所致。 （2）内源性核酸内切酶激活 细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA 被从核小体连接处水解，形成 180 —200bp 或其整倍数的片段。 （3）生物大分子的合成 凋亡过程的发生一般依赖于新的 RNA 和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去 除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。 常用的检测方法 1、形态学方法 借助普通光学显微镜、 荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、 切片涂片或细胞悬液进行形态 学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济， 可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。 2、电泳法 对凋亡细胞的基因组 DNA 进行琼脂凝胶电泳，由于存在 180—200bp 或其整倍数的片段， 故电泳结果可见“梯状” （ladder）DNA 条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织 细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。 3、免疫学方法 凋亡细胞内裂解的 DNA 片段含组蛋白，可用抗组蛋白抗体及抗 DNA 抗体的混合物与之反 应，再经显色及比色判断结果。该法可定性、定量，但不能定位。 4、流式细胞术 增生状态的细胞处于不同的周期时相，其 DNA 含量分布在 2N—4N 之间。凋亡的细胞由于 发生 DNA 裂解，小分子量的 DNA 片段穿过细胞而丢失，大片段 DNA 可形成一个 DNA 含 量小于 2N 的分布区，称“亚 G1 峰” 。该法可对典型的凋亡进行定性和定量，可间接判断凋 亡细胞所处的周期时相。5、末端转移标记技术 DNA 被切割后，其每个片段均含有 3-OH 末端，在末端转移酶或 DNA 多聚酶的作用下，加 入已标记的核苷酸或核苷酸混合物，再经过酶显色或用荧光抗体，可使之显示出来。该法特 异性强，可进行原位标记及定量检测。 细胞凋亡的诱导剂和抑制剂 多种因素可参与诱导和抑制细胞凋亡。常见的细胞凋亡诱导剂和抑制如下表 1。 1、Ca2+、Mg2+ 内源性 DNA 内切酶为 Ca2+/Mg2+依赖性，故胞内 Ca2+/Mg2+浓度升高可 诱导细胞凋亡。Ca2+不仅是细胞凋亡的诱导剂，在其他因素诱导凋亡的信号传导过程中， Ca2+也是重要的信号分子。Zn2+能拮抗 Ca2+/Mg2+的作用。 2、糖皮质激素 糖皮质激素是常见的凋亡诱导剂。未成熟胸腺细胞对激素诱导的凋亡敏感， 而成熟 T 细胞则不敏感。蛋白合成抑制剂（放线菌素 D、放线菌素酮）可拮抗糖皮质激素 诱导的凋亡与新蛋白质的合成有关。 3、细胞因子 TNF、TGF—β 等可促进细胞凋亡，而 IL—2 、IL—3、GM—CSF 等则抑制 凋亡。IFN—Υ 、IL—10 等对的发生有双重效应。例如 IFN—Υ 可使 IFN—Υ 受体的 T 细胞 增生，而使高表达 IFN—Υ 受体的细胞发生凋亡。' 4、抗原刺激 抗原刺激可使 B 细胞表面 IgM 发生交联，导致蛋白酪氨酸磷酸化，激活蛋白 激酶 C（PKC） ，使内质网 Ca2+释放，直至发生凋亡。 5、抗体 抗 IgM、Fas、CD3/TCR、CD4、CD8、CD23 等的抗体可诱导表达相应膜抗原的细 胞发生凋亡。 6、 胞内信号分子调节剂 某些胞内信号分子调节剂对不同靶细胞可分别具有诱导或抑制凋亡 的作用。例如，PKC 激活剂 PMA 可抑制鼠 T、B 细胞凋亡，但可诱导鼠胸腺细胞凋亡。 7、超抗原、丝裂原 超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素可诱导胸腺细胞内 CD4+、CD8+细胞凋 亡；丝裂原 PWM 可诱导成熟及未成熟 T 细胞凋亡。 细胞凋亡检测（另外一种归纳方式） yuanstar 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通 光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂 糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可 靠的方法） ，Hoechst33342/PI 双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪 检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI 单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织： 主要用形态学方法(HE 染色， 透射电镜、 石蜡包埋组织切片进行原位末端标记， ELISA 或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 培养的细胞：几乎所有方法 细胞凋亡的研究方法 Yuanstar 一、 1、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通 光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂 糖凝胶电泳。 2、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可 靠的方法） ，Hoechst33342/PI 双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪 检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI 单染色法流式细胞仪检测等。 3、样品来源不同选择 组织： 主要用形态学方法(HE 染色， 透射电镜、 石蜡包埋组织切片进行原位末端标记， ELISA 或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 培养的细胞：几乎所有方法 二、 1、早期检测:1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素 C 的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核 DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的 DNA 片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的 PCR 检测) 3) Telemerase Detection (端粒酶检测) 三、形态学观察 普通光镜下观察 用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞） ，正 常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失 Giemsa 染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染 色浅或没染上颜色 直接用倒置显微镜观察 细胞体积变小，全面皱缩；凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。 细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样， 部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb 期的细胞核裂解 为碎块，产生凋亡小体。荧光显微镜 常用的荧光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和 Hoechst33342、EB 等 Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI 三种染料与 DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 PI 双染色法基本原理： Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作 用。