关于目的基因不同向连接到T载体上的问题 - 实验交流 - 生物秀
标题: 关于目的基因不同向连接到T载体上的问题
摘要: [关于目的基因不同向连接到T载体上的问题] 我有一段目的基因连接到pGEM-T Easy vector上，希望筛选出不同向插入的克隆，但目前总是只能选到一个插入方向的。不知各路高手有没有也碰到过类似问题的，是否目的基因的GC含量会导致连接时候的方向存在偏好性？求解答~ 关键词:[载体 克隆 基因 阅读框 概率 半乳糖苷酶 目的基因]……
我有一段目的基因连接到pGEM-T Easy vector上，希望筛选出不同向插入的克隆，但目前总是只能选到一个插入方向的。不知各路高手有没有也碰到过类似问题的，是否目的基因的GC含量会导致连接时候的方向存在偏好性？求解答~回复没有遇到过。虽然两个方向插入的比例往往不是1:1的，一般是有一个方向会多一些。你筛了多少克隆？回复这个和你挑的有关系吧？T载与目的基因链接没有方向性的 我做的基因GC含量也比较高 但是没有出现楼主的问题回复53个还没有另一个方向的，可能是你这次运气不好，再重新连一下做转化吧。回复会不会PCR产物就决定了，只有一个方向，taq酶导致只有3·端为A碱基，而T载体上也只有一端为T。“TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3端自动添加一个3-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。”所以，是不是就说TA克隆方法得到的，只能是一个方向的？回复楼主你这概率已经到1.1e-16了, 我认为不是运气的问题.
是不是你要的那个方向的正好和质粒产生融合蛋白也能形成篮斑?回复试一试用pJET1.2这个blunt-end 的载体，一般两个方向都可以回复
楼主你这概率已经到1.1e-16了, 我认为不是运气的问题.
是不是你要的那个方向的正好和质粒产生融合蛋白也能形成篮斑? 哇你好厉害，请问怎么算出这个概率的，教一下~然后T载体mcs两端是sp6和T7的启动子，我转化用的是dh5a，不含有这两种启动子对应的RNA聚合酶回复
哇你好厉害，请问怎么算出这个概率的，教一下~然后T载体mcs两端是sp6和T7的启动子，我转化用的是dh5a，不含有这两种启动子对应的RNA聚合酶... 楼主, T载体克隆长出蓝的还是长出白的菌落和sp6/T7没有任何关系.....回复
楼主, T载体克隆长出蓝的还是长出白的菌落和sp6/T7没有任何关系........ 我知道没关系，你没明白我的意思。我插入的片段有400多，只要插入一定会发生a互补，不可能出现在蓝斑里面。因为没法转录的缘故，所以这段基因不论是哪个方向接入都不应该对菌的生长构成威胁，所以……我也不懂为什么会表现出这种偏好性回复
我知道没关系，你没明白我的意思。我插入的片段有400多，只要插入一定会发生a互补，不可能出现在蓝斑里面。因为没法转录的缘故，所以这段基因不论是哪个方向接入都不应该对菌的生长构成威胁，所以……我也不懂为什 ... 如果你的基因连进去后没有破坏β-半乳糖苷酶的阅读框, 再加上如果这个基因在β-半乳糖苷酶阅读框里没有终止子, 融合蛋白又不破坏β-半乳糖苷酶的结构. 这个菌落就是蓝色的.回复
如果你的基因连进去后没有破坏β-半乳糖苷酶的阅读框, 再加上如果这个基因在β-半乳糖苷酶阅读框里没有终止子, 融合蛋白又不破坏β-半乳糖苷酶的结构. 这个菌落就是蓝色的.... 你遇到过这种情况吗？这么成熟的载体如果存在这样的问题，还能被广泛应用吗？而且我的序列有终止密码子~回复六个阅读框里都有终止密码子? 这样的话我也想不出为什么连接的时候有方向性了.
在连T载体的时候出现这种情况是很小概率的事件, 实验的东东, 如果一百个人用只有两三个人出问题那我们会认为这是个好产品对吧?回复
六个阅读框里都有终止密码子? 这样的话我也想不出为什么连接的时候有方向性了.
