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稳定细胞株构建
慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，因此，慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。
吉凯基因制备的带puromycin抗性的慢病毒，在感染目的细胞后，可通过加入puromycin进行选择性筛选，从而获得稳定表达shRNA或者特定基因的细胞株。
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稳定表达Syncytin的EL4细胞系的建立及鉴定
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3秒自动关闭窗口用慢病毒为工具可否用来构建稳定表达的细胞系(细胞系,稳定表达,慢病毒,转染) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 用慢病毒为工具可否用来构建稳定表达的细胞系(细胞系,稳定表达,慢病毒,转染)
摘要: [用慢病毒为工具可否用来构建稳定表达的细胞系(细胞系,稳定表达,慢病毒,转染)] 看见园子里做稳定转染的大都直接转染带抗性基因的表达质粒，然后用G418筛选，最终获得稳定表达的细胞系。对此，我觉得有以下不足：1 转染效率低。2 整合效率低。所以我觉得如果用慢病毒来做，可能效果更明显，也更容易成功，尤其是对于难以转染的原代细胞和干细胞。但是不知为啥园子里这方面的资料比较少，请各位高手指点，谢谢。 关键词:[转染 细胞系 稳定表达 慢病毒 干细胞 抗性基因 质粒]……
看见里做稳定转染的大都直接转染带抗性基因的表达质粒，然后用G418筛选，最终获得稳定表达的细胞系。对此，我觉得有以下不足：1.转染效率低。2.整合效率低。所以我觉得如果用慢病毒来做，可能效果更明显，也更容易成功，尤其是对于难以转染的原代细胞和干细胞。但是不知为啥里这方面的资料比较少，请各位高手指点，谢谢。
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电话：021-一种稳定分泌表达il-24重组蛋白的细胞株及其构建和应用的制作方法
一种稳定分泌表达il-24重组蛋白的细胞株及其构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于基因工程【技术领域】的一种稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株及其构建和应用。本发明的细胞株构建方法为：首先将IL-24基因的CDS区序列亚克隆至Flp-In定点整合系统的pcDNA5/FRT质粒中，然后和质粒pOG44共转染至Flp-In-CHO细胞中，通过抗生素Hygromycin?B筛选稳定表达的细胞株。然后，利用亲和层析对细胞株培养上清中的重组蛋白进行纯化；最后，通过体内外活性实验证明此重组蛋白具有抑制食管癌细胞和黑色素瘤细胞增殖的作用，并诱导其凋亡，可以开发出有效的治疗肿瘤的新药。
【专利说明】一种稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株及其构建和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于肿瘤生物治疗【技术领域】，具体涉及一种稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株及其构建和应用。
【背景技术】
[0002]美国哥伦比亚大学Fisher PB教授实验室1995年用重组人IFN-β和密执毒素(mezerein,MEZ)处理人黑素瘤细胞(H0-1)后，通过消减杂交鉴别出mda-7/IL_24 (白细胞介素24)。它的分布具有高度局限性，仅分布在免疫系统(如脾、胸腺、外周血白细胞)和特定细胞(如黑色素细胞、痣、早期黑色素瘤细胞、平滑肌细胞、皮肤成纤维细胞、皮肤伤口边缘和基底类成纤维细胞样细胞)，在50多种肿瘤细胞中未检测到IL-24蛋白的表达。