Hoechst 33342 在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 碘化丙啶(PI)是一种核酸染料， 它不能透过完整的细胞膜， 但在凋亡中晚期的细胞和死细胞， PI 能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚 期的细胞以及死细胞区分开来。 注意事项： 细胞凋亡时，其 DNA 可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种 DNA 可染性降低 也可能是因为 DNA 含量的降低，或者是因为 DNA 结构的改变使其与染料结合的能力发生 改变所致。在分析结果时应该注意。 四、生化检测 典型的生化特征：DNA 片段化 检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 1）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记） 通过 DNA 末端转移酶将带标记的 dNTP（多为 dUTP） 间接或直接接到 DNA 片段的 3’ -OH 端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的 组织、细胞培养物等多种样本的检测。 2）LM-PCR Ladder (连接介导的 PCR 检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察 不到核 DNA 的变化。通过 LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地 检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样 品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸 末端转移酶 （TdT） DNA 标记， 使 然后进行电泳和放射自显影， 观察凋亡细胞中 DNA ladder 的形成。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核 DNA 断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损 伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结 合其它的方法来检测细胞凋亡。 五、其它方法 Telemerase Detection (端粒酶检测) 端粒酶是由 RNA 和蛋白组成，它可以自身 RNA 为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细 胞获得“永生化” 。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短， 这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现， 90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。 mRNA 水平的检测 研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因， 检测这些特异基因的表达水平也成为检 测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和 bcl-X (长的) 作为抗凋亡（bcl-2 和 bcl-X）的 调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量 PCR 技术来检测基 因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测 fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA 表达水平来进行细胞凋亡的检测。 细胞内氧化还原状态改变的检测 正常状态下,谷光苷肽(GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。 细胞内有毒的氧化物通 过被 GSH 还原而定期去除，氧化型的 GSH 又可被 GSH 还原酶迅速还原。这一反应在线粒 体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内 GSH 的排除非 常活跃时， 细胞液就由还原环境转为氧化环境， 这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的 降低，从而使细胞色素 C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋 亡效应器 caspase 的级联反应。 细胞色素 C 的定位检测 细胞色素 C 作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于 线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合 Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动 caspase 级联反应：细胞色素 C/Apaf-1 复合物 激活 caspase-9，后者再激活 caspase-3 和其它下游 caspase。 线粒体膜电位变化的检测 （1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系 近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活， 也早于磷酯酰丝氨酸暴露 于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变， 这是由于生 成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT 孔 道)能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。 （2）线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据 若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温， 并不导致细胞核的变化。 但若将诱导 生成 PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细胞核即开始凋亡变化。 六、流式细胞术 形态学观察，看到细胞数目有限，统计学上的准确性受影响； 凝胶电泳检测 DNA 破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例； 流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化。 用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中 PI、Hoechst 最 常用。 （1）PI 和 Hoechst33342 双标： PI、Hoechst33342 均可与细胞核 DNA（或 RNA）结合。但是 PI 不能通过正常的细胞膜， Hoechst 则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可 为 PI 着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被 Hoechst 着色，但是正常细胞核的 Hoechst 着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色， 或核呈分叶， 碎片状， 边集。 PI 着色为坏死细胞； 故 亮兰色， 或核呈分叶状， 边集的 Hoechst 着色的为调亡细胞。 （2）PI 和 Annexin-V 双标： 磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS 可 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡或坏死时， Annexin-V 可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性） 。但是只有坏死的细胞 PI 是阳性