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谢谢你的热心回答，我见过有人用的是不锈钢圈中间有个膜，好像这样的筛网一个八九十呢，可以在上面研磨吗，不会把筛网损坏吧？
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秀友回答 (6)
取脾脏后转入PBS或者培养基中，注意去除脾脏周围的其他组织，不要剪破血管。脾脏研磨两种常用方法是一：直接在200目金属筛网上（国外一般用cell strainer,周围是塑料的，中间有个膜）用注射器内芯研磨 二是用两玻璃片夹着脾脏直接研磨，然后在把含有细胞的液体过筛网。 离心获得细胞，根据你的具体实验，可以洗几次，如果红细胞影响实验，可以用红细胞裂解液，NH4CL配方网上自己搜下吧。重悬细胞计数，根据需要配制相应浓度的细胞悬液。以上方法比较简单，但也有用密度梯度离心法获取淋巴细胞的，要买试剂。
回答者： 一级 一星助者
1.取脾脏转入DMEM（含抗生素）培养基中，踢出脾脏周围的组织，注意不要把脾脏剪破。
2脾脏研磨：准备一张直径2cm，200目的虑网膜。把脾脏放虑网膜上剪成3段，然后把滤网膜双层对折，用止血钳夹紧放入3.5cm dish中（2ml DMEM含抗生素），用注射器内芯研磨。把含脾细胞的悬液收集到15ml离心管，800rpm 5min 弃上清。用DMEM(含抗生素）重悬细胞，800rpm 5min 弃上清，倒入10DMEM(含抗生素）颠倒重悬细胞，计数。
回答者： 一级 一星助者
补充：可以买200目的滤网膜，用细线将膜固定在50或100ml烧杯上面，将脾放在上面用注射器内芯研磨，边研边加培养基将研碎的细胞冲洗入烧杯。
回答者： 一级 一星助者
回答者： 一级 一星助者
1、用颈椎脱臼法处死小鼠，75%的酒精浸泡2-3分钟，减少毛发所造成的污染。
2、将小鼠移入超净工作台内，无菌条件下，以仰卧位固定在解剖盘上。
3、用眼科镊子夹起腹股沟中线处皮肤，用眼科剪做一横切口。用镊子捏住切口两端的皮肤朝着小鼠的尾部和头部纵向撕开皮肤，暴露腹腔膜壁，用乙醇消毒。
4、切开腹腔壁膜，用镊子夹住脾脏，并用剪子剪去与其相连的组织。
5、将分离获得的脾脏放入装有2mL的淋巴细胞分离液中，用2ml、5ml的注射器赶出淋巴细胞，并吹打至混合均匀
6、把混合均匀的细胞液放入试管中，缓缓地加入2ml 1640培养基，2000r/min，一点要让离心机缓缓地停下来，离心30min
7、用吸管吸取中间层的灰白细胞，放入另一只试管中，加 1640 培养液（大约10ml左右，快满即可），2000r/min，离心10分钟
8、倒掉上清液，加5ml 1640培养液，用吸管吹打均匀，计数。（取50&l，加150&l的1640，总共稀释20倍）
9、继续2000r/min离心10min，弃掉上清，稀释到大约5*10-6，准备加入96孔板
回答者： 一级 一星助者
多谢各位楼主，正需要这方面的资料
回答者： 一级 一星助者
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小鼠脾细胞培养实验
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武汉新世纪中西医结合医院
医院别名：武汉新世纪中西医结合医院
医院性质：民营/综合医院
医院等级：三级甲等　　
联系电话：027-
联系地址：武汉市武昌中山桥特1号
问：如何从小鼠的脾脏中提取T 淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤,谢谢! by hefengfeng2001首页 | 杂志 | 培训 | 继教 | 会员 | 社区 | 护理 | 投稿 | 名企 | 学分 | 文献
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枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响
www.shouxi.net
何彦丽，应逸，许艳丽，苏俊芳，罗惠，王惠峰
11:45:48 《中西医结合学报》 2005年10月 第3卷 第5期
关键词：枸杞多糖
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P&0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
〔关键词〕枸杞多糖; 免疫抑制; 淋巴细胞亚群; 肿瘤浸润淋巴细胞; 树突状细胞
Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice
HE YanLi, YING Yi, XU YanLi, SU JunFang, LUO Hui, WANG HuiFeng
(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, C Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)
Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P&0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
Lycium bar T tumorinf dendritic cells
近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因〔1,2〕。已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用〔3,4〕。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。
1材料与方法
昆明种小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（18±2）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度≥35%；Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。
1.2实验动物及分组
昆明种小鼠60只，随机分成4组：正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2×106个H22肿瘤细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据文献〔5〕结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 g?kg1?d1及1.25 g?kg1?d1灌胃（均用生理盐水稀释成0.5 ml/d），连续灌胃14 d。
1.3LBP体内抑瘤率的测定 每日观察并记录小鼠生长情况及肿瘤大小，第15天小鼠眼球放血后予以脱颈处死，解剖并观察肿瘤大小及重量，计算肿瘤生长抑制率：局部肿瘤的生长抑制率=（模型组平均瘤重－LBP组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。所有动物均摘取胸腺称重，计算胸腺指数（胸腺指数＝小鼠胸腺质量/体质量）。
1.4肿瘤间质淋巴细胞的分离
肿瘤组织称重后，挑选瘤体质量≥2 g者置于含青霉素和链霉素各500 U/ml、甲硝唑5 μg/ml的RPMI1640培养液中浸泡30 min后，将瘤体剪成1 mm3大小，置于含0.05% Ⅳ型胶原酶、0.003% Ⅰ型DNase酶及10%小牛血清的RPMI1640培养液中，4 ℃磁力搅拌过夜消化，200目消毒铜网过滤洗涤后，1 500 r/min离心15 min，分离获得肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL），用DHanks液洗涤2次，台盼蓝染色检测细胞活力，调整细胞浓度至1×106/ml。
1.5TIL中CD4、CD8a、CD11c、CD80流式细胞仪分析
每个样本分3管，每管中加入3×105个细胞，PBS液调整总体积为100 μl，其中第1管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD4、CD8a单克隆抗体0.5 μl（0.25 μg）、1.0 μl（0.2 μg），第2管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD11c、CD80单克隆抗体1.0 μl（0.2 μg）、1.0 μl（0.5 μg），第3管为空白对照管，室温避光孵育30 min，PBS液洗涤2次，每次实验取2管细胞分别加入FITC和PE单荧光素标记抗体，用流式细胞仪检测。
1.6统计学方法
所有实验数据均采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，行单因素方差分析及组间比较最小显著差(least significant difference, LSD)法。
2.1LBP对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及胸腺指数的影响
模型组平均瘤体质量（2.48±0.40）g，LBP低剂量组和高剂量组分别为（1.89±0.29）g和（1.46±0.26）g，其中，LBP高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P&0.05）。LBP低剂量组和高剂量组的肿瘤生长抑制率分别为23.79%和41.12%。模型组荷瘤小鼠的胸腺质量较正常组轻，LBP组荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数则有所恢复。见表1。
LBP对H22荷瘤小鼠胸腺指数的影响（略）
Effect of LBP on thymus index in H22bearing mice