[0003]近十八年的研究表明，IL-24是抗肿瘤的“明星”分子。首先，能够在体内和体外抑制多种癌细胞和肿瘤生长，选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无明显毒副作用，因而认为IL-24是一种新的肿瘤抑制基因。其次，IL-24与其他的肿瘤抑制基因不同，它对肿瘤细胞的生长抑制作用不依赖于肿瘤细胞中P53、p21、Rb和其他肿瘤抑制基因的表达与否，它能特异性地杀死MCF7和HeLa，而p53对这两种细胞无法发挥杀死作用，它是具有广谱抗瘤活性的肿瘤抑制基因。同时，IL-24具有免疫调节能力，它能刺激外周血单核细胞PBMC产生IL-6、TNF β、IFN Y，但对人PBMC无刺激增殖作用。正在用于基因疗法临床试验的ρ53、plO、Rb等抑癌基因，均不具有通过刺激免疫应答来杀伤肿瘤细胞的特性，IL-24很可能是第一个既抑制肿瘤生长又刺激免疫系统的基因。最后，IL-24和其他药物(表皮生长因子受体 EGFR 抑制剂 gefitinib、Her2 的单抗 Trastuzumab/Herceptin、Tamoxifen、Taxotere 和Adriamycin)的联合使用可产生叠加的抗瘤效果,能够提高对二者单独作用都不敏感的肿瘤细胞的药物敏感性，在临床上给这类肿瘤患者带来新的治疗希望。因此，对IL-24基因的研究具有非常重要的理论和临床意义。
[0004]腺病毒作为基因转移工具相对于其他病毒载体更有优势，如腺病毒颗粒比较稳定、操作简单、可感染分裂细胞和非分裂细胞、外源基因表达水平较高。然而，腺病毒的靶向性问题、腺病毒的清除、生物安全性等缺陷限制了它的发展。相比较于腺病毒载体，以基因工程蛋白药物(蛋白和多肽)形式直接给药就更为安全。
[0005]IL-24蛋白独特的生物学活性促使研究人员对它的重组蛋白进行研究，以期能够早日进入临床试验研究。目前已在大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中获得重组的IL-24基因工程蛋白，但在不同宿主细胞中获得的基因工程蛋白的生物学活性具有显著差异。用大肠杆菌和酵母表达的IL-24重组蛋白同样具有免疫调节作用，可以刺激IL-6、TNF-α和INF-GAMMA高水平表达以及GM-CSF低水平表达，但所用剂量很大(单位是μ g/mL)，而在HEK293细胞上清中分泌表达IL-24重组蛋白所用剂量单位是ng/mL ;在用IL-24重组蛋白杀死黑色素瘤细胞的研究中，大肠杆菌表达的重组蛋白在20mmol/L浓度时仍无作用，在HEK293细胞中分泌表达的重组蛋白在15-500pmol/L时就具有显著的作用，可能是因为在细菌和酵母中表达的重组蛋白没有正确折叠或没有翻译后的糖基化修饰，使受体无法识另IJ。同时发现在啮齿类动物细胞和昆虫细胞中分泌表达的IL-24蛋白的糖基化修饰程度很低。这些结果表明，哺乳动物细胞表达体系对保持IL-24重组蛋白的生物学活性至关重要。
[0006]在哺乳动物细胞培养上清中分泌表达的可溶性IL-24蛋白(sIL-24)具有抗肿瘤功能。首先，它能够抑制人内皮细胞(HUVEC和HMVEC)分化，按等摩尔浓度比较，sIL-24蛋白抗血管形成的活性比内皮抑素化]1(108七31:；[11)和血管生成抑制素(31^；[08七31:；[11)高20_50倍，比IL-10高25倍，比IFN- Y高30倍，抑制新HUVEC管形成的活性比IL-10高30倍。其次，sIL-24具有Thl样细胞因子活性。腺病毒INGN241的I期临床试验表明，治疗后可升高⑶3+和⑶8+的细胞数，提示引起系统性Thl细胞因子反应。sIL-24蛋白在人PBMCs中象前Thl细胞因子样发挥作用，诱导产生IFN-Y、IL-6和TNF-α，它的抗肿瘤和细胞因子活性与Thl型细胞因子IL-12和IFN-α相似。最重要的是sIL_24能够特异性地杀死肿瘤细胞，它对黑色素瘤、乳腺癌和胰腺癌细胞具有显著的抑瘤作用。美国Texas大学的Gri_EA实验室在HEK293细胞中过表达IL-24基因，在培养上清中获得具有生物学活性的IL-24重组蛋白，通过偶联单抗的亲和层析柱纯化重组蛋白。尽管IL-24重组蛋白具有明显的抑瘤作用，目前尚无将其应用于临床肿瘤治疗研究的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的 在于提供一种稳定分泌表达IL-24 (人白细胞介素24)重组蛋白的定点整合细胞株，所述细胞株分泌表达的IL-24重组蛋白具有体内外抗肿瘤活性。