在连T载体的时候出现这种情况是很小概率的事件, 实验的东东, 如果一百个人用只有两三个人出问题那我们会认为这是个好产品对吧? 你真的碰到过这种情况吗？还是有听说这种情况，那我试一试~非常感谢回复以前上实验课教的, 个人没有碰到过. 因为我用T载体时还没有出现需要考虑方向的, 所以一般都挑很少的几个白克隆就行了, 你的这种情况需要挑很多克隆才会被发现. 真心希望楼主分析一下阅读框给个反馈哈!回复楼主你好，我现在也遇到了同样的问题，请问你现在解决了吗？是什么原因导致连接方向一致的？回复我用的也是pgem-t载体，做的是差异基因，转化后，筛了500个克隆送测序，有一个反方向的，估计是意外吧，，，应该都是一个方向的，回复我现在也遇到了这样的现象，不知道是什么原因啊！！！
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摘要 : T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。
T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的到载体中的方法。
目前市场上常见的，根据连接方法可以分成两种：
方法1、以T4进行连接的方法，这种方法的载体有P公司、T公司，
可以说这两家公司将这两种方法发挥到了很高的水平，转化子比较多，阳性率
也不错，唯一的不足就是连接的时间长。因为连接时间越长效率越高，要达到较好的连接效率，一般要过夜连接。国内很多公司模仿这种方法制作T，不仅连接时间也很长，而且做不到P公司、T公司的阳性率和稳定性。
方法2、以拓扑异构酶(TOPO)进行连接的方法，最早采用这种连接方法的是I公司，并且申请了专利，这种方法的优势是快速连接，在5-15分钟就可以将目的基因到载体中，阳性率比较高，这种方法国内也有人模仿，照理说，这种载体能迅速的替代P公司、T公司，但是为什么P公司、T公司的载体销售还是主流呢?那就要说一下拓扑异构酶这种连接方法的缺点：
1、长片段的连接效率很低，大于1.5K的片段用这种方法连接效率很低;
2、转化子少，虽然阳性率高，但是转化子少;
3、稳定性比较差，拓扑异构酶对温度很敏感，运输的温度和连接的温度都会影响，用水浴锅控制连接温度因为温度误差比较大就很难连接，必须用;
这两种方法各有优缺点，有没有一种T载体能够兼备两种方法的优点，而克服两种方法的缺点呢?一直致力于生物技术原创技术开发的新近推出的PUM-T载体兼具两种方法的优点，不仅提高了连接效率和阳性率，而且连接时间仅仅需要10-15分钟，即使难以连接的长片段DNA(1.5K以上)的连接效率也远远超过TOPO克隆的方法，极大的方便了生物科研工作者的研究，节约了时间提高了效率!工欲善其事，必先利其器!磨刀不误砍柴工!我们期待更多的致力于技术原创的生物公司能够带来更多方便的产品，更多国内的生物技术公司能够逐渐占领生物技术的高地，在给我们带来方便的同时，也降低了整个行业的科研成本，让我们科研工作者有限的资金能发挥更大作用，做更多的研究，为生物技术的发展做出更多的贡献!
作者：青岚 点击：次
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3秒自动关闭窗口请给我个使用T载体的理由(载体,酶切,测序) - DNA技术 - 生物秀
标题: 请给我个使用T载体的理由(载体,酶切,测序)
摘要: [请给我个使用T载体的理由(载体,酶切,测序)] 实在想不通t载体到底有什么用，我从来都是p出来就直接酶切-连接-测序-表达，到底要t载体有什么用，多一个步骤就多一个出错的机会，请教各位同行有何高见？ 关键词:[载体 酶切 测序]……
实在想不通t载体到底有什么用，我从来都是p出来就直接酶切-连接-测序-表达，到底要t载体有什么用，多一个步骤就多一个出错的机会，请教各位同行有何高见？