*P&0.05, vs model control group
2.2LBP对H22荷瘤小鼠TIL中T淋巴细胞亚群的影响
模型组肿瘤间质浸润CD4+、CD8+ T淋巴细胞的百分比分别为（12.89±1.05）%和（7.72±0.48）%。LBP组CD4+和CD8+细胞的百分比较模型组均有明显升高，其中LBP低剂量组CD8+与模型组比较差异有统计学意义（P&0.05），LBP高剂量组CD4+、CD8+与模型组比较差异均有统计学意义（P&0.05）。见表2。
2.3LBP对H22荷瘤小鼠TIL中DCs的影响
模型组TIL中CD11c+百分比为（23.07±2.36）%，CD80+为（15.15±1.47）%，双阳性细胞仅为（11.65±1.73）%；LBP组CD11c+、CD80+及双阳性细胞的百分比较模型组均略有升高，与CD4+、CD8+细胞百分比的升高变化有一定的平行关系，但模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组这三者之间的比较差异无统计学意义。见表2。
LBP对H22荷瘤小鼠TIL中T淋巴细胞亚群及DCs的影响（略）
Effect of LBP on Tlymphocyte subsets and phenotypes of dendritic cells in TIL
*P&0.05, vs model control group
已有研究证实：LBP具有广泛的免疫调节作用，可以增强机体的抗肿瘤效应〔3,4〕。本实验发现：LBP能明显抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长，与文献报道一致，LBP高剂量组肿瘤生长抑制率为41.12%，与模型组比较差异有统计学意义（P&0.05）；LBP还可提高荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数，对胸腺具有一定的保护作用。
机体的抗肿瘤免疫主要依靠T淋巴细胞介导的细胞免疫。成熟的T淋巴细胞分为CD4+和CD8+ T淋巴细胞两个亚群。一般认为：CD4+ T淋巴细胞产生大量的细胞因子，CD8+ T淋巴细胞在CD4+ T淋巴细胞的辅助及细胞因子的作用下可以杀伤肿瘤细胞，初次的抗肿瘤免疫反应主要依赖CD8+ T淋巴细胞和自然杀伤细胞的参与。肿瘤特异性的CD4+ T淋巴细胞对肿瘤细胞也具有直接的杀伤作用〔6〕。缺乏CD4+和CD8+ T淋巴细胞，以及CD4+/CD8+比值的降低是导致抗肿瘤免疫效应低下的原因之一。一些研究还发现：LBP是一种有效的免疫增强剂，对免疫系统具有正向的调节作用。刘彦平等〔7〕用BALB/c小鼠做体内研究发现：LBP能增加小鼠脾脏总的T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞（helper T cell, Th）及抑制性T淋巴细胞（suppressor T cell, Ts）的数量，使Th和Ts亚群的比例恢复正常。有研究报道：食管癌组织中的TIL经白细胞介素2、白细胞介素4联合中药黄芪、干地黄水提取物行体外诱导后，CD3+、CD4+细胞比例及CD4+/CD8+的比值均明显上升〔8〕。本实验通过流式细胞术检测发现：模型组TIL中的T淋巴细胞数量明显减少，表明肿瘤微环境中T淋巴细胞的抗肿瘤免疫活力低下，而LBP组的CD4+、CD8+ T淋巴细胞则恢复明显，CD4+在LBP高剂量组，CD8+在LBP低、高剂量组与模型组之间的比较差异均有统计学意义，说明LBP可促进TIL中CD4+、CD8+ T淋巴细胞的增殖与活化，直接杀伤肿瘤细胞，或通过其分泌的细胞因子辅助杀伤肿瘤细胞，一定程度地解除荷瘤机体的免疫抑制状态，从而产生抗肿瘤的效应。
DCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫应答中起着不可替代的作用，多数证据表明，荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，而是由于DCs的功能缺陷导致这些抗原不能被有效地提呈给T淋巴细胞，从而不能诱导细胞毒性T淋巴细胞产生有效而特异性的免疫应答。有多种原因可导致荷瘤机体DCs表型的改变，是引起抗肿瘤免疫功能减弱的直接原因。Chaux等〔9〕研究发现：癌旁组织浸润的炎性细胞中主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原分子高表达，而其B71（CD80）和B72（CD86）等共刺激分子则无表达或低表达；丘少鹏等〔10〕对前列腺癌肿瘤微环境中DCs细胞与T淋巴细胞之间免疫关系的研究发现：肿瘤间质中DCs占（20.89±6.06）%，明显低于癌旁组织中的（43.11±6.13）%，且与T淋巴细胞的分布显著相关，故认为癌组织中DCs数量的减少可能与前列腺癌肿瘤微环境T淋巴细胞抗肿瘤的免疫功能低下有关。