[0008]本发明的目的还在于提供IL-24重组蛋白在上述细胞株中表达的方法。
[0009]本发明的目的也在于提供上述细胞株或上述细胞株分泌表达的IL-24重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0010]一种稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株，其中宿主细胞为Flp-1n-CHO细胞，IL-24基因被定点整合到Flp-1n-CHO细胞的基因组中，所述IL-24重组蛋白带有His6标签；所述细胞株能稳定分泌IL-24重组蛋白到细胞的培养上清中。
[0011]上述稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株的构建方法，包括以下步骤:通过PCR扩增获得带有His6标签的IL-24基因片段，将带有His6标签的IL-24基因的⑶S区序列亚克隆至具有Flp-1n定点整合系统的pcDNA5/FRT质粒中；然后将重组质粒pcDNA5/FRT-1L-24与表达Flp重组酶的质粒pOG44共转染至Flp-1n-CHO细胞中，所述Flp-1n-CHO细胞的转录活性区域整合了 Flp重组祀点；然后通过抗生素Hygromycin B筛选稳定表达的细胞株；最后，利用亲和层析对细胞株培养上清中的重组蛋白进行纯化。
[0012]上述稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株分泌表达的IL-24重组蛋白，在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0013]所述肿瘤为食管癌或黑色素瘤。
[0014]本发明中的稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株可以稳定分泌表达IL-24重组蛋白，IL-24重组蛋白带有His6标签，可利用亲和层析进行纯化；通过体内外活性实验表明此重组蛋白具有抑制食管癌细胞和黑色素瘤细胞增殖的作用，纯化的IL-24重组蛋白在l-50ng/mL时对两种肿瘤细胞A375和Eca_109的增殖具有显著的抑制作用，抑制率最高分别为36.21%和34.69% ;在A375和Eca-109细胞中，IL-24重组蛋白浓度在5、10、20和50ng/mL时能显著抑制细胞的克隆形成；并且IL-24重组蛋白诱导两种肿瘤细胞A375和Eca-1O的凋亡，重组IL-24蛋白浓度在1、10和40ng/mL时，A375和Eca-109细胞的凋亡率分别为13%、16.2%,64.5%和24.7%,27.6%,34.5%。体内实验证明:裸鼠成瘤后再注射稳定分泌表达IL-24重组蛋白的工程细胞株FCHO/IL-24同样具有体内抑瘤活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为通过PCR扩增获得的IL-24目的片段。
[0016]图2为双酶切鉴定重组的阳性克隆质粒pcDNA5/FRT-1L-24。
[0017]图3为细胞株FCH0/IL-24裂解液和培养上清中IL-24重组蛋白表达的检测。
[0018]图4为定点整合细胞株FCH0/IL-24和非定点整合细胞株分泌表达人IL-24重组蛋白水平的比较。
[0019]图5为细胞株FCH0/IL-24培养上清中IL-24重组蛋白亲和层析纯化和鉴定。
[0020]图6为用HPLC鉴定纯化IL-24重组蛋白的纯度。
[0021]图7为用MTT方法检测纯化的IL-24重组蛋白对肿瘤细胞增殖的影响。
[0022]图8为IL-24抗体和IL-20受体抗体能够中和IL-24重组蛋白对Eca-109细胞增殖的抑制作用。
[0023]图9为IL-24抗体和IL-20受体抗体能够中和IL-24重组蛋白对A375细胞增殖的抑制作用。
[0024]图10为IL-24重组蛋白对肿瘤细胞克隆形成能力的抑制作用。
[0025]图11为IL-24重组蛋白能够诱导Eca-109细胞和A375细胞的凋亡。
[0026]图12为细胞株FCH0/IL-24和Eca-109细胞共注射裸鼠后能够抑制肿瘤的体内生长。
[0027]图13为细胞株FCH0/IL-24和Eca-109细胞共注射裸鼠后抑制肿瘤体内生长的动物和肿瘤标本。
[0028]图14为裸鼠成瘤后注射细胞株FCH0/IL-24能够抑制肿瘤的体内生长。
