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【求助】SDS-PAGE没有条带（急，在线等）
楼层直达：
这个帖子发布于4年零270天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
各位老师好，我的实验是从人的组织中提取DNA，PCR扩增，然后跑变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，DNA提取用的是试剂盒，提出DNA跑2%的琼脂糖电泳，有条带。接着行PCR，扩增完毕后再次2%琼脂糖电泳，检验扩增效果，两次电泳均有条带，然后handIII37℃酶切一个半小时左右，可是跑变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳时什么都跑不出来，聚丙烯酰胺凝胶电泳为6%下层较，5%上层胶，没有加入尿素变性，染色为EB后染色，目的条带大约200bp左右，跑了三四次都是这个结果，实在找不到原因，请各位老师给指导一下。
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marker 呢？You don't use the SDS (which functions to give proteins a negative charge so they all migrate in the same direction) but you can use polyacrylamide gels of various types to separate DNA.
The polyacrylamide gel is denser than agarose so you can only separate smaller sized fragments (up to a few hundreds of base pairs).
But the resolution of PAGE for DNA (or RNA) is such that you can see one base differences in length.
Because of this fine scale resolution, denaturing PAGE is used for DNA sequencing, analyzing protein binding to DNA recognition sites, and more.另一个：
各位高手，本人现在想跑个60bp和100bp的DNA电泳，但是琼脂糖电泳无法分辨，想跑一个SDS-PAGE看看，但不知道具体怎么样操作，怎么样配胶，怎么样染色，谢谢！各位多多指导。
你好，核酸的PAGE与蛋白相似，仅是把蛋白PAGE的缓冲液换成核酸缓冲液，注重配胶时的浓度，仅一层胶就行。染色时把胶放置染色皿中，加1X缓冲液，滴加EB振荡染色10-20分，放置在紫外检测以上检测即可。很简单的，你可以试试，祝你成功。
跑核酸的PAGE，不用加SDS的。用TBE的电泳缓冲液，15×17cm的12％的PAGE胶足够分离，电泳到二甲苯完全迁出，溴酚蓝距底边2～3cm停止，1ug/mlEB 染胶2～5min，紫外线看就ok了，试剂配方参见分子克隆或是Takara目录后的附录。其实，3％的琼脂糖应该可以分开的，我就分开130bp和100bp的片断。
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marker用的宝生物的20bp DNA ladder marker，正常情况下应该有13条带，但我只能看到2条亮带，咨询宝生物回答这种marker只能用于非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，如果marker能看到是不是意味着胶和染色没有问题？
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还有那位老师知道该买哪种marker用于SDS-PAGE，我查了好久都没有。
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【求助】sds-page 问题多了，急啊~~
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【求助】sds-page 问题多了，急啊~~
我做了一个月的westen了，遇到一系列的问题，有一系列的疑问，请高人指点！
1.电泳速度奇快。我用六一的电泳槽，型号dycz-24D，开始配的10%分离胶，5%浓缩胶（均按照分子克隆配置),60v浓缩，25分钟到分界，80v分离，50分钟到底。
2.溴芬蓝不能压成线。我得上样量每孔只有7ul。总蛋白量约10ug。上样缓冲液是根据分子克隆配的，只是按比例缩成了5*buffer，没有dtt，就按摩尔数家的b-巯基乙醇。
3.marker条带模糊。我用的碧云天的预染marker，每次点样6ul。几本上只是一条蓝色的条。没有带。后来观察，跑到中间的时候似乎是有带的，但跑到下面以后就没什么带了。
4. 发现上电泳槽的缓冲液跑到快结束时全变浑了，好像有盐一样的东西析出来。（缓冲液是今天才配的）
我做的努力：
1.重新调整了1.0和1.5mol/l tris.hcl的ph值。在浓缩胶里似乎压缩好了一点，但是一进分离胶就散了。
2.重新配了电泳缓冲液，没有用盐酸调ph值，我量了大概ph8.03。（原来的buffer是调了的。）
3.降低电泳电压，同时加大了分离胶的浓度（12%）。我用浓缩胶40v，分离胶60v，电泳时间分别是50分钟和1.5小时。没有很大改观。marker还是分不出带的。（这个marker我是新买的，分装了，应该不会那么快降解吧）
4.考马斯亮蓝染色，我的蛋白条带好像还跑得可以，但是marker就是跑不好。
另外，甘氨酸会不会过期阿。实验室里我只找出来一瓶89年的，一瓶90年的，我就那么用了，暴汗~~
暑假里实验好痛苦啊~~我已经啃了半个月泡面了。我得猫也跟着受苦。各位高人给点指点，快点做好它，就能回家了
7月28日 我做的努力
甘氨酸我重新买了，电泳液用的我同学的，肯定没有问题。
tris.hcl我重新配了，ph值我重新校正了。
上样缓冲液也应该问题不大，因为我请同学帮我在他的胶上点样了，还好。
我现在怀疑是我得胶出了问题，我今天分别用我得30%acr/bic和同学的tris，同学30%acr/bic和我得tris配了两块胶一起电泳，溴酚蓝还是散的，跑得速度倒是慢了一点，但是还是很快。难道是sds有问题？还是我得ｔｒｉｓ和30%acr/bic都有问题？我该怎么办呢？？
　另外我想问一下，ｓｄｓ有析出是不是代表ｓｄｓ不好了？我用同学的好像就没有这个问题啊
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1 我用的也是六一的.前一段时间电泳时间大约5小时,后来不知道为什么缩短到2小时了.
