SOE-PCR做融合蛋白pcr引物浓度设计怎么着...

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2011-09-16 04:32 标签： pcr引物浓度
做SOE PCR 无论如何都连接不上,我做的就是普通的连接两段基因序列,检查过引物了,有重叠区域,但是就是连不上,我的两段序列都是1000多bp,每次PCR出来的都是1000多,我测序检查了一下,就是其中一段,也就是说另一段根_百度作业帮
做SOE PCR 无论如何都连接不上,我做的就是普通的连接两段基因序列,检查过引物了,有重叠区域,但是就是连不上,我的两段序列都是1000多bp,每次PCR出来的都是1000多,我测序检查了一下,就是其中一段,也就是说另一段根本就看不见条带,也连不上,
重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计.可以有三种方法来设计引物,具体如下图所示.引物F及R为基因两端特异引物,其中Fm及Rm为中间引物.其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配,否则后续实验很难成功）,突变点可以设计在Fm或Rm,也可以两条引物上都有突变点.突变点最好是位于引物的5’端,尽量避免出现在3’端.2.&分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR.注意该步一定要用pfu酶,不要用Taq酶,因为Taq酶容易在PCR产物末端加A,从而可能会使产物移码突变.3.&分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收,准确回收两条目的条带）.4.&将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物,加入dNTP及Pfu或Taq酶进行PCR.进行PCR约5-10轮即可.5.&取第4步PCR产物做为模板,加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因.建议可以优化退火温度,可以做个梯度PCR.如果认为设计引物方面没有问题,那么再考虑其它条件.
寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链自身互补性以及专一性如何在DNA测序和PCR中最好用5 末端稳定(如GC含量较多)，而3 末端不太稳定(如在引物设计时，引用genebank登录号的问题(引物,蛋白,菌株,全基因组测序)
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[在引物设计时，引用genebank登录号的问题(引物,蛋白,菌株,全基因组测序)] 采用根据已知序列分析保守区设计引物PCR的方法克隆一个酶的基因。分析保守区时使用了3个基因序列，其中有2个来源于全基因组测序的菌株。全基因组测序的菌株所有的DNA序列都是一个genebank登录号，而这个酶的蛋白序列有一个单独的genebank登录号，编码这个蛋白的DNA区会用数字区域表示出来。 我在写这几个已知的酶的genebank登录号时，该用DNA的还是蛋白的呢？理论上将应该是DNA的合理， 关键词:[蛋白 引物 全基因组测序 菌株 序列 序列分析 设计引物]…
采用根据已知序列分析保守区设计引物PCR的方法克隆一个酶的基因。分析保守区时使用了3个基因序列，其中有2个来源于全基因组测序的菌株。全基因组测序的菌株所有的序列都是一个genebank登录号，而这个酶的蛋白序列有一个单独的genebank登录号，编码这个蛋白的区会用数字区域表示出来。 我在写这几个已知的酶的genebank登录号时，该用DNA的还是蛋白的呢？理论上将应该是DNA的合理，但是DNA的是全基因组的数据，我见过文献中有用蛋白的，这样是否可以接受？诚心请教大虾，不吝赐教。谢谢。
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新人做qRT-PCR 引物怎么设计？
之前找同学教我在pubmed里面搜索 各种mRNA的编号以及正向引物和反向引物。我要做几种CYP代谢酶，分别是CYP1A2，CYP2B6，CYP3A4。 我同学告诉我搜索引物的时候要注意看不同种属，我想搜大鼠的CYP2B6但是搜到想要的结果。这里我有个问题：CYP代谢酶的引物需要区分种属吗？在此之前我一直认为人类和大鼠的CYP引物是通用的，做qPCR时不需要更换引物，我想问问各位前辈，关于引物的设计到底要不要区分种属？？&&还有，对于我这种新人来说，不会搜索合适的引物，能否直接用文献里面提供的序列来合成？？
下载不同种属的CYP基因序列比较一下，看相似性高不高，序列保不保守。
如果引物区完全一致，那么不同种属的引物就一直。如果引物区高度保守，那么可以设计简并引物，这样不同种属也可以用相同引物。
另外，文献里面的引物通常可以用，不然文章就涉嫌造假了。
最后，可以用引物设计软件来设计适合的引物，在线平台和本地软件都有很多。。。 在NCBI上找保守序列，然后用Primer5.0设计，里面会有评分，一般在80以上就可以 : Originally posted by zhouking8758 at
下载不同种属的CYP基因序列比较一下，看相似性高不高，序列保不保守。
如果引物区完全一致，那么不同种属的引物就一直。如果引物区高度保守，那么可以设计简并引物，这样不同种属也可以用相同引物。
另外，文献里 ... 恩& &谢谢你的建议~& &我会再去学习这方面的只是的 : Originally posted by
在NCBI上找保守序列，然后用Primer5.0设计，里面会有评分，一般在80以上就可以 谢谢~~ 你做这几个东西没有参考文献吗？ 他们用的序列就完全可以用
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