回复我的理由直接的要死，省得酶切，像你说的，多一步多一个犯错的可能。钓基因或者DDRT-pcr好容易出来一个带，如果量不是很多，哪有那么多去酶切，然后在回收这么折腾的?而且酶切还存在着酶切效率的问题，更为致命的是，有的时候尤其是做未知片段PCR的时候，你怎么知道你的目的片段没有对应的酶切位点？如果运气不好片段中有对应切点，酶切过程中，目的片段不就被切碎了？即使你说你做已知基因，可以保证引物两端的切点在目的片段中不存在，但你应该不会一辈子就做一个片段吧，你怎么保证每个片段都可以用你现在的切点？如果你说你可以再根据这个片段找其他切点，那你换个片段就要换个内切酶，你费这么大力气干嘛？回复钓基因或者DDRT-pcr好容易出来一个带，如果量不是很多，哪有那么多去酶切，然后在回收这么折腾的?扩二次啊而且酶切还存在着酶切效率的问题，更为致命的是，有的时候尤其是做未知片段PCR的时候，你怎么知道你的目的片段没有对应的酶切位点？如果运气不好片段中有对应切点，酶切过程中，目的片段不就被切碎了？我也做过未知片段，但未知片段最重要的一步就是测序，而t载体中的错配具有放大作用，所以我就更不用他了即使你说你做已知基因，可以保证引物两端的切点在目的片段中不存在，但你应该不会一辈子就做一个片段吧，你怎么保证每个片段都可以用你现在的切点？如果你说你可以再根据这个片段找其他切点，那你换个片段就要换个内切酶，你费这么大力气干嘛？至于已知序列，你t载体连上之后就不往下切了吗？片段中有酶切位点的话不照样得找新酶吗？回复你担心T载体测序出错，那为什么不担心二次PCR出错呢？事实上PCR的错配率更高，所以一般都是能少扩就少扩。还有就是什么叫T载体的错配放大？还望赐教。为什么T载体就错配放大了，其他载体就不放大？T载体除了接入位点与你线性化的质粒不同，其他什么元件会造成错配？还放大？请问您用的什么载体？至于已知片段的克隆问题，你说的那属于片段的再连入其他用途载体的事情了，T载体就是用于克隆，一样的，我克隆能少酶切一步为什么不少一步呢？难道你克隆了一个片段就永远不会再把这个片段查到别的载体上去？到时候不是一样要根据别的载体选酶，那使用T载体克隆，至少比你省了克隆的这一步。T载体一般就是PCR片段克隆，测序中使用，你问T载体使用的理由，那么T载体优点就是方便，快捷（不用酶切，不用专门再扩二次，这也是你讲的最重要的原则——少一步就少一个出错机会），如果你实在喜欢酶切那也没有办法。扩二次啊我也做过未知片段，但未知片段最重要的一步就是测序，而t载体中的错配具有放大作用，所以我就更不用他了至于已知序列，你t载体连上之后就不往下切了吗？片段中有酶切位点的话不照样得找新酶吗？回复PCR 产物酶切我也做过，肯定不如做TA亚克隆好，效率也不高。回复你担心T载体测序出错，那为什么不担心二次PCR出错呢？事实上PCR的错配率更高，所以一般都是能少扩就少扩。还有就是什么叫T载体的错配放大？还望赐教。为什么T载体就错配放大了，其他载体就不放大？T载体除了接入位点与你线性化的质粒不同，其他什么元件会造成错配？还放大？你连接t载体不也是pcr产物连吗p出来的东西你也应该知道是什么原理吧，pcr出来的产物是一个带有许多错配的混合物也就是说其中1%第一位错配，1%第八位错配，2%第1123位错配，等等等等……当他们测序的时候1%的信号不会影响测序结果，而如果含有错配的那些一旦被你连入t载体那么经过克隆复制，你挑的单菌落再测序就是100%的含有错配，而此时你却看不出来同理，如果是杂合体，某一snp位点会出现50%的概率，即双峰……以后的我就不必说了吧回复谢谢解答，那你酶切连入载体怎么避免这个问题呢？使用T载体是用的PCR片段，可我们现在讨论的是，针对少量的PCR条带，使用T载体会高效一些，而你说可以二次PCR扩大条带量，可是二次PCR会引入更多的错配，“你连接t载体不也是pcr产物连吗”我想您问这个，是完全忘了我们在说什么呢吧你连接t载体不也是pcr产物连吗p出来的东西你也应该知道是什么原理吧，pcr出来的产物是一个带有许多错配的混合物也就是说其中1%第一位错配，1%第八位错配，2%第1123位错配，等等等等……当他们测序的时候1%的信号不会影响测序结果，而如果含有错配的那些一旦被你连入t载体那么经过克隆复制，你挑的单菌落再测序就是100%的含有错配，而此时你却看不出来同理，如果是杂合体，某一snp位点会出现50%的概率，即双峰……以后的我就不必说了吧回复我上边说过了，pcr产物的错配是综合的，随机的，做二次也是用pcr产物，但不是一条，所以二次的产物的错配也是随机的综合的，而t载体是由“一条”，是一条，不是一批，而二次用的是“一批”明白了吗朋友回复我构建了至少10个载体了，目的片段都是先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的，最后测序都没有问题。