做abi 荧光定量pcr仪，同样的样品为什么有的...

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2011-09-29 00:08 标签： abi 荧光定量pcr仪
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【讨论】样本放久了是否会影响荧光定量PCR结果
【讨论】样本放久了是否会影响荧光定量PCR结果
来源：丁香园论坛
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jiang104820
请问各位样本在负80度放了一年多，对荧光定量PCR的结果会不会有很大影响啊？
我前几天做了荧光定量PCR，对照组的样本是新收的组织，而实验组的样本是一年前收的，跑出来的结果几乎所有指标都跟表型相反，很郁闷啊！求解答！谢谢
跑PCR看看rna降解没
jiang104820
shylook wrote:
跑PCR看看rna降解没
负80度储存是组织块形式储存的，RNA是我做PCR的时候提的，测浓度的时候并没有提示有降解的迹象，而且浓度较高！
那就可以用用看看呀
jiang104820
shylook wrote:
那就可以用用看看呀
用了啊，跑出来的结果跟表型对不上号啊，所以我想是不是因为组织放久了的原因
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标题: 荧光定量pcr熔解曲线问题——质粒与样品的峰不在一条上
摘要: [荧光定量pcr熔解曲线问题——质粒与样品的峰不在一条上] 如图，检测结果发现样品的条带较宽熔解曲线 关键词:[质粒 条带 熔解曲线 特异性 模板 序列 二聚体]……
如图，检测结果发现样品的条带较宽
熔解曲线回复你扩增质粒上的序列不是你样品的基因吧？回复说明产物不相同。核对一下序列差别和引物特异性。回复
你扩增质粒上的序列不是你样品的基因吧？ 是一样的啊，质粒是用相同的DNA进行pcr之后胶回收在转化链接后培养然后用盒提取的回复
说明产物不相同。核对一下序列差别和引物特异性。 产物检测后都在250bp左右，唯一的不同是质粒的条带很细，样品的条带很宽，这样的话应该是调整样品pcr反映体系让条带变细吧回复
产物检测后都在250bp左右，唯一的不同是质粒的条带很细，样品的条带很宽，这样的话应该是调整样品pcr反映体系让条带变细吧... 跑电泳的分辨率不是很高，即使是一条带也有可能是分子量接近的不同分子的混合物。熔解曲线的温度不仅和产物长度有关，产物的序列也会影响熔解温度，所以更加灵敏。我觉得你的引物的特异性可能有问题。如果是质粒，模板序列单一，所以是一个产物。样品模板成分复杂，可能有多种产物。回复
跑电泳的分辨率不是很高，即使是一条带也有可能是分子量接近的不同分子的混合物。熔解曲线的温度不仅和产物长度有关，产物的序列也会影响熔解温度，所以更加灵敏。我觉得你的引物的特异性可能有问题。如果是质粒， ... 引物的特异性应该是没问题的，是细菌的通用引物338和518，我们实验室的其他人也用的这个，做的还行啊，就到我这里我重新提取的质粒那个峰很窄，我做了别的菌像尖孢镰刀菌和芽孢杆菌的质粒熔解曲线也都很宽，是不是我这个质粒提取的有问题。回复
引物的特异性应该是没问题的，是细菌的通用引物338和518，我们实验室的其他人也用的这个，做的还行啊，就到我这里我重新提取的质粒那个峰很窄，我做了别的菌像尖孢镰刀菌和芽孢杆菌的质粒熔解曲线也都很宽，是不是 ... 熔解峰应该是比较窄的，你提取质粒的那个在我看来是正常的。宽熔解峰说明产物在较大温度范围下熔解，有可能非单一峰。回复样品纯度不够，有杂质（离子？）干扰，影响扩增和产物的溶解曲线
试试纯化样品再实验看:victory:回复
熔解峰应该是比较窄的，你提取质粒的那个在我看来是正常的。宽熔解峰说明产物在较大温度范围下熔解，有可能非单一峰。... 非单一峰不是会出现二聚体或非特异性扩增么，我这个都没有啊，这个是我pcr产物的电泳图片
c - Crop 1.jpg回复
样品纯度不够，有杂质（离子？）干扰，影响扩增和产物的溶解曲线
试试纯化样品再实验看:victory: 纯化样品是指纯化么？回复
纯化样品是指纯化么？... 是的回复
非单一峰不是会出现二聚体或非特异性扩增么，我这个都没有啊，这个是我pcr产物的电泳图片
c - Crop 1.jpg
... 如果仔细看，我觉得在你的亮带下面有一条模糊的暗带。回复
如果仔细看，我觉得在你的亮带下面有一条模糊的暗带。... 那个是有一点模糊的二聚体，但是二聚体应该是出现一个单一峰的，而且和主条带之间有一定距离的，不会和主峰混成一个峰啊回复我感觉是你的模板里面的存在大小不一的片段，也就是模板的特异性不是很好。溶解曲线反应的是模板的特异性，建议你可以试着纯化一下模板，再进行qPCR！回复
那个是有一点模糊的二聚体，但是二聚体应该是出现一个单一峰的，而且和主条带之间有一定距离的，不会和主峰混成一个峰啊... 的确是你说的，引物二聚体的熔解温度通常比较低。确定是否是引物二聚体可以上一个无模板的反应，如果出现扩增，看看其熔解曲线的位置和形状。
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电话：021-请问,荧光定量PCR中的标准品是每个样本都需要有标准品做标准曲线,还是多个样本有一个就行了?比如我有40个要检测的样本,这标准曲线是做一个,还是40个样本的都要做.可能我没表述清楚。比如这40个例子，不是放到一次PCR完成的，可能是5、6次分开来的，不同时间做的。还是只需要一个标准品么？
DFGHHS4255
分几次的话那就得每次都做标准曲线了!只需要做一条就可以了 其实一般做都是半定量的 也就是测几个之间的相对含量 根本不需要做标准曲线
我有样本、内参在同一平板做PCR，标准品准备一份还是2份呢？标准品里要加东西吗？看文献头疼啊！
一个板子上一份就可以了 标准品不还是加模板引物啥的么 只是你要P出来的目的条带的浓度是你确定知道的
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做一个就可以了 要克隆 纯化 标准曲线要做的好
绝对定量，原则上，只要做一次就可以了，但考虑到每次PCR之间有系统误差，实际上每次都要做一个。所以，你分开做的PCR，最好每次都做一个标曲，这样比较准确。
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3秒自动关闭窗口请问：做荧光定量PCR时,△△Ct值是什么意思,它的计算公式是什么?
阿瑟啦1277
△△Ct = △Ct(试验样品) — △Ct(基准样品) △Ct(试验样品) = Ct（试验样品,目的基因） — Ct（试验样品,内参基因） △Ct(基准样品) = Ct（基准样品,目的基因） — Ct（基准样品,内参基因）2 －△△Ct =2 －（－1.2）= 2.30
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