LBP在体内外可促进多种细胞因子的分泌〔11〕，如白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子等，这些因子均能刺激DCs增殖及表型成熟〔12〕。CD11c强烈表达于DCs，通常采用B71、B72分子及主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原分子等单克隆抗体检测DCs细胞表型及成熟程度〔13,14〕。本实验发现：模型组肿瘤间质中浸润的单个核细胞CD11c+的百分比为（23.07±2.36）%、CD80+为（15.15±1.47）%，而双阳性细胞只占（11.65±1.73）%，说明成熟、有功能的DCs细胞数量较低；LBP低、高剂量组CD11c+、CD80+及双阳性细胞的百分比均有所上升，与T淋巴细胞亚群的变化有一定的平行关系，但各组间的比较无统计学意义。本实验还发现：LBP可以增加肿瘤间质中CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量，LBP是否可通过使DCs前体细胞增殖并诱导分化为成熟的DCs而使其具有正常的抗原提呈能力，进而激活T淋巴细胞，从而发挥抗肿瘤的作用？上述问题值得进一步研究。
因流式细胞仪的检测有一定的细胞数量要求，细胞数低于105以下时数据的准确性下降，而肿瘤间质中淋巴细胞的分离操作步骤繁琐，又有多次的洗涤过程，因此可能造成较多细胞的损伤与丢失，当肿瘤组织块太小时，更容易导致检测失败，所以只将肿瘤重量≥2 g者纳入检测范围，但这样就造成肿瘤体积明显减少的一部分LBP组的样本未纳入检测范围，从而可能导致结果的偏差。而LBP的抗肿瘤作用是否与其增加DCs的数量及促进其成熟有关，尚待进一步的研究。
〔参考文献〕
1黄羽, 梅玉屏, 曾星. 肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群及天然杀伤细胞活性的检测――附121例报告〔J〕. 新医学, ): 337338.
2何彦丽, 苏俊芳. 中药多糖抗肿瘤免疫药理研究的新思路――对树突状细胞的影响〔J〕. 中国中西医结合杂志, ): 7376.
3王玲, 杜守英. 枸杞多糖的免疫调节研究进展〔J〕. 上海免疫学杂志, ): 118120.
4甘璐, 张声华. 枸杞多糖的抗肿瘤活性和对免疫功能的影响〔J〕. 营养学报, ): 200202.
5黎雪如, 戴寿芝, 王慕娣. 枸杞对免疫功能影响的探讨〔J〕. 中华微生物学和免疫学杂志, ): 395.
6黄辉, 俞红, 林云璐. CD4+ T细胞的抗瘤作用〔J〕. 国外医学?免疫学分册, ): 5153.
7刘彦平, 毛辉青, 李萍, 等. 枸杞多糖对小鼠T淋巴细胞亚群和淋巴细胞转化作用的研究〔J〕. 青海医学院学报, ): 48.
8任德莲, 严鹏科, 钟德生, 等. 食管癌肿瘤浸润淋巴细胞体外增殖和表型变化的研究〔J〕. 泸洲医学院学报, ): 375378.
9Chaux P, Moutet M, Faivre J, et al. Inflammatory cells infiltrating human colorectal carcinoma express HLA class 2 but not B71 and B72 costimulatory molecules of the Tcell activation〔J〕. Lab Invest, ): 975982.
10丘少鹏, 陈辉熔, 邓春华, 等. 前列腺癌肿瘤微环境树突状细胞与T细胞免疫的关系〔J〕. 中山医科大学学报, ): 127131.
11吴肖叶, 徐亚利. 枸杞在肿瘤治疗中的作用概述〔J〕. 实用中医药杂志, ): 4346.
12Chen B, Shi Y, Smith JD, et al. The role of tumor necrosis factor alpha in modulating the quantity of peripheral bloodderived, cytokinedriven human dendritic cells and its role in enhancing the quality of dendritic cell function in presenting soluble antigens to CD4+ T cells in vitro〔J〕. Blood, ): .
13王正昕, 曹雪涛, 张明徽, 等. 人肿瘤浸润性树突状细胞的表型分析及原因探讨〔J〕. 中国免疫学杂志. ): 509511.
14程晓明, 王长征, 李淑平, 等. 小鼠脾脏树突状细胞的分离培养及鉴定〔J〕. 第三军医大学学报, ): .
〔本文编辑〕黄文华
〔基金项目〕广东省中医药管理局资助项目（No. 101054）
（广州中医药大学病理学教研室，广东 广州 510405; 广州市第一人民医院血液科，广东 广州 510180）
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