我师弟，构干扰载体，就是为了省事，直接切PCR产物，是快，可最后测序，发现少了一个碱基。剩下的我就不必说什么了吧。回复那请问你PCR产物酶切连入，是怎样避免这个问题的，你线性化的质粒就是“一批”了？还有您说了半天，连SNP都让您用PCR产物这儿来了，是，PCR产物是一批，可是克隆是什么概念，就是一个质粒只能转一个菌落，请问单克隆测序哪来双峰？大家都是天天测了，双峰不是说你的克隆含俩质粒，或者一质粒连了俩片段，而是说你手抖了挑到俩菌落！得，咱也别在这上面掰，您就说酶切线性化载体怎么就和T载体不一样了，它怎么就能避开你说的“错配放大”？我上边说过了，pcr产物的错配是综合的，随机的，做二次也是用pcr产物，但不是一条，所以二次的产物的错配也是随机的综合的，而t载体是由“一条”，是一条，不是一批，而二次用的是“一批”明白了吗朋友你连接t载体不也是pcr产物连吗p出来的东西你也应该知道是什么原理吧，pcr出来的产物是一个带有许多错配的混合物也就是说其中1%第一位错配，1%第八位错配，2%第1123位错配，等等等等……当他们测序的时候1%的信号不会影响测序结果，而如果含有错配的那些一旦被你连入t载体那么经过克隆复制，你挑的单菌落再测序就是100%的含有错配，而此时你却看不出来同理，如果是杂合体，某一snp位点会出现50%的概率，即双峰……以后的我就不必说了吧回复pETA-1 ———— TA克隆的快速原核表达载体
特点1.PCR产物直接克隆，无需限制内切酶酶切。2.无需考虑目的基因含有限制内切酶，是否与克隆的限制内切酶冲突。3.超快速蛋白表达，3天便可以知道结果。4.阳性克隆中，50%是目的克隆，可以以PCR定向筛选目的克隆。5.目的克隆也可以直接诱导表达，以SDS-PAGE电泳直接筛选。6.一载体多用，可以作为T-Vector和表达载体同时使用7.带His. Tag，可以通过添加终止密码子，使表达蛋白不带His. Tag8. 省时、省力、节约费用应用：l.原核细菌蛋白(bacterial protein)表达。2.可以作为T-Vector 回复构建表达载体确实不需要T载体。多挑几个克隆测序，选择没有突变的就行了，毕竟在载体上插入个片断是非常容易的事情。但T载体的用处是勿庸置疑的，它主要用在克隆方面。很久很久以前，T载体还没有发明的时候，人们克隆DNA片断就要用酶切、插入载体，繁琐的不行。后来发明了PCR技术，最初还是设计酶切位点在引物上，扩增后经过酶切，插入到酶切后的载体上。到后来发明的T载体，加上蓝白斑筛选，使得克隆工作变得轻松起来。回复那请问你PCR产物酶切连入，是怎样避免这个问题的，你线性化的质粒就是“一批”了？还有您说了半天，连SNP都让您用PCR产物这儿来了，是，PCR产物是一批，可是克隆是什么概念，就是一个质粒只能转一个菌落，请问单克隆测序哪来双峰？大家都是天天测了，双峰不是说你的克隆含俩质粒，或者一质粒连了俩片段，而是说你手抖了挑到俩菌落！得，咱也别在这上面掰，您就说酶切线性化载体怎么就和T载体不一样了，它怎么就能避开你说的“错配放大”？你的单菌落当然不会出双峰了！！！我说的双峰是pcr产物测序，睁大眼睛看看！！你懂什么叫概率吗???你明白测序的用途？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？都单菌落，双峰哪来的？？？？？？至于表达载体序列问题，听着：pcr产物测序——验证总的碱基分布概率——线性化产物测序——和上一步测序结构比对，一样则表达，不一样接着挑菌！你直接t克隆了，有错配你看到出来吗？？？？你表达的是什么东西你知道吗？？？回复我构建了至少10个载体了，目的片段都是先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的，最后测序都没有问题。我师弟，构干扰载体，就是为了省事，直接切PCR产物，是快，可最后测序，发现少了一个碱基。剩下的我就不必说什么了吧。你不适合搞科研！