[0029]图15为裸鼠成瘤后注射细胞株FCH0/IL-24抑制肿瘤体内生长的动物和肿瘤标本。
【具体实施方式】
[0030]以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
[0031]实施例1
[0032]分泌表达细胞株的建立和鉴定
[0033](I) IL-24重组表达载体的构建:
[0034]根据GenBank中收录的人IL-24基因序列(g1: 1141750)设计引物，用于扩增其⑶S区序列，引物的序列如下:上游引物为5’ cccaagcttaatgaattttcaacagagg3’，下游引物为 5，ggggtaccttaatgatgatgatgatgatgagaaccgcgtggcaccaggtacccgttgagcttgtagaatttctg3’。分别在上下游引物引入Hind III和KpnI核酸限制性酶切位点，并在下游引物的5’端引A His6_tag 序列 atgatgatgatgatgatg 和蛋白酶 Thrombin 酶切位点 ctggtgccacgcgttct。PCR体系如下:5 XprimeSTAR BufferlOul, dNTP4ul，10 μ M的上下游引物各I μ 1，模板为IL-24重组表达载体pcDNA3-1L-24，构建方法见[马群风，江红，刘锟，朱捷，郑晓飞。黑素瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24抑制肺癌细胞增殖；医学研究生学报，):779-783] I μ I, primeSTARl μ I (TaKaRa 生物技术公司)补水至 50ul。PCR 条件为:94°C预变性594°C变性25s、60°C退火25s、72°C延伸30s，进行35个循环；最后72°C延伸5min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增得到稍大于500bp的条带(如图1所示),与理论大小618bp相符。在琼脂糖凝胶电泳中切下目的片段，将目的片段回收、与pGMT载体(北京天根生化科技有限公司试剂盒)连接、转化、挑克隆、摇菌、提质粒(北京天根生化科技有限公司试剂盒)，双酶切(内切酶Hind III和KpnI购自TaKaRa生物技术公司)鉴定阳性的克隆经北京博迈德公司测序证实为IL-24的cDNA。将目的片段从测序正确的重组pGMT_IL_24质粒中切下，连入同样双酶切的Flp-1n系统(Invitrogen公司)的质粒pcDNA5/FRT中，酶切后的阳性克隆命名为PCDNA5/FRT-1L-24，见图2，经北京博迈德公司测序证实所插入IL-24的cDNA序列和上下游引物序列均正确。
[0035](2)稳定表达细胞株的建立和鉴定
[0036]Flp-1n-CHO细胞培养在10%FBS，1%青霉素和链霉素(质量百分比浓度)和Zeocin(终浓度为300 μ g/mL)的F12培养基中，待细胞密度达到60%_70%左右时，按照说明书用Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)将重组质粒 pcDNA5/FRT_IL_24 和 pOG44 以 1:9 的比例共转染至Flp-1n-CHO细胞中；同时以共转染pcDNA?5/FRT和pOG44的细胞作为对照组。转染后48h,将细胞传代,加入Hygromacine B (终浓度为500 μ g/mL),每三天换一次培养基，持续两周左右直到肉眼能观察到细胞克隆的形成，将细胞扩大培养，细胞传代和冻存,Hygromacine B浓度调整为100 μ g/mL。将通过Hygromacine B筛选的细胞株分别命名为 Flp-1n-CH0-1L-24 细胞(FCH0/IL-24)和 Flp-1n CHO-mock 细胞(mock)。
[0037](3)细胞株的鉴定:用Western blot方法检测细胞裂解液和培养上清IL-24重组蛋白的表达情况