2 我的预染marker刚开始时还不错,但是跑一会后就越发弥散. 汗啊
3 上样缓冲液最好加DTT.你加5被buffer的目的如果不是为了提高蛋白浓度的话,最好使用2被buffer
我也在实验室坚持western,食堂关门了.整天面条.
兄弟们好辛苦啊
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呵呵，看来我们的食堂比较人性话
建议上样缓冲配成2X的，临用前家DTT。
另外可以检查下配胶时用的两种TRISCL的PH。这个好像非常关键
可以观察一下电泳时的电流大小
国产的电泳仪用起来非常麻烦
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电流一般都是在20-30ma左右，tris.hcl ph我仔细的调了，甚至担心我得ph计有问题，还换了一个调的。应该是对的了。
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估计电极缓冲液有问题,我也有类似经历,换了新配的电极缓冲液,效果就好了.
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电极缓冲液的PH不用调。tris；甘氨酸；SDS三者按比例配好就行了，用时稀释到1×即可。
我觉得是配胶时tris-HCl的PH不对。浓缩胶用PH=6.8的；分离胶用PH=8.8的。
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我的loading buffer是2*的，自配的。在配置时，我适当加了溴酚兰和甘油的量，感觉还不错。
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我的方子，你核对一下
2×loading buffer&&终浓度&&实用&&5ml加
SDS&&4%&&固体&&200mg
水&&3.85ml (PH 6.8 Tris-HCl加后利于溶解SDS，SDS+ DTT增加150ul体积）
Tris-HCl, PH 6.8&&120mM&&1M&&0.6ml
DTT&&0.2M&&固体&&155.4mg
甘油&&20%&&100%原液&&1ml
溴芬蓝&&枪头沾取痕量溴芬蓝加入以达到电泳指示剂的效果即可。
注&&500ul 分装-20℃保存&1年，融化后4℃保存&2周~2月
5×loading buffer&&终浓度&&实用&&2ml加
Tris-HCl, PH 6.8&&300mM&&1M&&0.6ml
SDS- - - - - - - - - - -10%&&固体&&200mg
水- - - - - - - - - - -0.85ml (PH 6.8 Tris-HCl加后利于溶解SDS，SDS+ DTT增加150ul体积）
DTT- - - - - - - - - - -0.5M&&固体&&155.4mg
甘油- - - - - - - - - 50%&&100%原液& &1ml
溴芬蓝- - - - - - - -枪头沾取痕量溴芬蓝加入以达到电泳指示剂的效果即可。
注&&500ul 分装-20℃保存&1年，融化后4℃保存&2周~2月
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你的甘氨酸使用时间太久了，建议你换一瓶试试
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以下是我试验中蛋白电泳各种试剂的配方，效果一直很好啊！
SDS-PAGE凝胶溶液和电泳缓冲液
1．30％丙烯酰胺储存液（100 mL )：29g 丙烯酰胺，1g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水定容至100 mL，过滤避光保存。
2．1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8（100mL）：18.2 g Tris溶于40 mL 蒸馏水中加入盐酸调pH值到8.8加蒸馏水定容至100 mL。
3．1 mol/L Tris-HCl pH6.8：12.1 g Tris 溶于 40 mL 蒸馏水中，加入盐酸至pH6.8，加蒸馏水定容至100 mL。
4．Tris－甘氨酸蛋白电泳缓冲液（5×，1L）：15.1g Tris碱，94g甘氨酸，50mL 10％SDS(w/v)，加800mL蒸馏水，待全溶后定容到1L。
5．2×SDS上样缓冲液 20mL
1 mol/L Tris·Cl(pH6.8) 2 mL
10％SDS 8 mL
β-巯基乙醇 2 mL
溴酚蓝 0.04g
蒸馏水 4mL
6．考马斯亮蓝染色液 500mL
1.3 g 考马斯亮蓝 R-250
225mL 甲醇
225mL 蒸馏水
50 mL 冰醋酸
7．脱色液 1 L
100 mL 甲醇
100 mL 冰醋酸
800 mL 蒸馏水传じ☆ve说的喜欢 | LOFTER（乐乎） - 记录生活，发现同好
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