.鉴定完毕.回复lz至尊无敌，鉴定完毕。我无语，我服了。听着：pcr产物测序——验证总的碱基分布概率——线性化产物测序——和上一步测序结构比对，一样则表达，不一样接着挑菌！你直接t克隆了，有错配你看到出来吗？？？？你表达的是什么东西你知道吗？？？回复关注这个帖子有段时间了，就实验技术问题讨论再热烈也不过分，就算是争得脸红也不算啥，但是千万不要转移了方向。感谢各位参与讨论！回复听着：pcr产物测序——验证总的碱基分布概率——线性化产物测序——和上一步测序结构比对，一样则表达，不一样接着挑菌！你直接t克隆了，有错配你看到出来吗？？？？你表达的是什么东西你知道吗？？？我孤陋寡闻，没有听说过回复我孤陋寡闻，没有听说过用脑子想回复真没劲，这脾气还是不要搞科研了回复关注这个帖子有段时间了，就实验技术问题讨论再热烈也不过分，就算是争得脸红也不算啥，但是千万不要转移了方向。感谢各位参与讨论！ 再次提醒！回复我孤陋寡闻，没有听说过解释一下这是在回答wlk520520这位朋友的说法，因为我发现他好像不懂什么叫做测序都没有问题我构建了至少10个载体了，目的片段都是先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的，最后测序都没有问题。我师弟，构干扰载体，就是为了省事，直接切PCR产物，是快，可最后测序，发现少了一个碱基。剩下的我就不必说什么了吧。请问wlk520520朋友，什么叫做测序都没有问题啊回复双方貌似都有其道理。似乎争论的焦点是克隆了测序还是PCR产物直接测序。这个问题在学术界也有争论。比如，在研究分子进化(Molecular Evolution)方面，有利用核糖体基因中间的ITS序列来分析遗传距离的。从目前发表的文章来看，两种策略都有，但都有各自的缺点。克隆测序，耗时、费用大，一定要测很多克隆，才能排除PCR引入的错配。PCR测序直接简单，但在多倍体或多拷贝存在SNP时候，则无法判断。楼主说的双峰来判断，也是仅仅针对只有一个SNP的情况，如果一个500bp的片断中存在10个SNP位点，那么它的序列就有2的10次方（1024）种可能。另外，测序出现错误的概率大概也有1％，直接测序是无法排除这个错误的。另外，PCR出现错配的概率非常非常的低，一般来说多测几个克隆就可以判断是否是PCR引入的错误或测序出现的错误了。回复楼主说的双峰来判断，也是仅仅针对只有一个SNP的情况，如果一个500bp的片断中存在10个SNP位点，那么它的序列就有2的10次方（1024）种可能。另外，测序出现错误的概率大概也有1％，直接测序是无法排除这个错误的。不同意楼上的观点发表一下个人观点，若500bp中存在10个snp，pcr产物也仅需要测一次，而且snp也分杂合纯合，若都是纯合，无错配下二者都仅需一次，若都是杂合，pcr产物的测序图上会出现十个双峰，t克隆则理论上最少要测两次（而且是第一次出此10个，第二次出彼10个），所以snp时，t载体就更无用武之地了……回复说一点我个人的看法，掺乎一下大家的讨论。有人PCR产物直接测序，有人是把PCR产物克隆到载体中做好克隆然后去测序。我是比较赞成后一种方法，虽然谁后一种比较麻烦了一点，但是我感觉比较稳当一点。酶切或者连接等过程中出现的错误就不说了，我觉得哪些几率一般都很小。在我以往的实验中，同一管PCR产物回收后，酶切连接做好克隆，筛选出若干个PCR阳性的克隆(菌液PCR鉴定)送去测序。大多数的结果都是正确的，但是有时候出现送测序的几个克隆中有的就是有突变，反复测序都是这样。我个人认为其原因在于PCR产物的异质性。也就是说，同一管PCR产物中有很多产物，有完全正确的(这部分可能占绝大多数)，有突变的全长，还有微量或者叫痕量的不完全产物。如果PCR产物直接测序，那么由于测序本身的原因，测序引物附近是无法准确读出来的，那么可能掩盖了实际存在的突变。如果就这样连接进去载体了，那么肯定是存在一定的错误的。不知道我说明白了没有。当然有人说，PCR产物测序一次，连接进去做好克隆再测序一次，那我觉得太耗费时间了。现在测序便宜了，但是我们测序一次大概至少需要4天时间，来来回回如果两次测序的话会耽搁很多时间。