[0038]用裂解液RIPA (10mmol/L Tris-HCl, ρΗ7.5，150mmol/L NaCl，1%ΝΡ_40，0.5% 去氧胆酸钠，蛋白酶抑制剂)收集转染48h的细胞裂解液，用Bradford方法作蛋白定量后，加入4X上样缓冲液，每个样本上样20 μ g总蛋白，进行12% SDS-PAGE ;200mA恒流转膜40min (0.2μΜ硝酸纤维素膜)；用封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)室温振荡封闭I用封闭液稀释不同的一抗(美国R&D公司的IL-24抗体ΜΑΒ1965，北京博尔迈公司的His抗体和内参HPRTl抗体的稀释度分别为1:400,1:0)，4度过夜，TBST洗膜;加入封闭液1: 2000稀释的HRP标记的二抗，室温振荡反应I洗膜后用ECL显色(Thermo公司)检测目的蛋白。如图3显示，在FCH0/IL-24细胞株的裂解液和上清中均有目的蛋白——His6-1L-24重组蛋白的表达，转染空载体的细胞株(mock)和未转染的细胞(con)在相应的位置没有目的条带；并且，重组目的蛋白可被IL-24抗体和His抗体所识别。
[0039]实施例2
[0040]IL-24重组蛋白的纯化和鉴定
[0041](I)定点整合细胞株FCH0/IL-24和非定点整合细胞株分泌表达IL-24重组蛋白水平的比较
[0042]为了对比分析IL-24的cDNA定点整合或非定点整合在工程细胞株基因组对IL-24重组蛋白分泌表达水平的影响，我们将都能够稳定分泌表达IL-24重组蛋白的一个定点整合工程细胞株(FCH0/IL-24)和三种非定点整合细胞株(HEK293/pSecTag2A-1L-24，HEK293/pcDNA3.lmyc/His-1L-24 和 HEK293/pCEP4_IL_24)按照 1.5 X IO6 细胞的数量接种于IOcm的培养皿中，加入15mL的培养液，分别于传代的第1、2、3、4天收集0.3mL上清，用ELISA试剂盒检测IL-24重组蛋白的表达水平。用SPSS软件对数据进行双侧独立样本t分布检验的统计学比较分析，P* & 0.05为差异显著，P** & 0.01为差异极其显著。如图4所示，在所检测的样品中，细胞株FCHO/IL-24与细胞株HEK293/pSecTag2A-1L-24和HEK293/pcDNA3.lmyc/His-1L-24相比，分泌表达IL-24重组蛋白的水平差异极其显著(P** &0.01)；同时，细胞株FCHO/IL-24的表达水平最高，在第1-4天分别为1.7,5.7、7.4和8.0ng/mL，均高于HEK293/pCEP4-1L-24的1.4,4.0,6.1和7.1ng/mL，两种细胞株第2天的表达水平相比有明显差异(P* & 0.05)。由此，定点整合细胞株FCHO/IL-24分泌表达IL-24重组蛋白水平显著高于三种非定点整合细胞株。
[0043](2) Ni2+-亲和层析纯化IL-24重组蛋白
[0044]收集细胞传代培养第四天的上清，将上清于4 °C 12000rpm离心IOmin后，用0.22 μ m滤膜过滤，置于冰上待用；将上清上样于用结合缓冲液(20mmol/L磷酸二氢钠，0.5mol/L NaCl, 20mmol/L咪唑，pH7.4)平衡过的亲和胶柱，加入结合缓冲液洗去杂蛋白，用洗脱(20mmol/L磷酸二氢钠，0.5mol/L NaCl, 250mmol/L咪唑，pH7.4)洗脱目的蛋白，用检测280nm吸收值和考马斯亮蓝检测G250染色监测目的蛋白洗脱情况。以洗脱体积为横坐标，280nm处的OD值为纵坐标绘制蛋白纯化曲线，同时通过Western blot对所有流出液进行鉴定。实验结果如图5所示,在杂蛋白洗脱峰后,有一个目的蛋白洗脱峰,Western blot在洗脱体积为第56、57、58、59、60、61mL时可检测到IL-24重组蛋白，与纯化曲线和G250染色结果一致，提示细胞上清中带His标签的IL-24重组蛋白被成功纯化。
[0045](3)纯化蛋白纯度的鉴定:
[0046]为了获得高浓度的蛋白，我们将亲和纯化的蛋白合并，用三个15mL超滤管于4°C离心对90mL纯化的重组蛋白进行浓缩、除去咪唑，置换到PBS缓冲液中，并在浓缩后用HPLC分析纯度，用ELISA方法进行定量分析。结果显示，纯化样品的体积被浓缩36倍，而蛋白浓度被浓缩提高近28倍，浓缩后的IL-24重组蛋白浓度为500ng/mL，远远高于未浓缩前的IL-24重组蛋白浓度，样品中总蛋白回收率达到80%以上。HPCL结果表明纯化蛋白的纯度为94.23%，见图6。
[0047]实施例3
[0048]重组蛋白体内外抗肿瘤活性检测
[0049](I) IL-24重组蛋白抑制肿瘤细胞体外增殖能力的检测
[0050]细胞经IL-24重组蛋白处理后的存活率用MTT法检测[Cancer Research, ):]，具体步骤如下:将黑色素瘤A375细胞、食管癌Eca-109细胞、肺癌A549细胞和正常人胚肺成纤维细胞HEL以2500细胞/孔的量铺入96孔板，培养24细胞小时后分别加入不同浓度的IL-24重组蛋白(终浓度分别为0、1、5、10、20和50ng/mL)，作用4天后，每孔加入20 μ I的MTT(5mg/mL)，37°C培养4小时后，吸去液体，加入150 μ I的DMSO溶解沉淀，测定492nm处吸光度。所有的实验重复三次，结果表示为平均值土SE。细胞存活率=处理样品/未处理样品。用SPSS软件对数据进行双侧t分布检验的统计学比较分析，P* & 0.05为差异显著，P** & 0.01为差异极其显著。结果表明:纯化的IL-24重组蛋白在l-50ng/mL时对两种肿瘤细胞A375和Eca_109的增殖具有显著的抑制作用(P* & 0.05, p**&0.01)，并呈现剂量依赖效应，抑制率最高分别为36.21%和34.69% ;而IL-24重组蛋白在浓度为50ng/mL时对只表达IL-20R2的肺癌细胞A549和表达三种IL-20R的人胚肺成纤维细胞HEL的体外增殖活力仍无影响，见图7。
[0051]同时，为了进一步确定Eca-109细胞和A375细胞增殖受到抑制是IL-24重组蛋白的作用，分别将终浓度为200ng/mL的商品化IL-24抗体(免疫原为IL-24全长的重组蛋白多抗AF1965和单抗MAB1965，美国R&D公司产品)或IL-20受体的抗体(三种类型亚基IL-20R1、IL20-R2和IL-22R1，美国R&D公司产品)与IL-24重组蛋白(终浓度为20ng/mL)一起加到A375或Eca-109细胞培养液中。MTT结果显示，加入IL-24或IL-20受体的抗体后，IL-24重组蛋白对Eca-109细胞(见图8)和A375细胞增殖的抑制作用被明显中和(见图9) (p* & 0.05,P** & 0.01)。提示:IL-24重组蛋白能够特异性抑制IL-20R表达阳性肿瘤细胞的体外增殖能力，并且这种抑制作用可被IL-24的抗体和IL-20受体的抗体所中和。
[0052](2) IL-24重组蛋白抑制肿瘤细胞体外克隆形成能力
[0053]将对数生长期的Eca-109、A375、A549和HEL消化后计数，以200细胞/皿接种于IOcm细胞培养皿中，向培养皿中加入IL-24重组蛋白使其终浓度分别为0、5、10、20和50ng/mL，每个浓度组设三个复皿，置于37°C，5%C02细胞培养箱中培养，直到通过肉眼能清晰观察到细胞克隆时(大约15天)，用吉姆萨染色细胞克隆，计数每皿中的克隆数，计算不同处理浓度的克隆形成率(每一浓度的克隆平均数/所铺细胞数)和克隆形成率的比值(处理组克隆形成率/对照组克隆形成率)。研究结果显示，在A375细胞中，IL-24重组蛋白浓度在5、10、20和50ng/mL时能显著抑制A375细胞的克隆形成，与未处理组比较都具有极显著性差异(P#〈0.01);同样处理条件下，IL-24重组蛋白也能特异性地抑制Eca-109细胞的克隆形成，与未处理组比较均具有统计学差异(P#〈0.01)，随着IL-24重组蛋白浓度的逐渐增加，Eca-109细胞的克隆形成率逐渐降低并呈现剂量依赖效应。相反，在IL-20受体阴性细胞A549和正常细胞HEL中未发现IL-24重组蛋白能抑制它们的克隆形成，见图10。这一结果与MTT实验结果相一致，MTT和克隆形成实验结果提示IL-24重组蛋白在体外通过其受体途径抑制细胞增殖，而且对正常的细胞无毒副作用。
[0054](3) IL-24重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡能力的检测
[0055]用Annexin V-FITC染色(KGA107，南京凯基生物技术有限公司)和流式细胞仪分析检测IL-24重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的能力。将对数生长期的细胞(A375和Eca-109)计数后以4.5X IO4细胞/孔接种于6孔板中；24h后加入IL-24重组蛋白使其终浓度分别为O、1、10和40ng/mL，置于37°C，5%C02细胞培养箱中培养4天；消化收集细胞，用PBS离心洗两次；加200 μ I的binding buffer重悬细胞混匀，再加入5 μ I的AnnixV-FITC和5 μ I的ΡΙ，混匀，室温避光反应15min,补加300 μ I的binding buffer,混匀，Ih内用流式细胞仪检测。结果如图11所示，重组IL-24蛋白浓度在UlO和40ng/mL时，A375和Eca-109细胞的凋亡率分别为13%、16.2%,64.5%和24.7%,27.6%,34.5%，流式细胞术结果表明，通过重组分泌表达的IL-24蛋白能抑制A375和Eca细胞的凋亡，而且当蛋白浓度为40ng/mL时A375细胞的凋亡率达到65.5%，远远高于其他文献报道的IL-24诱导细胞凋亡的凋亡率。