如果是SNP，我认为完全可以用PCR测序，虽然可能出现我上面说的一些突变，但是SNP要以量取胜。也就是样本量N多的时候对最后的结果分析就没有多大影响了。回复同意楼上观点。我做表达的时候，测序每次都送6-8个，其实有突变的真的很少很少。另外，那10个双峰的问题，将会让你无法判断真正的序列到底是什么。回复我猜测，由于对这方面我也不了解，双峰的出现可能就是因为克隆不纯。也就是说送样测序的模板是混合物。回复同意楼上观点。那10个双峰的问题，将会让你无法判断真正的序列到底是什么。如果pcr产物直接就t克隆了，你怎么知道有没有突变，有没有snp，你怎么知道真正的序列是什么，你测的就是真正的序列？有无snp不是靠genebank查出来的，毕竟ncbi收录的只是冰山一角，而且产物连入表达载体也是要测序的啊，测出的符合先前的测序结果就是真正的序列，与双峰对比一下就知道另一条单体的序列了回复请问各位我以前设计的引物pcr之后连到T载体上，酶切效果不好。现在打算设计新引物，能不能在之前的T载体上直接pcr，还是在原来的质粒上pcr再连T载体,再酶切呀？哪位达人有经验，还望赐教呀！小女子不胜感激！回复一般的克隆，PCR直接连就可以了。但也有的情况使用T载体可能更好，PCR产量低，模板珍贵，二次PCR突变较多等情况，可以使用T载体。毕竟T载体的连接效率相对较高。各个实验室的情况不一样，LZ不能用一流实验室的技术水平来要求所有的实验室。你使用10的九次方的感受态，是个鬼都连的上。回复bowen_li的说法是有道理的。假如一个3k的的片段，使用高保真酶25个循环好不容易或得了产物（不多）但如使用该产物进行2次PCR，可以说几乎所有的片段都存在突变。当然也可以先PCR 10个循环，再进行2次PCR，或许突变会少一点。但2次PCR的PCR条件还是要去摸索的。万一模板用完了，得不偿失。如果在第一或得了PCR产物的时候进行T连，T连成功后测序，如正确，再从质粒中进行PCR，突变的概率远远低于从低拷贝的模板（如cDNA）中进行PCR。无论从时间上还是金钱上使用T载体是合算的。当然如果lz是牛人（从口气中看来好像是的）无论多么难的片段，PCR－酶切－连接－测序一次成功（理论上是可行的）。那T载体确实没有必要。T载体一般都是卖给我们这些菜鸟的，但我们还是要感谢那些卖T载体的公司，因为菜鸟要锻炼才能变成LZ一样的牛人。回复哇，好热闹！回复其实一直不理解为什么二次PCR那么容易产生突变。酶是用的新的，一样的工作机理，错误率怎么会一下子大那么多？回复bowen_li的说法是有道理的。假如一个3k的的片段，使用高保真酶25个循环好不容易或得了产物（不多）但如使用该产物进行2次PCR，可以说几乎所有的片段都存在突变。当然也可以先PCR 10个循环，再进行2次PCR，或许突变会少一点。但2次PCR的PCR条件还是要去摸索的。万一模板用完了，得不偿失。如果在第一或得了PCR产物的时候进行T连，T连成功后测序，如正确，再从质粒中进行PCR，突变的概率远远低于从低拷贝的模板（如cDNA）中进行PCR。无论从时间上还是金钱上使用T载体是合算的。当然如果lz是牛人（从口气中看来好像是的）无论多么难的片段，PCR－酶切－连接－测序一次成功（理论上是可行的）。那T载体确实没有必要。T载体一般都是卖给我们这些菜鸟的，但我们还是要感谢那些卖T载体的公司，因为菜鸟要锻炼才能变成LZ一样的牛人。我不是什么牛人，普通小硕，可能是我运气好，做2次和巢式都没出过错配，更别说什么所有片段都存在错配了。回复补充一点，用的普通天根taq回复一般的克隆，PCR直接连就可以了。但也有的情况使用T载体可能更好，PCR产量低，模板珍贵，二次PCR突变较多等情况，可以使用T载体。毕竟T载体的连接效率相对较高。各个实验室的情况不一样，LZ不能用一流实验室的技术水平来要求所有的实验室。你使用10的九次方的感受态，是个鬼都连的上。对不起大家，我还真的忽略了模板珍贵的问题，我有时候提细胞dna的时候感觉模板少，都舍不得做梯度，如果你的模板真的很少，或二次pcr的结果不让你满意的话，我赞成使用t载体，毕竟谁都不能保证百分比的把握。
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