[0056](4) IL-24重组蛋白体内抑制肿瘤细胞增殖能力的检测[0057]通过向裸鼠背部注射食管癌细胞和稳定分泌表达IL-24重组蛋白的FCH0/IL-24细胞株检测IL-24重组蛋白的体内抑瘤活性[Cancer Res.): 5105-13]。首先，将Eca-109细胞和FCH0/IL-24细胞混合后，立即注入BALB/c裸鼠背部右后侧皮下，每只小鼠注入Eca-109细胞5 X IO6和FCHO细胞2 X IO6或FCH0/IL-24细胞2 X 106，每组10只Balbc裸鼠。每三天观察一次，并测量瘤体的长(mm)和宽(mm)，第30天时处死动物，分离瘤体，按照公式“长X宽2/2”计算肿瘤体积(mm3)。结果表明:实验组(混合注射Eca-109和FCH0/IL-24)动物的肿瘤生长被抑制，从注射细胞混合物的第15天起到杀死动物的第30天，实验组与对照组(混合注射Eca-109和FCH0)动物肿瘤体积相比，均具有统计学意义的显著差异(P* &0.05)，见图12和图13。之后，先在20只Balbc裸鼠背部右后侧皮下分别注射5 X IO6的Eca-109细胞，待瘤体长到50-100mm3后，将动物按照瘤体大小平均分为两组，分别注射FCH0/IL-24细胞2 X IO6 (实验组)和FCHO细胞2 X IO6 (对照组)。将100 μ I的2XF12完全培养基(含20%的胎牛血清)和100 μ I的Matrigel在冰上混合均匀，用混合液重悬2Χ IO6细胞后立即注射，同时将这一天定为第O天。每三天观察动物和测量瘤体大小，在第30天后，处死动物，分离瘤体。图14和图15显示，裸鼠成瘤后再注射稳定分泌表达IL-24重组蛋白的工程细胞株FCH0/IL-24同样具有体内抑瘤活性，并且实验组动物的肿瘤体积与对照组相比差异`显著(P* & 0.05)，具有统计学意义。
【权利要求】
1.一种稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株，其中宿主细胞为Flp-1n-CHO细胞，IL-24基因被定点整合到Flp-1n-CHO细胞的基因组中，所述IL-24重组蛋白带有His6标签；所述细胞株能稳定分泌IL-24重组蛋白到细胞的培养上清中。
2.权利要求1所述稳定分泌表达IL-24重组蛋白的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:通过PCR扩增获得带有His6标签的IL-24基因片段，将带有His6标签的IL-24基因的⑶S区序列亚克隆至具有Flp-1n定点整合系统的pcDNA5/FRT质粒中；然后将重组质粒pcDNA5/FRT-1L-24与表达Flp重组酶的质粒pOG44共转染至Flp-1n-CHO细胞中，所述Flp-1n-CHO细胞的转录活性区域整合了 Flp重组祀点；然后通过抗生素Hygromycin B筛选稳定表达的细胞株；最后，利用亲和层析对细胞株培养上清中的重组蛋白进行纯化。
3.权利要求1所述的细胞株在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述用途，其特征在于，所述肿瘤为食管癌或黑色素瘤。
5.权利要求1所述的细胞株分泌表达的IL-24重组蛋白。
6.权利要求5所述的IL-24重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述·用途，其特征在于，所述肿瘤为食管癌或黑色素瘤。
【文档编号】A61P35/00GKSQ
【公开日】日
申请日期:日
优先权日:日
【发明者】马群风, 江红, 郑晓飞, 金邦明, 张耀, 史亦南, 曹宇, 宋何煜, 张驰, 邓学峰, 王字玲
申请人:中国人民解放军军事医学科学院附属医院, 北京交通大学